Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
Click here for the English version

Biology

Dağınık Fare Embriyonik progenitörlerin gelen Vitro Pankreas organogeneziste

doi: 10.3791/51725 Published: July 19, 2014
* These authors contributed equally

Summary

Bu protokol açıklanan üç boyutlu kültür yöntemi dallı bir organ haline onların önemli genişleme, farklılaşma ve morfojenezinin dahil dağınık embriyonik fare pankreas atalarıdır, gelen pankreas gelişimini özetlediği. Bu yöntem, görüntüleme, niş fonksiyonel müdahale ve manipülasyon için uygun değildir.

Introduction

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Organ kültür vivo araştırmalarda karmaşık ama son derece alakalı arasındaki boşlukları ve hücre çizgi modellerin uygun ama yaklaşık simülasyon köprü kullanışlı bir model sağlar. Pankreas durumunda, endokrin ve ekzokrin hücreleri taklit hücre çizgileri bulunmaktadır transforme edilir, ancak pankreas progenitörlerin mükemmel eşdeğer herhangi bir hücre hattı yoktur. Yetişkin Bütün pankreas kültüre olamaz; izole edilmiş endokrin adacık hücresi çoğalması olmadan birkaç hafta muhafaza edilebilir ve doku dilimleri birkaç saat 5 için in vitro olarak tutulabilir. Embriyonik pankreas kültürü yaygın gelişimini incelemek için sadece kullanılır olmuştur, ama aynı zamanda 8 işler görüntüye, epitelyal-mezenkimal etkileşimleri 4,6,7 araştırmak veya kimyasal onlarla 9 ile müdahale. İki organ kültürü yöntemleri ağırlıklı olarak kullanılır: İlk conve fibronektin kaplı plakalar 2, üzerinde pankreas tomurcukları kültürleme oluşurGörüntüleme amacıyla nient; İkinci seçenek kültürüne en morfogenetiğine korur hava-sıvı arayüzü 3,4 de filtrelerde organ olduğunu. Çok faydalı olmasına rağmen, bu yöntemler, düzleşme belli bir dereceye kadar yol; normal gelişimi ile karşılaştırıldığında ve başlangıç ​​popülasyonu pankreas hücreleri ve mezenkimal hücreler her türlü içeren karmaşık olduğu gibi progenitörlerin genişleme çok sınırlıdır.

Kültür yeteneği ve dağınık birincil hücreleri genişletmek soy ilişkileri incelemek ve izole hücre tiplerinin 10 içsel özelliklerini ortaya çıkarmak için değerlidir. Sugiyama ve ark. 11. pankreas atalarıdır ve besleyici katmanlar kültürde 3-5 gündür bazı fonksiyonel karakterleri korunur endokrin atalarıdır korumak olabilir. Atalarıdır doğası / kök hücrelerin rağmen neurospheres 12 ve 13 mammospheres benzer Pancreatospheres, yetişkin adacık ve duktal hücrelerinden genişletilmiştirBu küreler oluşturmak olduğu açık değildir. Buna ek olarak, fizyolojik gelişimi ile aksine, bazı pancreatospheres nöronlar 14,15 ihtiva etmiştir. Küreler yakın zamanda embriyonik pankreas atalarıdır 16,17 ve iyi progenitör genişleme ve sonraki farklılaşma ile pankreata 18 yenileyici üretilir ama morfogenetiğine özetlemek başarısız olduğu görülmüştür.

Minyatür organları içine kendi kendini düzenleyebilir ve genellikle dağınık tanımlanan hücrelerden 3 boyutlu modeller son gelişti ve bu bağırsak 19,20, 21, mide, karaciğer 22, prostat 23 ve nefes borusu gibi birden fazla organların gelişimi veya yetişkin devir taklit adres 24. Optik bardak 25, 26 ya da bağırsak, beyin 27 olduğu gibi, bazı durumlarda, gelişme morfolojisi ve farklılaşması, ES hücrelerinden in 3D değinmeyecek edilmiştir.

Burada, biz desOnlar farklılaştırmak ve öz-örgütlenmeyi bir 3D Matrigel iskele ayrışmış multipotent pankreas atalarıdır genişletmek için bir yöntem cribe.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Bu protokol kemirgen E10.5 türetilen pankreas organoids epitel hücreleri pankreas ayrışmış büyümeyi hedeflemektedir.

Protokol hayvan deney için etik kurul onayı gerektirir.

E10.5 fare embriyoları Dorsal Pankreas Bud 1. Diseksiyon

  1. Bir makas ile karın açmak, embriyonik gün (E) 10.5 aşımına hamile fareler kurban, iki rahim boynuzları çıkarın ve soğuk fosfat tamponu (PBS) veya Dulbeccol ile dolu bir 10 cm Petri kabındaki koyun modifiye temel, orta (DMEM) buz üzerinde tutuldu. Hücre ekimi için kurban gelen toplam deney hücre zarar görmesini önlemek için, 60-90 dakika içinde yapılır.
  2. Küçük bir makas kullanarak tek tek embriyo bölümler halinde rahim ayırın. Gibi soğuk PBS ile bir 35 mm Petri kabı, bir embriyo transfer ve üstten aydınlatma ile bir mikroskop altında görselleştirmek. Diseksiyon forseps ile çevreleyen kas, desidua ve yumurta sarısı sa kaldırmakc ve embriyo maruz. Lütfen soğuk DMEM ortama embriyo yerleştirin. Embriyolar kolayca 3 ml'lik plastik transferi pipet / damlalık kullanarak transfer edilebilir. Devam etmeden önce benzer bir şekilde, her bir embriyonun izole edin.
  3. PBS içinde temiz bir 35 mm Petri kabı içine bir embriyo yerleştirin.
    1. Ön ayakları kaldırmak için ince forseps (0.05 mm genişlik) kullanın. Yavaşça omurilik bölgesinden sindirim sistemi (Şekil 1) ayırmak için açılış forseps yerleştirin. İSTEĞE BAĞLI: daha rahat, mide görmek aşağı sarısı sap altında kalp ve kuyruk bölgeye, embriyonun üst vücut kaldırmak için.
    2. Mide, karaciğer ve bağırsak bulun. Forseps kullanılarak, bağırsak mideden mide-bağırsak yolu izole etmek ve (Şekil 1), buz üzerinde, soğuk DMEM içine yerleştirin. Dorsal pankreatik bud mide dorsal, posterior (Şekil 1) takılır.
    3. Bir simi her bireyin gastrointestinal izoleDevam etmeden önce lar şekilde. Embriyoların genotip gerekiyorsa, diseksiyon zamanda kuyruk toplar ve buz soğuk DMEM ile 24 kuyucuklu bir plaka içerisinde farklı bir kuyu içinde her bir mide-bağırsak yolu tutmak.
  4. Soğuk PBS ile temiz bir 35 mm Petri tabağına yerleştirin, bir mide-bağırsak yolu. Şimdi diseksiyon mikroskop altında dorsal pankreas tomurcuk görselleştirmek ve teşrih parlak alanda aşağıdan aydınlatma kullanın. Bu koşullar hacimlerinin görselleştirme optimize eder. Elektrolitik-bilenmiş tungsten iğne veya 20 G şırınga iğneleri kullanarak, epiteli etrafında mümkün olduğunca az mezenşimin ile pankreas tomurcuğu (Şekil 1) izole.
    1. 2-3 dakika boyunca, bir soğuk dispase çözeltisi (1.25 mg / ml) ihtiva eden bir petri çanağı içine izole edilmiş tomurcuk aktarın. Bu noktadan itibaren, transfer en uygun bir ağızdan-kontrol edilen esnek bir boru bağlanmış alev çekilmiş 50 ul bir cam kılcal ile yapılabilir. Alternatif olarak, ancak daha ritomurcuğu kaybetme sk, uygun plastik ipuçları ile 10 ul otomatik pipet (Pipetman) kullanın.
    2. Mikroskopik kontrol altında pankreas tomurcuk aspirasyon ve fırlamasını gerçekleştirin. Geri PBS içinde pankreas tomurcuk koydu. Bundan başka, cam kılcal (Şekil 1) kullanılarak, iğnelerin ve yumuşak aspirasyon ile mezenşimin gelen izole edilmiş pankreas tomurcuk temizleyin.
    3. Tüm mezenşimin çıkarıldığında, soğuk PBS içinde pankreatik tomurcuk durulama; (60-iyi mini tepsi soğuk DMEM 10 ul ile dolu) bireysel kuyularda soğuk DMEM'ye her tomurcuk transfer. Bu doku çok yapışkan yapar, dispase yılında mezenşimi kaldırmak için önemli değildir.

Dağılmış hücreler 2. Kaplama ve Kültür

  1. Durulama için 10 ul PBS ile dolu 60-iyi mini kasetlerinden konik kuyuların içine alev-kapiller çekti cam ile tüm embriyolar disseke epitelyaya aktarın.
    1. Tripsin% 0.05 a 10 ul transfer tomurcuknd bu 4 dakika süreyle 37 ° C'de inkübe edin. 10 ul DMEM +% 10 fetal dana serumu (FCS) ile bir kuyuya tomurcuk aktararak tripsin etkisiz hale getirirler.
    2. Bir pipet çektirmesi ile çekilmiş ince kılcal damar yoluyla aspirasyon ile hücre süspansiyonu ayrışır. Bu hücreleri ayırmak için yukarı ve aşağı pipetleme sırasında bu aşamada kabarcıkları önlemek için önemlidir. Pankreas organoids optimum 5-15 hücre küçük gruplar başlar ve bu nedenle kısmi ayrılma (Şekil 1) kullanılması tavsiye edilir.
  2. Tek tek işleme nedeniyle farklılıkları en aza indirmek amacıyla bir Eppendorf tüpü içine birkaç embriyolarından hücreleri havuzda toplayın. , 1:3 oranında Matrigel soğutulmuş hücre süspansiyonu seyreltin. Kısım 96 oyuklu bir plaka, 8 ul / oyuk veya görüntüleme için optimize edilmiş bir plaka içinde (aşağıya bakınız) için bu karışımı ile gerçekleştirilmektedir.
  3. Matrigel kalınlaştırmak için izin veren, 5 dakika boyunca 37 ° C'de inkübe edin. Seçim ortamı 70 ul ile kuyu doldurun (organoid veya küre, sekmesine bakınles 1 ve 2) ve 37 ° C de% 5 CO2 ve% 95 hava içeren nemlendirilmiş bir ortamda bırakmak
  4. Her 4. günde orta yerine. Günlük büyüyen pankreas koloniler izlemek ve görüntüleme işlemini belgelemek.
  5. Daha önce rapor edildiği gibi, 28 çıkar küçük moleküller ya da proteinler, girişim deneyleri için bu aşamada ortamına ilave edilebilir.

Tablo 1: organoid ortamı.

Malzeme Adı Hazır Konsantrasyon Son ortam içinde konsantre Stokunun hacmi
Penisilin-Streptomisin % 100 % 1 50 ul
Nakavt Serum değiştirme (ek) % 100 % 10. 500 ul
2-merkaptoetanol 14.3 M 0.1 mM 1 ul
Forbol Miristat Asetat (PMA) 16 iM 16 nM 5 ul
Y-27632 (ROCK inhibitörü) 50 mM 10 uM 1 ul
EGF 50 ug / ml 25 ng / ml 2.5 ul
Rekombinant İnsan 1 R-spondin 250 ug / ml 500 ng / ml 10 ul
- Ya da -
Rekombinant Fare R-1 spondin 250 ug / ml 500 ng / ml 10 ul
Rekombinant İnsan FGF1 (aFGF) 100 ug / ml 25 ug / ml 1.25 ul
Heparin (Liquemin) 2500 U / ml 2.5 U / ml 2 ul
Recombinant İnsan FGF10 100 ug / ml 100 ng / ml 5 ul
DMEM/F-12 4,412.25 ul
Toplam 5000 ul

Tablo 2: Küre ortamı.

Malzeme Adı Hazır Konsantrasyon Son ortam içinde konsantre Stokunun hacmi
Penisilin-Streptomisin % 100 % 1 50 ul
B27 x50 (ek) % 100 % 10. 100 ul
Rekombinant İnsan FGF2 (bFGF) 100 ug / ml 64 ng / ml 3.2 ul
Y-27632 (ROCK inhibitörü) 50 mM 10 uM 1 ul
DMEM/F-12 4845,8 ul
Toplam 5000 ul

Organoid Geliştirme İlerlemesi 3. Görüntüleme

  1. Görüntü organoids günlük veya zaman atlamalı mikroskopi bir floresan time-lapse mikroskop kullanılarak. Zaman atlamalı görüntüleme için, bir XY (Z) otomatik ters floresan mikroskop kullanın.
  2. 4-çukurlu plakalara veya 2-5 ml ortam ile doldurulmuş olan cam-tabanlı plakalar içerisinde 3 ul'lik Deposit küçük damlacıklar halinde. 10x uzun mesafe hedefi ile görüntü. Not: floresan izleyiciler ifade eden transjenik farenin kullanılabilir. Örneğin Movie 1 gösterileri Pdx1-Ngn3-ER TM-ires-nGFP + farelerden 4 organoids ilk genişleme. Nükleer GFP tek nesneleri ancak benzer ilkeler zar floresan ile hücreleri izlemek için uygulanabilir olarak hücreleri izlemek için sağlar bumT / mG fareler 29 gibi.
  3. Odak sürükleniyor önlemek ve elle tanımlanmış pozisyonlarda 3 veya daha fazla gün için 1 resim / saat almak için yazılım kontrol otomasyon ayarlamak için tohum hücreleri sonra time-lapse görüntüleme 3 saat başlayın. Her bir konumu için, floresan markör ifade raporlama, diferansiyel girişim kontrast (DIC) görüntü hem de GFP sinyali elde.

Histoloji için Organoids 4. Recovery

  1. Buz üzerinde 96 oyuklu plaka koyun ve buz gibi soğuk PBS ile değiştirilmesi, orta çıkarın. Bu kısmen Matrigel depolimerize.
  2. Yavaşça genel yapısını bozmayacak amacıyla 1.000 ul ucu kullanarak çevredeki Matrigel kaldırarak, her organoid aspire. Buz gibi soğuk PBS ile bir kuyuya her organoid aktarın. Buz üzerinde plaka tutun. Matrigel Doğrudan tespit de mümkündür.
  3. ,% 4 paraformaldehit (PFA) içerisinde 15 dakika boyunca organoid saptamak sukroz içinde dondurularak saklanabilmesi ve jelatin içine gömmek. Her Süreçorganoid önce (Johansson et al., 2007) tarif edildiği gibi 4 cryosectioning ve histoloji için.

PCR ve Biyokimya Organoids 5. Recovery

  1. Buz üzerinde 96 oyuklu plaka yerleştirin ve orta çıkarın. Hücresel RNA stabilize etmek ve korumak için oyuk başına RNAlater 60 ul ekle.
  2. Kısmen buz üzerinde depolymerizing her iyi mekanik olarak jel bozar. Genel yapısını bozabilir veya 200 ul ucu ile mekanik jel bozarak (Matrigel ile) tüm iyileşmez için 1.000 ul uç kullanarak bireysel organoids kurtarmak ya. Bir RNAse serbest olmayan yapışkan Eppendorf tüpüne da içerik aktarmak için 1.000 ul ucu kullanın buz üzerinde tutulmalıdır.
  3. 60 ul RNAlater ile kuyu yıkayın ve aynı Eppendorf tüpüne kalan içerik eklemek.
  4. 4 ° C 'de 500-1000 x g'de 5 dakika boyunca tüpleri Spin
  5. Sadece 20-30 ul bırakarak, süpernatant kaldırmakbirlikte pelet ile tüp içinde RNAlater. Biyokimya için, mümkün olduğu kadar kuru numune saklayın.
  6. Hemen RNAlater örnekleri dondurma etmeyin; 4 ° CO / N de mağaza (RNAlater iyice dokuya nüfuz sağlamak için). Doku, uzun süreli depolama için -20 ° C 'de muhafaza edilebilir ve daha sonra, doku bozulması ve RNA küçük miktarlarda çıkarılması için işlenebilir.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

3D Matrigel'de ayrışmış ve seribaşı E10.5 dorsal pankreas atalarıdır pankreas gelişimini özetlemek. Atalarıdır en kolay floresan gazetecilere takip edilebilir. Bizim durumumuzda (Şekil 2) Neurog3 4 etkinleştirmeden tamoksifen yokluğunda ve böylece Pdx1 promoteri (Pdx1-Ngn3-ER TM-nGFP) (Film 1) tarafından kontrol edilen bir nükleer GFP proteini eksprese eden transgenik bir fare kullanılmıştır.

Organoid orta ile küçük hücre kümeleri bir ilk sıkıştırma ilk saat içinde ortaya çıkar. Genleşme daha sonra, ilk 4 gün içinde kümelerin genişleme (Şekil 2A) ile tespit edilebilir. 5. günde itibaren, şube% 20 büyük organoids formu. Tek hücreleri genişletmek ve büyük kümeler Pdx1 ifadesini 28 korurlarken Pdx1 ifade kaybetmek yok.

Bu koşullarda, progenitorlar bir spec geçmesidallı epitel yapıların ortaya çıkması ile tacular morfogenez. Atalarıdır toplum sinyalleri güçlü bir gereklilik gösteren, ≥ 4-hücreleri kümeler halinde ekilir yalnızca bu süreç gerçekleşir. Ekzokrin (Amilaz +) ya da endokrin (insülin + ya da ifade eden ya da ve farklılaşmış hücrelerin: Histolojik analiz kültür 7 gün sonra, elde edilen mini organlar pankreas soylarının (Şekil 3B SOX9 + / HNF1B + / Pdx1 + hücreler) oluşan olduğunu ortaya koymaktadır Glukagon +) işaretleri (Şekil 3A, C). Endokrin hücrelerine farklılaşması (% 0.1 civarında), endojen pankreasın daha düşük olan, ancak FGF1 kültür ortamına 28 eklenmez zaman% 1 kadar artırılır. Dikkate değer, seribaşı atalarıdır beklenen pankreas soy içine ayrım yapmak değil sadece, ama onlar da kendiliğinden, normal pankreas mimarisini benimseyen. Her ne kadar D10.5 multipotent pankreas progenitorlar merkezi boşluğa bakan zarda Mucin1 ve aPKC ayrılması gösterdiği ve bir dallı boru şekilli bir ağ halinde organize olarak kültürdeki hücrelerin polarize, polarize değildir. Bölgeye göre "uç ve gövde" etki ortaya çıkmaktadır: acinar hücreleri, bir hücre kısmen ya da tamamen taç olarak çevresinde bulunan ise HNF1B + öncüleri ve endokrin hücreleri, merkezi bölgede lokalize edilmiştir. Organoids 10 gün boyunca kültür içinde muhafaza edilebilir; Bu süre sonra, genel olarak mimari organizasyon kaybı ve kistik (gösterilmemiş olan) olur. Pasajlanması kısmi ayrışma sonra hızlı bir şekilde yapılır, ancak, kist oluşumunun, BMP inhibitör Noggin 28 eklenmesiyle azaltılır bir olguya neden olabilir.

Küre orta ile genişleme daha sıktır ve tek hücreler% 2 den görüldüğü; Bununla birlikte küre oluşumunun etkinliği seede büyüklüğü ile ilişkilidird kümeleri 28. Gün 2/3 de, bir lümen zaman yerel çok katmanlı alanları (Şekil 2B) ile büyük ölçüde mono-tabakalı içi boş küreler yol açan, daha sonra küçük kümeler tespit ve genleşir. Matrigel (Şekil 3D-H) alınan zaman bu küreler çökecek. Bu şartlar altında, elde edilen yapılar esas olarak 7 gün sonra farklılaşmış ekzokrin ve endokrin hücrelerin küçük bir yüzdesi olarak (Şekil 3D-H) ile, pankreas progenitörlerin oluşmaktadır. Tüm hücreleri (Şekil 3F) merkez lümen bakan membran aPKC ayrılması ile gösterildiği gibi küre progenitörlerin da apikal polarize olur. Pancreatospheres en az iki katı (gösterilmemiştir) geçişli olabilir.

Şekil 1
Şekil 1. Prosedüründe şematik gösterimie. gastro-intestinal sistem, ilk olarak embriyo kesilir ve daha sonra dorsal pankreas tomurcuk izole edilir. Mezenşimin çıkarılır ve pankreas ataları tripsin kullanılarak ayrıştırılırlar. Elde edilen kısmen dağıtılmış Hücreler daha sonra, büyüme faktörü-tükenmiş Matrigel düşük yoğunlukta ekilir. Bar Ölçek:. Ölçek çubuğu 200 mikron çıkan organoid resim hariç 1.00 mm bu rakamın daha büyük bir versiyonunu görmek için buraya tıklayınız.

Şekil 2,
Zamanla kültür Şekil 2.. İlerleme. (A) organoid ortamı ile büyüdü ve 60 saat için, kaplama sonrası 3 saat time-lapse mikroskobu ile takip pankreas atalarıdır küçük bir küme. Bottom panelleri, 7 günlük bir kültürden sonra organoid. Ölçek çubuğu: 200 mikron; A. tüm paneller için geçerli bir kürenin (B) Örnek bir 60 saat time-lapse takip ve kültür 7. günde ele geçirdi. Ölçek çubuğu: 200 mikron; B tüm paneller için geçerlidir. , bu rakamın daha büyük bir versiyonunu görmek için buraya tıklayınız.

Şekil 3,
Şekil 3.. Histoloji. 7-günlük (AC) Seri kesitler atası (B - HNF1B) için boyandı organoid ve farklılaşma (A - amilaz, C - insülin) belirteçleri. Organoid epitel oluşur (A - E-kaderin) ve apikal (B - mucin1) polarize hücreler. Kesikli çizgi olmayan asinar merkezi bölge (A) karşılık gelirHNF1B (B) ve endokrin (C) hücreler tespit edilir atası için lekeli 7 günlük kürelerin (DH) Bölüm. (G - HNF1B; H - SOX9) ve endokrin (D - insülin ve glukagon) belirteçleri. Epitel (E - E-kaderin) hücreleri - küreler apikale (aPKC D, F) polarize oluşmaktadır. Ölçek çubuğu:. 50 um bu rakamın daha büyük bir versiyonunu görmek için buraya tıklayınız.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

In vitro fonksiyonel beta hücrelerinin büyük ölçekli üretim hala 1 etkisizdir. Bu zorlu bağlamda, gelişim biyolojisi çalışma fonksiyonel beta hücrelerinin farklılaşması için gerekli olan tam sinyalleri deşifre yardımcı olabilir. Bu protokol, in vitro embriyo pankreas progenitörlerin bakım, genişleme ve farklılaşması için izin verir. Bu, diğer endokrin hormon eş bildirilmemektedir insülin üreten beta hücrelerinin oluşumunu içeren, Pdx1 yüksek düzeyde, insülin olgun ve işlenmiş insülin 28 sahip ön-dönüştürücüler ifade var. Sistem içinde önemli temel faktör (dışsal olarak heparin tarafından kuvvetlendirilen ilave FGF ile uyarılmış) FGF'nin aktivitesi olan ve çentik (endojen) sinyal yolları, hem de Y-27632 ile ROCK-inhibisyon: bu faktörlerin yokluğunda, hiç ya da çok organoids ve küreler sınırlı sayıda 28 oluşturulmuştur. FGF için ve değil gereklilikch aktivite kolaylıkla vivo 28 pankreas gelişimi için önemine dayalı anlaşılmaktadır. ROCK inhibitörü ayrışma hem de artan hücre ölümü, progenitör transkripsiyon faktörü Pdx1 güçlü bir inhibisyonu ve genişleme eksikliğine yol açar ve böylece üzerine mikrofilaman dinamikleri bu hiperaktivasyondan açığa Blebbistatin ile ikame edilebilir. İlginç bir şekilde, organoid ortamın birçok ek parçalar tek tek gereksiz olduğu kanıtlanmıştır, ancak birleşik yokluğunda 28 dallanma epitel kaybına sonuçlanmıştır. Ortamın bazı temel bileşenlerine ek olarak, bu progenitörlerin ayrışma seviyesini kontrol etmek önemlidir. Gerçekten de, progenitör çoğalması ve Pdx1 bakım önemli ölçüde daha fazla 4 hücrelerinin gruplar halinde yükseltilir. Bir sıkıştırma Pdx1 sürdürmek ve genişletmek başarısızlıkla kompakt sonuçlar, ilk 12 saat içinde ve başarısızlık gözlenebilir. ROCK inhibitörü, bu için gerekli olansüreci.

FACS ayıklama, ancak sistemin etkinliği potansiyel progenitörlerin kontrol edilen bir dizi reaggregating ile geliştirilebilir sonra an organoids de oluşturmaz. Bu kültür sisteminin bir başka önemli bileşeni, 3 boyutlu bir matristir. Hücreler Matrigel veya plaka formanın altına çok yakın Matrigel'de koymak ve Pdx1 ifadesini kaybedersiniz. Matrigel büyük olasılıkla biyokimyasal bileşenlerin, özellikle laminin yanı sıra mekanik ipuçları 28 içerir. Gerçekten de, matrisin sertliği çok önemli bir rol oynar. Sert hidrojelleri pankreas atalarıdır bakım ve genişletme 28 için müsamahakâr değildir ve seyreltilmiş Matrıgel ya da değil. Matrigel seyreltildiğinde 01:10 pankreas projenitör kültüre olamaz.

Organoid sistemi hayatta kalma, çoğalma, farklılaşma, polarizasyon açısından pankreas progenitörlerin küçük moleküller ve rekombinant proteinlerin etkilerini test etmek için kullanılır ve dallanma edilebilir28. Ayrıca, pankreas gelişimi esnasında 28 farklı hücre tipleri arasında işbirliğini test etmek için de kullanılabilir. Bu pankreatik progenitör hücrelerinin yönelik başka organoid sistemlerinde 17,27 görüldüğü gibi viral hedefleme gibi genetik manipülasyonlar, sağlayacaktır inanıyoruz. Bu, burada 16,17,28, daha önce de tarif edilen alanlarda aksine morfolojilerinden sağlayan bir sistem ile 17 taranması için kullanılabilir. Daha da geliştirilen kültür koşulları serumsuz olma avantajı mevcut, besleyici içermeyen ve böylece hücresel ve biyokimyasal karmaşıklığını azaltmak mezenşimin ve kan damarlarının yoksun. Ancak, geçiş organoids yeteneği bir sınırlama olduğunu ve bu nedenle büyük miktarlarda progenitörlerin elde edildi. Bu embryo'lu üretilen pankreas atalarıdır kaynaklarına, atalarıdır daha bol gelişiminin sonraki aşamalarında protokol uyarlamaları ile gelecekte aşılabiliric sap (ES) hücreleri ya da uyarılmış pluripotent kök (iPS) hücreleri. Bu, insan pankreas gelişiminin bir 3D model için önünü açıyor.

Bu sistem aynı zamanda, potansiyel tedavi gelecekteki perspektif pankreatik hücrelerin üretimi için de kullanılabilir. Bu bağlamda, transplantasyon için fonksiyonel beta hücrelerinin üretimi potansiyel diyabet tedavisinin yardımcı olacaktır. İnsan ES veya iPS hücrelerine sistemin uyarlamalar bu amaç için önemli olacaktır. Bu organoid veya küre koşulları kullanılması gerekip gerekmediğini hala belirsizdir. Organoid koşullar olgun beta hücrelerinin çeşitli özelliklere sahiptir, fakat bunların işlevi, test edilecek kalan hücrelerin üretimi için izin verir. Bununla birlikte, bu hücreler, şu anda çok değildir ve başka hücreleri arasında karıştırılır. Bu organoid sisteminde heterojenlik erken görüntüsü, hücreler arasında kontrolsuz bir sinyal yol açar ve dolayısı ile de üretim için zararlı olması da muhtemeldir.

Tprogenitörlerin tutar o küre sistemi prensip olarak progenitörlerinin kontrollü genişleme ve geçiş için tercih edilir, ama bunların daha sonraki farklılaşma kontrol edilmesi gerekmektedir. Diğerleri yakın verimli ayırt edilebilir pancreatospheres üretti. Bu diğer protokoller 16,17 ile elde kürelere besleyiciler ve serum yoksun mevcut protokolde elde edilen kürelerin doğasını karşılaştırmak için önemli olacaktır. Görünümünde bir terapötik açıdan bakıldığında, karmaşıklığı ve Matrigelin biyolojik kökeni tekrarlanabilirliği, sağlık ve ölçeklenebilirlik bir sorun teşkil edebilir. Ön sonuçlar, laminin ile işlevlendirilmektedir yumuşak hidrojeller, in vitro olarak pankreatik progenitör genişleme için geçirgen olduğunu göstermiştir. Bu jeller henüz Matrigel 28 kadar etkili değildir gibi başka optimizasyon gereklidir.

Doğal bağlamda beta hücrelerinin üretimi, aynı zamanda potansiyel olarak artırmak beta deney ilaç için yararlı olabilirhücre etkinliği ya da bunların hayatta kalma veya proliferasyon geliştirmek, ancak bu amaç için, ilk olarak farklılaşma verimliliğini artırmak ve Burada yer alan kültür koşulları daha akımından daha adacıklar muhafaza olup olmadığını test etmek için, beta hücrelerinin olgunluk derecesi test etmek için önemli olacaktır Süspansiyon kültürleri. Ekzokrin pankreas üreten pankreas kanserleri ve pankreatit hedef ilaçlar geliştirmek için yararlı olabilir. Burada yine, üretilen ekzokrin hücrelerin olgunluk derecesi iyice araştırılması gerekir.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Acknowledgments

Bu çalışma Det sutable Forskningsråd / Sundhed og Sygdom Bir Genetik Pilot ödülü NCCR Frontiers, Juvenil Diyabet Araştırma Vakfı Hibe 41-2009-775 ve Grant 12-126875 tarafından sırayla finanse edildi. Yazarlar video çekimi sahipliği için Spagnoli laboratuvar teşekkür ederim.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Penicillin-Streptomycin Gibco 15070-063 Stock kept at -20 °C
KnockOut Serum replacement (supplement) Gibco 10828-028 Stock kept at -20 °C
2-mercaptoethanol Sigma Aldrich 3148-25ML Stock kept at 4 °C
Phorbol Myristate Acetate (PMA) Calbiotech 524400-1MG Stock kept at -20 °C
Y-27632 (ROCK inhibitor) Sigma Aldrich ab120129 Stock kept at -20 °C. Attention! Stability/source is a frequent source of problems.
EGF Sigma Aldrich E9644-2MG Stock kept at -80 °C
Recombinant Human R-spondin 1 R&D 4645-RS-025/CF Stock kept at -80 °C
Recombinant Mouse R-spondin 1 R&D 3474-RS-050 Stock kept at -80 °C
Recombinant Human FGF1 (aFGF) R&D 232-FA-025 Stock kept at -80 °C - do not include to increase beta cell production
Heparin (Liquemin) Drossapharm Stock kept at 4 °C
Recombinant Human FGF10 R&D 345-FG-025 Stock kept at -80 °C
DMEM/F-12 Gibco 21331-020
Penicillin-Streptomycin Gibco 15070-063 Stock kept at -20 °C
B27 x50 (supplement) Gibco 17504-044 Stock kept at -20 °C
Recombinant Human FGF2 (bFGF) R&D 233-FB-025 Stock kept at -80 °C
Matrigel Corning 356231 Stock kept at -20 °C
Trypsin 0.05% Gibco 25300-054 Stock kept at 4 °C
RNAlater - RNA stabilizing reagent Qiagen 76104 Store at RT
Dispase  Sigma Aldrich D4818-2MG Working concentration: 1.25 mg/ml. Stock kept at -20 °C
BSA for reconstitution Milipore 81-068 For reconstituition of cytokines  - stock kept at -20 °C
Fetal calf serum (FCS) Gibco 16141079 Stock kept at -20 °C
60-well MicroWell trays Sigma Aldrich M0815-100EA
4-well plates Thermo Scientific 176740
95-well plates F bottom Greiner Bio 6555180
Glas bottom plates Ibidi 81158
Disposal glass micropipettes Blaubrand 708745
Microscope Cell® imaging station (motorized inverted Olympus IX81 stand) equipped with a Hamamatsu ORCA ER B7W camera and the Ludin Cube and Box.
Leica DMI6000 B stand surrounded with a Ludin Cube and Box, equipped with a Leica DFC365 FX camera and the AF6000 Expert/Matrix software command interface.
Objective Olympus UPLAN FL NA 0.30 air 9.50 mm 10X long distance;
Leica HC PL FLUOTAR NA 0.30 air 11.0 mm 10X long distance

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Pagliuca, F. W., Melton, D. A. How to make a functional beta-cell. Development. 140, 2472-2483 (2013).
  2. Percival, A. C., Slack, J. M. Analysis of pancreatic development using a cell lineage label. Exp Cell Res. 247, 123-132 (1999).
  3. Attali, M., et al. Control of beta-cell differentiation by the pancreatic mesenchyme. Diabetes. 56, 1248-1258 (2007).
  4. Johansson, K. A., et al. Temporal control of neurogenin3 activity in pancreas progenitors reveals competence windows for the generation of different endocrine cell types. Dev Cell. 12, 457-465 (2007).
  5. Speier, S., Rupnik, M. A novel approach to in situ characterization of pancreatic beta-cells. Pflugers Arch. 446, 553-558 (2003).
  6. Golosow, N., Grobstein, C. Epitheliomesenchymal interaction in pancreatic morphogenesis. Dev Biol. 4, 242-255 (1962).
  7. Miralles, F., Czernichow, P., Scharfmann, R. Follistatin regulates the relative proportions of endocrine versus exocrine tissue during pancreatic development. Development. 125, 1017-1024 (1998).
  8. Petzold, K. M., Spagnoli, F. M. A system for ex vivo culturing of embryonic pancreas. J. Vis. Exp. 3979 (2012).
  9. Miralles, F., Battelino, T., Czernichow, P., Scharfmann, R. TGF-beta plays a key role in morphogenesis of the pancreatic islets of Langerhans by controlling the activity of the matrix metalloproteinase MMP-2. J Cell Biol. 143, 827-836 (1998).
  10. Hope, K., Bhatia, M. Clonal interrogation of stem cells. Nat Methods. 8, 36-40 (2011).
  11. Sugiyama, T., Rodriguez, R. T., McLean, G. W., Kim, S. K. Conserved markers of fetal pancreatic epithelium permit prospective isolation of islet progenitor cells by FACS. Proc Natl Acad Sci U S A. 104, 175-180 (2007).
  12. Reynolds, B. A., Weiss, S. Generation of neurons and astrocytes from isolated cells of the adult mammalian central nervous system. Science. 255, 1707-1710 (1992).
  13. Dontu, G., et al. In vitro propagation and transcriptional profiling of human mammary stem/progenitor cells. Genes Dev. 17, 1253-1270 (2003).
  14. Smukler, S. R., et al. The adult mouse and human pancreas contain rare multipotent stem cells that express insulin. Cell Stem Cell. 8, 281-293 (2011).
  15. Seaberg, R. M., et al. Clonal identification of multipotent precursors from adult mouse pancreas that generate neural and pancreatic lineages. Nat Biotechnol. 22, 1115-1124 (2004).
  16. Jin, L., et al. Colony-forming cells in the adult mouse pancreas are expandable in Matrigel and form endocrine/acinar colonies in laminin hydrogel. Proc Natl Acad Sci U S A. 110, 3907-3912 (2013).
  17. Sugiyama, T., et al. Reconstituting pancreas development from purified progenitor cells reveals genes essential for islet differentiation. Proc Natl Acad Sci U S A. 110, 12691-12696 (2013).
  18. Huch, M., et al. Unlimited in vitro expansion of adult bi-potent pancreas progenitors through the Lgr5/R-spondin axis. Embo J. (2013).
  19. Sato, T., et al. Single Lgr5 stem cells build crypt-villus structures in vitro without a mesenchymal niche. Nature. (2009).
  20. Ootani, A., et al. Sustained in vitro intestinal epithelial culture within a Wnt-dependent stem cell niche. Nat Med. 15, 701-706 (2009).
  21. Barker, N., et al. Lgr5(+ve) stem cells drive self-renewal in the stomach and build long-lived gastric units in vitro. Cell Stem Cell. 6, 25-36 (2010).
  22. Huch, M., et al. In vitro expansion of single Lgr5+ liver stem cells induced by Wnt-driven regeneration. Nature. 494, 247-250 (2013).
  23. Lukacs, R. U., Goldstein, A. S., Lawson, D. A., Cheng, D., Witte, O. N. Isolation, cultivation and characterization of adult murine prostate stem cells. Nat Protoc. 5, 702-713 (2010).
  24. Rock, J. R., et al. Basal cells as stem cells of the mouse trachea and human airway epithelium. Proc Natl Acad Sci U S A. 106, 12771-12775 (2009).
  25. Eiraku, M., et al. Self-organizing optic-cup morphogenesis in three-dimensional culture. Nature. 472, 51-56 (2011).
  26. Spence, J. R., et al. Directed differentiation of human pluripotent stem cells into intestinal tissue in vitro. Nature. 470, 105-109 (2011).
  27. Lancaster, M. A., et al. Cerebral organoids model human brain development and microcephaly. Nature. 10, (2013).
  28. Greggio, C., et al. Artificial three-dimensional niches deconstruct pancreas development in vitro. Development. 140, 4452-4462 (2013).
  29. Muzumdar, M. D., Tasic, B., Miyamichi, K., Li, L., Luo, L. A global double-fluorescent Cre reporter mouse. Genesis. 45, 593-605 (2007).
Dağınık Fare Embriyonik progenitörlerin gelen <em>Vitro</em> Pankreas <em>organogeneziste</em>
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Greggio, C., De Franceschi, F., Figueiredo-Larsen, M., Grapin-Botton, A. In Vitro Pancreas Organogenesis from Dispersed Mouse Embryonic Progenitors. J. Vis. Exp. (89), e51725, doi:10.3791/51725 (2014).More

Greggio, C., De Franceschi, F., Figueiredo-Larsen, M., Grapin-Botton, A. In Vitro Pancreas Organogenesis from Dispersed Mouse Embryonic Progenitors. J. Vis. Exp. (89), e51725, doi:10.3791/51725 (2014).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter