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Biology

In Vitro Páncreas Organogenesis de dispersos embrionarios de ratón Progenitores

doi: 10.3791/51725 Published: July 19, 2014
* These authors contributed equally

Summary

El método de cultivo en tres dimensiones se describe en este protocolo recapitula el desarrollo del páncreas a partir de progenitores páncreas de ratón embrionarias dispersas, incluyendo su expansión sustancial, diferenciación y morfogénesis en un órgano ramificada. Este método es susceptible de formación de imágenes, la interferencia funcional y la manipulación del nicho.

Introduction

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Cultivo de órganos constituye un modelo útil que llena los huecos existentes entre la complejidad y relevancia en las investigaciones in vivo y la simulación conveniente pero aproximada de modelos de línea celular. En el caso del páncreas, no hay una línea de células perfectamente equivalente a progenitores páncreas aunque no se transforman líneas celulares que simulan células endocrinas y exocrinas. Todo el páncreas adulto no puede ser cultivado; aislados islotes endocrinos pueden mantenerse durante semanas sin la proliferación celular y rodajas de tejido se pueden mantener in vitro para algunas horas 5. Cultura páncreas embrionario ha sido ampliamente utilizado no sólo para estudiar su desarrollo, sino también para investigar las interacciones epitelio-mesenquimal 4,6,7, a la imagen procesa 8 o interferir químicamente con ellos 9. Dos métodos de cultivo de órganos se utilizan principalmente: la primera consiste en el cultivo de brotes pancreáticos en placas de fibronectina recubierto 2, que es conveniente para los propósitos de formación de imágenes; la segunda opción es la cultura de los órganos en los filtros en la interfase aire-líquido 3,4 que mejor conserva la morfogénesis. Aunque muy útil, estos métodos conducen a un cierto grado de aplanamiento; la expansión de progenitores es muy limitado en comparación con el desarrollo normal y la población de partida es complejo que comprende todos los tipos de células pancreáticas y células mesenquimales.

La capacidad de la cultura y expandir las células primarias dispersas es valiosa para estudiar las relaciones de linaje y descubrir las propiedades intrínsecas de los tipos de células aisladas 10. Sugiyama et al 11. Podría mantener progenitores pancreáticos y células progenitoras endocrinas que conservaron algunos caracteres funcionales durante 3-5 días en cultivo en capas alimentadoras. Pancreatospheres, similar a neuroesferas 12 y mammospheres 13, se han ampliado de islotes adultos y células ductales aunque la naturaleza de los progenitores / células madreque generan estas esferas no está claro. Además, en contraste con el desarrollo fisiológico, los pancreatospheres contenían algunas neuronas 14,15. Esferas también se produjeron recientemente a partir de progenitores páncreas embrionario 16,17 y regenerar los páncreas de 18 años con una buena expansión de progenitores y posterior diferenciación pero no lograron recapitular la morfogénesis.

Modelos 3D a partir de células dispersas y, a menudo definidos que se auto-organizan en órganos miniaturizados han florecido recientemente y simular el desarrollo o un adulto facturación de múltiples órganos, como el intestino 19,20, el estómago 21, el hígado 22, la próstata 23 y la tráquea 24. En algunos casos, la morfogénesis y la diferenciación del desarrollo se han recapitulado en 3D a partir de células ES, como es el caso de tazas 25, el intestino 26 o cerebrales 27 óptica.

En este sentido, describir un método para expandir progenitores pancreáticos multipotentes disociadas en un andamio 3D Matrigel donde pueden diferenciarse y auto-organizarse.

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Protocol

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Este protocolo tiene como objetivo crecer organoides pancreáticas derivadas de E10.5 murino disociaron células epiteliales pancreáticas.

El protocolo requiere la aprobación ética para la experimentación animal.

1. Disección de dorsal de páncreas Bud de E10.5 embriones de ratón

  1. Medio esencial Sacrificar los ratones oportuna embarazadas en el día embrionario (E) 10,5, abrir el abdomen con un par de tijeras, retire los dos cuernos uterinos y colocarlos en un plato de Petri de 10 cm llena con tampón fosfato frío salino (PBS) o modificado por Dulbecco (DMEM) se mantuvo en hielo. El experimento total desde el sacrificio a la siembra de células se realiza en 60-90 minutos para prevenir el daño celular.
  2. Separe el útero en segmentos de embriones individuales utilizando unas tijeras pequeñas. Transferir un embrión a una placa de 35 mm de Petri con PBS frío y visualizar bajo un microscopio de disección con iluminación desde arriba. Con fórceps de disección eliminar el músculo, la decidua y la yema que rodea saC y exponer el embrión. Coloque el embrión de nuevo en medio DMEM frío. Los embriones se pueden transferir fácilmente utilizando un 3 ml de transferencia de plástico pipeta / gotero. Aislar cada embrión individual en una manera similar antes de continuar.
  3. Coloque un embrión en una limpia de 35 mm placa de Petri en PBS.
    1. Use unas pinzas finas (0,05 mm de ancho) para quitar la extremidad anterior. Inserte con cuidado la pinza en la apertura para separar el tracto digestivo, desde la región de la médula espinal (Figura 1). OPCIONAL: Para ver más cómodamente el estómago, retire la parte superior del cuerpo del embrión, hasta el corazón y la región de la cola por debajo del saco vitelino.
    2. Localizar el estómago, el hígado y el intestino. El uso de los fórceps, aislar el tracto gastrointestinal desde el estómago hasta el intestino y colocarlo en DMEM frío en hielo (Figura 1). El brote pancreático dorsal está unido dorsalmente, posterior al estómago (Figura 1).
    3. Aislar cada tracto gastrointestinal individuo en una simimanera lar antes de continuar. Si los embriones deben ser genotipo, recoger la cola en el momento de la disección y mantener a cada tracto gastrointestinal individual en un pozo diferente en una placa de 24 pocillos con DMEM frío en hielo.
  4. Coloque un tracto gastrointestinal de una manera limpia de 35 mm placa de Petri en PBS frío. Ahora utilizar la iluminación desde abajo en campo claro de visualizar y diseccionar el brote pancreático dorsal bajo el microscopio de disección. Estas condiciones optimizar la visualización de volúmenes. El uso de agujas de tungsteno afiladas electrolíticamente-o 20 G agujas de jeringa, aislar el brote pancreático con tan poco como sea posible mesénquima alrededor del epitelio (Figura 1).
    1. Transferir el brote aislado en una placa de Petri que contiene una solución de dispasa frío (1,25 mg / ml) durante 2-3 min. Desde este punto, la transferencia más convenientemente se puede hacer con 50 l capilares de vidrio de llama-tirado conectados a un tubo flexible boca-controlada. Alternativamente, pero con más risk de perder el brote, utilice una pipeta automática 10 l (Pipetman) con puntas de plástico adecuados.
    2. Realizar la aspiración brote pancreático y de eyección bajo control microscópico. Ponga el brote pancreático de nuevo en PBS. Además limpiar el brote pancreático aislado a partir del mesénquima con las agujas y aspiración suave utilizando el capilar de vidrio (Figura 1).
    3. Cuando se extirpa todo el mesénquima, enjuague el brote pancreático en PBS frío; transferir cada brote a DMEM frío en pozos individuales (60 pocillos mini-bandejas llenas de 10 l de DMEM frío). Es importante no eliminar el mesénquima en dispasa, lo que hace que el tejido muy pegajosa.

2. Plating y Cultura de células dispersas

  1. Transferir el epitelio disecados de todos los embriones con un capilar de vidrio de la llama-tirado en pozos cónicos de 60 pocillos mini-bandejas llenas de 10 l de PBS para el enjuague.
    1. Transferir el brote en 10 l de tripsina al 0,05% de unnd déjelo incubado a 37 ° C durante 4 min. Inactivar la tripsina mediante la transferencia de la yema en un pozo con 10 l de DMEM + 10% de suero de ternera fetal (FCS).
    2. Disociar la suspensión celular por aspiración a través de un capilar fino desmenuzado con un extractor de pipeta. Es importante evitar las burbujas en esta etapa mientras pipeteando arriba y abajo para disociar las células. Organoides Páncreas óptimamente empiezan desde pequeños grupos de 5 a 15 células y, por tanto, la disociación parcial se recomienda (Figura 1).
  2. Reunir las células de varios embriones en un tubo Eppendorf con el fin de minimizar las diferencias debido a procesamiento individual. Diluir la suspensión de células en Matrigel frío en una proporción 01:03. Alícuota de esta mezcla a una placa de 96 pocillos, 8 l / pocillo o en una placa optimizado para la imagen (ver más abajo).
  3. Incubar la placa a 37 ° C durante 5 minutos, permitiendo que el Matrigel se espese. Llenar los pocillos con 70 l de medio de elección (organoide o esfera, véase Tables 1 y 2) y dejar en un ambiente humidificado contiene 5% de CO2 y 95% de aire a 37 ° C.
  4. Sustituya el medio cada 4 º día. Monitorear las colonias pancreáticas crecimiento diario y documentar el proceso de obtención de imágenes.
  5. Las moléculas pequeñas o proteínas de interés se pueden añadir al medio en esta etapa para experimentos de interferencia, como se informó anteriormente 28.

Tabla 1: media organoide.

Nombre de los Materiales Stock Concentración Concentración en medio final Volumen de existencias
Penicilina-estreptomicina 100% 1% 50 l
Reemplazo Serum golpe de gracia (suplemento) 100% 10% 500 l
2-mercaptoetanol 14,3 M 0,1 mM 1 l
Miristato acetato de forbol (PMA) 16 M 16 nM 5 l
Y-27632 (inhibidor de ROCK) 50 mM 10 M 1 l
EGF 50 g / ml 25 ng / ml 2.5 l
Recombinante Humana R-1 Spondin 250 g / ml 500 ng / ml 10 l
- O -
Recombinante ratón R-1 Spondin 250 g / ml 500 ng / ml 10 l
FGF1 humano recombinante (FCFa) 100 g / ml 25 g / ml 1,25 l
Heparina (Liquemin) 2500 U / ml 2,5 U / ml 2 l
RecomFGF10 humana recombinante 100 g / ml 100 ng / ml 5 l
DMEM/F-12 4,412.25 l
Total 5000 l

Tabla 2: mediano Esfera.

Nombre de los Materiales Stock Concentración Concentración en medio final Volumen de existencias
Penicilina-estreptomicina 100% 1% 50 l
X50 B27 (suplemento) 100% 10% 100 l
FGF2 humano recombinante (bFGF) 100 g / ml 64 ng / ml 3.2 l
Y-27632 (inhibidor de ROCK) 50 mM 10 M 1 l
DMEM/F-12 4845.8 l
Total 5000 l

3. Imagen de la progresión de Desarrollo organoide

  1. Organoides imagen ya sea diaria o por microscopía lapso de tiempo utilizando un microscopio de time-lapse fluorescente. Para imágenes de lapso de tiempo, utilice un gráfico XY (Z) microscopio de fluorescencia invertido automatizado.
  2. Depósito de pequeñas gotas de 3 l en placas de 4 pocillos o placas con fondo de cristal llenos de medio de 2-5 ml. Imagen con un objetivo de larga distancia 10 veces. Nota: Los ratones transgénicos que expresan los marcadores fluorescentes se pueden utilizar. Película 1 muestra, por ejemplo, la expansión inicial de organoides de Pdx1-Ngn3-ER TM-IRES-nGFP + ratones 4. La GFP nuclear permite al usuario realizar un seguimiento de las células como objetos individuales, sino principios similares pueden ser aplicados a un seguimiento de las células con fluorescencia de membrana talescomo mT / MG ratones 29.
  3. Comience time-lapse de imágenes de 3 horas después de la siembra de las células para evitar derivas de enfoque y ajustar el software de automatización de control para tomar 1 imagen / hr durante 3 o más días en las posiciones definidas manualmente. Para cada posición, adquirir una imagen de contraste de interferencia diferencial (DIC), así como la señal de GFP, la presentación de informes de expresión de marcador fluorescente.

4. Recuperación de Organoides para histología

  1. Coloque la placa de 96 pocillos en hielo y se elimina el medio, reemplazándolo con PBS enfriado con hielo. Esta despolimeriza parcialmente Matrigel.
  2. Se aspira suavemente cada organoide individuo, la eliminación de la Matrigel circundante usando una punta de 1,000 l con el fin de no perturbar la arquitectura general. Transfiera cada organoide a un pozo con hielo frío PBS. Guarde la placa de hielo. La fijación directa en Matrigel también es posible.
  3. Fijar el organoide durante 15 minutos en 4% paraformaldehido (PFA), criopreservar en sacarosa e incrustarlo en gelatina. Procesar cada unoorganoide para cryosectioning y la histología como se describe anteriormente (Johansson et al., 2007) 4.

5. Recuperación de Organoides para la PCR y Bioquímica

  1. Coloque la placa de 96 pozos en el hielo y quitar del medio. Añadir 60 l de RNAlater por pocillo con el fin de estabilizar y proteger el ARN celular.
  2. Interrumpir el gel en cada pocillo mecánicamente por parcialmente despolimerización en hielo. Cualquiera de recuperar organoides individuales usando una punta de 1,000 l con el fin de no perturbar la arquitectura general o recuperar todo el pozo (con Matrigel) mediante la interrupción de la gel de forma mecánica con una punta de 200 l. Utilice una punta de 1.000 l para transferir el contenido bien en un libre no pegajoso tubo Eppendorf RNAsa mantener en hielo.
  3. Lave los pocillos con 60 l RNAlater y añada el contenido restante en el mismo tubo de Eppendorf.
  4. Haga girar los tubos durante 5 minutos a 500-1.000 xga 4 º C.
  5. Eliminar el sobrenadante, dejando sólo 20 a 30 lde RNAlater en el tubo junto con el sedimento. Para la bioquímica, almacenar las muestras lo más seco posible.
  6. No congelar las muestras en RNAlater inmediatamente; se almacenan a 4 ° CO / N (para permitir RNAlater penetre a fondo el tejido). El tejido puede almacenarse a -20 ° C para almacenamiento a largo plazo y más tarde se puede procesar para la interrupción del tejido y la extracción de pequeñas cantidades de ARN.

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Representative Results

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Progenitores pancreáticos dorsal E10.5 disociados y sembradas en 3D Matrigel recapitular el desarrollo del páncreas. Progenitores pueden ser más fácilmente seguidos con reporteros fluorescentes. En nuestro caso hemos utilizado un ratón transgénico que expresa una proteína GFP nuclear controlada por el promotor Pdx1 (Pdx1-Ngn3-ER TM-nGFP) (Película 1) en ausencia de tamoxifeno y por lo tanto sin necesidad de activar NEUROG3 4 (Figura 2).

Con el medio organoide, una compactación inicial de pequeños grupos de células se produce en las primeras horas. La expansión puede ser detectada entonces por la ampliación de los grupos en los primeros 4 días (Figura 2A). A partir del día 5, las ramas se forman en los 20% organoides mayores. Las células individuales no se expanden y pierden la expresión Pdx1 mientras que los grandes grupos conservan la expresión Pdx1 28.

En estas condiciones, los progenitores se someten a una especificaciónmorfogénesis tacular con la aparición de las estructuras epiteliales ramificados. Este proceso se lleva a cabo sólo cuando los progenitores se siembran en ≥ 4 células-grupos, lo que indica una fuerte necesidad de señales de la comunidad. El análisis histológico revela que después de 7 días de la cultura, los mini-órganos resultantes se componen de células progenitoras pancreáticas (SOX9 + / HNF1B + / + células Pdx1: Figura 3B) y las células diferenciadas que expresan bien exocrina (Amilasa +) o endocrino (Insulin + o El glucagón +) marcadores (Figura 3A, C). La diferenciación en células endocrinas es menor que en el páncreas endógeno (alrededor de 0,1%) pero se aumenta a 1% cuando FGF1 no se añade al medio de cultivo 28. Cabe destacar que no sólo los progenitores sin semillas se diferencian en los linajes pancreáticos esperados, pero también adoptan espontáneamente la arquitectura normal de páncreas. Aunque E10.5 progenitores multipotentes páncreas no están polarizados, las células en cultivo se polarizan como se demuestra por la segregación de Mucin1 y aPKC en la membrana hacia la luz central y se organizan en una red tubular ramificado. Dominios regionalizados "punta y el tronco" emergen: HNF1B + progenitores y células endocrinas se localizan en la región central, mientras que las células acinares se encuentran en la periferia como una corona parcial o completa de las células. Los organoides se pueden mantener en cultivo durante 10 días; después de este período, por lo general pierden su organización arquitectónica y se convierten quística (no se muestra). El pase se puede hacer después de la disociación parcial pero rápidamente conduce a la formación de quistes, un fenómeno que se reduce por la adición del inhibidor de BMP Noggin 28.

Con el medio de esfera, la expansión es más frecuente y es visto desde 2% de las células individuales; sin embargo, la eficiencia de formación de esferas se correlaciona con el tamaño de la simiented agrupaciones 28. En el día 2/3, se detecta un lumen en los pequeños grupos y se expande a partir de entonces, dando lugar a gran parte esferas huecas mono-capas con áreas locales de varias capas ocasionales (Figura 2B). Estas esferas se derrumban cuando se recuperaron del Matrigel (Figura 3D-H). En estas condiciones, las estructuras resultantes se componen principalmente de progenitores pancreáticos, con un pequeño porcentaje de las células exocrinas y endocrinas diferenciados en el día 7 (Figura 3D-H). Progenitores en las esferas también se convierten en apicalmente polarizado, como se demuestra por la segregación de aPKC en la membrana hacia el lumen central de todas las células (Figura 3F). Pancreatospheres pueden ser pasados ​​al menos dos veces (no mostrado).

Figura 1
Figura 1. Representación esquemática de EL PROCEDIMIENTOe. El tracto gastro-intestinal se diseccionó inicialmente desde el embrión y, posteriormente, el brote pancreático dorsal está aislado. El mesénquima se elimina y las células progenitoras pancreáticas se disocian usando tripsina. Las células parcialmente dispersos resultantes se sembraron a baja densidad en el factor de crecimiento agotado de Matrigel. Escala bares:. 1.00 mm, excepto para la imagen organoide resultando en que la barra de escala es de 200 m Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 2
Figura 2. Progreso de la cultura a través del tiempo. (A) Un pequeño grupo de células progenitoras pancreáticas cultivadas con el medio organoide y seguido con time-lapse microscopía de 3 horas después de la siembra, durante 60 horas. En la bopaneles ttom, un organoide después de 7 días de cultivo. Barra de escala: 200 m; se aplica a todos los paneles en A. (B) Ejemplo de una esfera seguido en un 60 hr time-lapse y capturado en el día 7 de la cultura. Barra de escala: 200 m; se aplica a todos los paneles en B. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 3
Figura 3. Histología. (AC) Las secciones seriadas de un 7-día organoide tiñeron durante progenitor (B - HNF1B) y diferenciación (A - amilasa, C - insulina) marcadores. El organoide se compone de epitelio (A - E-cadherina) y apical polarizada (B - mucin1) células. La línea discontinua corresponde a la región central no acinares (A), dondeSe detectan células HNF1B (B) y endocrino (c) (DH) Secciones de esferas 7-día teñidas para la progenitora. (G - H - HNF1B; SOX9) y endocrinos (D - insulina y glucagón) marcadores. Las esferas se componen de apicalmente polarizado (D, F - aPKC) - células (E-cadherina E) epitelial. Barra de escala:. 50 m Por favor haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

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Discussion

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La producción a gran escala de células beta funcionales in vitro sigue siendo ineficaz 1. En este contexto desafiante, estudios de biología del desarrollo pueden ayudar a descifrar las señales exactas que se requieren para la diferenciación de las células beta funcionales. Este protocolo permite el mantenimiento, expansión y diferenciación de células progenitoras pancreáticas embrionarias in vitro. Esto incluye la formación de células beta productoras de insulina que no co-expresar otras hormonas endocrinas, tienen altos niveles de Pdx1, expresar las pro-convertasas que madurar a la insulina y la insulina tienen el procesado 28. Factores claves importantes dentro del sistema son la actividad de FGF (exógenamente estimulada por FGF añadido potenciada por la heparina) y Notch (endógena) vías de señalización, así como ROCK-inhibición por Y-27632: en ausencia de tales elementos, ninguna o muy un número limitado de organoides y esferas fueron generados 28. El requisito para FGF y Noactividad ch es fácil de entender sobre la base de su importancia para el desarrollo del páncreas in vivo 28. Inhibidor de la roca puede ser sustituido por blebbistatin, revelando de esta manera que la hiperactivación de la dinámica de microfilamentos tras la disociación conduce a tanto el aumento de la muerte celular, una fuerte inhibición del factor de transcripción Pdx1 progenitoras y una falta de expansión. Curiosamente, muchos de los componentes adicionales del medio organoide fueron probados para ser innecesario de forma individual, pero su ausencia combinada resultó en la pérdida de epitelio de ramificación 28. Además de ciertos componentes esenciales del medio, es importante para controlar el nivel de la disociación de los progenitores. De hecho, la proliferación de células progenitoras y el mantenimiento Pdx1 se promueven significativamente en los grupos de más de 4 células. Una compactación se puede observar dentro de las primeras 12 horas y la falta de resultados compactas en no mantener Pdx1 y ampliar. El inhibidor de la ROCA es esencial para esteproceso.

En los organoides momento no forman después de clasificación por FACS, pero la eficiencia del sistema pueden ser mejoradas por reaggregating un número controlado de progenitores. Otro componente crítico de este sistema de cultivo es la matriz 3D. Las células puestas en Matrigel o en el Matrigel demasiado cerca de la parte inferior de la placa de propagación y pierden la expresión de Pdx1. Matrigel más probable proporciona componentes bioquímicos, en particular laminina, así como señales mecánica 28. De hecho, la rigidez de la matriz desempeña un papel fundamental. Hidrogeles rígidos no son permisivas para el mantenimiento y la expansión de 28 progenitores pancreáticos y se diluyó Matrigel no es tampoco. Cuando se diluyó Matrigel uno y diez páncreas progenitoras no puede ser cultivado.

El sistema organoide se puede utilizar para probar los efectos de pequeñas moléculas y proteínas recombinantes en células progenitoras pancreáticas en términos de supervivencia, la proliferación, la diferenciación, la polarización y la ramificación28. También se puede utilizar para probar la cooperación de diferentes tipos de células durante el desarrollo del páncreas 28. Estamos seguros de que la accesibilidad de las células progenitoras pancreáticas también permitirá manipulaciones genéticas, como la focalización del virus, como se ha visto en otros sistemas de organoides 17,27. Esto podría ser utilizado para el cribado de 17 con un sistema que permite la morfogénesis en contraste con las esferas descritas anteriormente, así como aquí 16,17,28. Las condiciones de cultivo que hemos desarrollado también presentan la ventaja de ser libre de suero,-alimentador libre y carente de mesénquima y vasos sanguíneos reduciendo así la complejidad celular y bioquímica. Sin embargo, hay una limitación en la capacidad de paso de los organoides y por lo tanto la obtención de grandes cantidades de progenitores. Esto podría evitarse en el futuro mediante adaptaciones del protocolo para las etapas posteriores de desarrollo en el que los progenitores son más abundantes, a las fuentes de progenitores pancreáticos producidos a partir de embrióncélulas madre ic (ES) o células (iPS) madre pluripotentes inducidas. Esto allana el camino para un modelo 3D de desarrollo de páncreas humano.

Este sistema puede también, potencialmente, ser utilizado para la producción de las células pancreáticas en la perspectiva de futuro de la terapia. En este contexto, la producción de células beta funcionales para el trasplante potencialmente ayudaría en la terapia de la diabetes. Las adaptaciones del sistema de ES humanas o células iPS podrían ser importantes para este propósito. Aún no está claro si se deben usar las condiciones de organoides o esfera. Las condiciones de organoides permiten la producción de células que tienen varias características de las células beta maduras pero su función aún está por probar. Sin embargo, estas células no están actualmente numerosos y se mezclan entre otras células. También es probable que la aparición temprana de la heterogeneidad en el sistema organoide conduce a la señalización no controlada entre las células y por lo tanto es perjudicial para la producción.

Tl sistema de esfera que mantiene progenitores es en principio preferible para la expansión controlada y pases de progenitores pero su posterior diferenciación se mantiene para ser controlado. Otros han producido recientemente pancreatospheres que se pueden diferenciar de manera eficiente. Será importante para comparar la naturaleza de las esferas obtenidas en el protocolo actual carece de alimentadores y suero a esferas obtenidas con los otros protocolos 16,17. Desde un punto de vista terapéutico, la complejidad y el origen biológico de Matrigel pueden constituir un problema de reproducibilidad, la salud y la escalabilidad. Los resultados preliminares han demostrado que los hidrogeles blandos funcionalizados con laminina son permisivas para la expansión de progenitores de páncreas in vitro. Se requiere mayor optimización como estos geles aún no son tan eficientes como Matrigel 28.

La producción de células beta en su contexto natural también podría ser potencialmente útil para probar fármacos que aumentan la betaactividad de las células o aumentar su supervivencia o la proliferación, pero para este propósito será importante para probar primero el grado de madurez de las células beta, para aumentar la eficiencia de su diferenciación y para probar si las condiciones de cultivo que se presentan aquí mejor mantener islotes que el actual cultivos en suspensión. La producción de páncreas exocrino también podría ser útil para desarrollar fármacos para apuntar los cánceres de páncreas y pancreatitis. Una vez más, el grado de madurez de las células exocrinas producen necesita ser investigado a fondo.

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Acknowledgments

Este trabajo fue financiado de forma secuencial por un Frontiers NCCR en la adjudicación piloto de Genética, Investigación de Diabetes Juvenil Fundación Beca 41-2009-775 y Grant 12-126875 de Det Frie Forskningsråd / Sundhed og Sygdom. Los autores agradecen el laboratorio Spagnoli por acoger la grabación de vídeo.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Penicillin-Streptomycin Gibco 15070-063 Stock kept at -20 °C
KnockOut Serum replacement (supplement) Gibco 10828-028 Stock kept at -20 °C
2-mercaptoethanol Sigma Aldrich 3148-25ML Stock kept at 4 °C
Phorbol Myristate Acetate (PMA) Calbiotech 524400-1MG Stock kept at -20 °C
Y-27632 (ROCK inhibitor) Sigma Aldrich ab120129 Stock kept at -20 °C. Attention! Stability/source is a frequent source of problems.
EGF Sigma Aldrich E9644-2MG Stock kept at -80 °C
Recombinant Human R-spondin 1 R&D 4645-RS-025/CF Stock kept at -80 °C
Recombinant Mouse R-spondin 1 R&D 3474-RS-050 Stock kept at -80 °C
Recombinant Human FGF1 (aFGF) R&D 232-FA-025 Stock kept at -80 °C - do not include to increase beta cell production
Heparin (Liquemin) Drossapharm Stock kept at 4 °C
Recombinant Human FGF10 R&D 345-FG-025 Stock kept at -80 °C
DMEM/F-12 Gibco 21331-020
Penicillin-Streptomycin Gibco 15070-063 Stock kept at -20 °C
B27 x50 (supplement) Gibco 17504-044 Stock kept at -20 °C
Recombinant Human FGF2 (bFGF) R&D 233-FB-025 Stock kept at -80 °C
Matrigel Corning 356231 Stock kept at -20 °C
Trypsin 0.05% Gibco 25300-054 Stock kept at 4 °C
RNAlater - RNA stabilizing reagent Qiagen 76104 Store at RT
Dispase  Sigma Aldrich D4818-2MG Working concentration: 1.25 mg/ml. Stock kept at -20 °C
BSA for reconstitution Milipore 81-068 For reconstituition of cytokines  - stock kept at -20 °C
Fetal calf serum (FCS) Gibco 16141079 Stock kept at -20 °C
60-well MicroWell trays Sigma Aldrich M0815-100EA
4-well plates Thermo Scientific 176740
95-well plates F bottom Greiner Bio 6555180
Glas bottom plates Ibidi 81158
Disposal glass micropipettes Blaubrand 708745
Microscope Cell® imaging station (motorized inverted Olympus IX81 stand) equipped with a Hamamatsu ORCA ER B7W camera and the Ludin Cube and Box.
Leica DMI6000 B stand surrounded with a Ludin Cube and Box, equipped with a Leica DFC365 FX camera and the AF6000 Expert/Matrix software command interface.
Objective Olympus UPLAN FL NA 0.30 air 9.50 mm 10X long distance;
Leica HC PL FLUOTAR NA 0.30 air 11.0 mm 10X long distance

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Pagliuca, F. W., Melton, D. A. How to make a functional beta-cell. Development. 140, 2472-2483 (2013).
  2. Percival, A. C., Slack, J. M. Analysis of pancreatic development using a cell lineage label. Exp Cell Res. 247, 123-132 (1999).
  3. Attali, M., et al. Control of beta-cell differentiation by the pancreatic mesenchyme. Diabetes. 56, 1248-1258 (2007).
  4. Johansson, K. A., et al. Temporal control of neurogenin3 activity in pancreas progenitors reveals competence windows for the generation of different endocrine cell types. Dev Cell. 12, 457-465 (2007).
  5. Speier, S., Rupnik, M. A novel approach to in situ characterization of pancreatic beta-cells. Pflugers Arch. 446, 553-558 (2003).
  6. Golosow, N., Grobstein, C. Epitheliomesenchymal interaction in pancreatic morphogenesis. Dev Biol. 4, 242-255 (1962).
  7. Miralles, F., Czernichow, P., Scharfmann, R. Follistatin regulates the relative proportions of endocrine versus exocrine tissue during pancreatic development. Development. 125, 1017-1024 (1998).
  8. Petzold, K. M., Spagnoli, F. M. A system for ex vivo culturing of embryonic pancreas. J. Vis. Exp. 3979 (2012).
  9. Miralles, F., Battelino, T., Czernichow, P., Scharfmann, R. TGF-beta plays a key role in morphogenesis of the pancreatic islets of Langerhans by controlling the activity of the matrix metalloproteinase MMP-2. J Cell Biol. 143, 827-836 (1998).
  10. Hope, K., Bhatia, M. Clonal interrogation of stem cells. Nat Methods. 8, 36-40 (2011).
  11. Sugiyama, T., Rodriguez, R. T., McLean, G. W., Kim, S. K. Conserved markers of fetal pancreatic epithelium permit prospective isolation of islet progenitor cells by FACS. Proc Natl Acad Sci U S A. 104, 175-180 (2007).
  12. Reynolds, B. A., Weiss, S. Generation of neurons and astrocytes from isolated cells of the adult mammalian central nervous system. Science. 255, 1707-1710 (1992).
  13. Dontu, G., et al. In vitro propagation and transcriptional profiling of human mammary stem/progenitor cells. Genes Dev. 17, 1253-1270 (2003).
  14. Smukler, S. R., et al. The adult mouse and human pancreas contain rare multipotent stem cells that express insulin. Cell Stem Cell. 8, 281-293 (2011).
  15. Seaberg, R. M., et al. Clonal identification of multipotent precursors from adult mouse pancreas that generate neural and pancreatic lineages. Nat Biotechnol. 22, 1115-1124 (2004).
  16. Jin, L., et al. Colony-forming cells in the adult mouse pancreas are expandable in Matrigel and form endocrine/acinar colonies in laminin hydrogel. Proc Natl Acad Sci U S A. 110, 3907-3912 (2013).
  17. Sugiyama, T., et al. Reconstituting pancreas development from purified progenitor cells reveals genes essential for islet differentiation. Proc Natl Acad Sci U S A. 110, 12691-12696 (2013).
  18. Huch, M., et al. Unlimited in vitro expansion of adult bi-potent pancreas progenitors through the Lgr5/R-spondin axis. Embo J. (2013).
  19. Sato, T., et al. Single Lgr5 stem cells build crypt-villus structures in vitro without a mesenchymal niche. Nature. (2009).
  20. Ootani, A., et al. Sustained in vitro intestinal epithelial culture within a Wnt-dependent stem cell niche. Nat Med. 15, 701-706 (2009).
  21. Barker, N., et al. Lgr5(+ve) stem cells drive self-renewal in the stomach and build long-lived gastric units in vitro. Cell Stem Cell. 6, 25-36 (2010).
  22. Huch, M., et al. In vitro expansion of single Lgr5+ liver stem cells induced by Wnt-driven regeneration. Nature. 494, 247-250 (2013).
  23. Lukacs, R. U., Goldstein, A. S., Lawson, D. A., Cheng, D., Witte, O. N. Isolation, cultivation and characterization of adult murine prostate stem cells. Nat Protoc. 5, 702-713 (2010).
  24. Rock, J. R., et al. Basal cells as stem cells of the mouse trachea and human airway epithelium. Proc Natl Acad Sci U S A. 106, 12771-12775 (2009).
  25. Eiraku, M., et al. Self-organizing optic-cup morphogenesis in three-dimensional culture. Nature. 472, 51-56 (2011).
  26. Spence, J. R., et al. Directed differentiation of human pluripotent stem cells into intestinal tissue in vitro. Nature. 470, 105-109 (2011).
  27. Lancaster, M. A., et al. Cerebral organoids model human brain development and microcephaly. Nature. 10, (2013).
  28. Greggio, C., et al. Artificial three-dimensional niches deconstruct pancreas development in vitro. Development. 140, 4452-4462 (2013).
  29. Muzumdar, M. D., Tasic, B., Miyamichi, K., Li, L., Luo, L. A global double-fluorescent Cre reporter mouse. Genesis. 45, 593-605 (2007).
<em>In Vitro</em> Páncreas Organogenesis de dispersos embrionarios de ratón Progenitores
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Greggio, C., De Franceschi, F., Figueiredo-Larsen, M., Grapin-Botton, A. In Vitro Pancreas Organogenesis from Dispersed Mouse Embryonic Progenitors. J. Vis. Exp. (89), e51725, doi:10.3791/51725 (2014).More

Greggio, C., De Franceschi, F., Figueiredo-Larsen, M., Grapin-Botton, A. In Vitro Pancreas Organogenesis from Dispersed Mouse Embryonic Progenitors. J. Vis. Exp. (89), e51725, doi:10.3791/51725 (2014).

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