Summary
Questo protocollo descrive l'uso di reazioni di accoppiamento ammide di acido isonicotinico e diaminoalkanes per formare leganti a ponte adatto per l'uso nella sintesi di complessi di platino multinucleate, che combinano aspetti dei farmaci antitumorali BBR3464 e picoplatin.
Introduction
Farmaci antitumorali Platinum rimangono uno della famiglia più utilizzato di agenti nel trattamento del cancro umano 1. Nonostante il loro successo, sono limitati nella loro applicazione da gravi effetti collaterali dose-limitante 2-4. Le dosi limitate che possono essere somministrate ai pazienti significa anche che i tumori possono sviluppare resistenza 5. Mentre continuano ad essere sviluppato per migliorare il profilo di effetti collaterali e di superare la resistenza acquisita, come phenanthriplatin 6 e 7 phosphaplatin tali, nuovi farmaci.
Alla fine del 1990, un farmaco trinuclear platino è stato sviluppato, BBR3464 (Schema 1) 8, cioè fino a 1.000 x più citotossica in vitro che il principale farmaco platino, cisplatino. BBR3464 è anche in grado di superare la resistenza acquisita in un pannello di linee cellulari tumorali umane 9. Purtroppo, l'aumento dell'attività di BBR3464 è accompagnato da 50 - 100 - volte maggiore tossicità, chene limita l'uso 10-12. Si è anche facilmente degradato nel corpo, cioè poco del farmaco raggiunge nuclei tumorali intatte 9.
Picoplatin è un farmaco a base di platino mononucleare che contiene un legante 2-metil-piridina (Schema 1) 13. Il gruppo metilico di questo farmaco protegge da attacchi di nucleofili biologici; in particolare cisteina e metionina contenente peptidi / proteine 14-16. Come tale, il farmaco è molto stabile ed ha una concentrazione molto più elevata che raggiunge nuclei tumorali rispetto sia BBR3464 e cisplatino 17. La sua reattività ridotta significa anche picoplatin ha una dose massima tollerata più elevata rispetto a BBR3464 e cisplatino 10,18,19.
Questo progetto ha quindi cercato di combinare le proprietà di BBR3464 e picoplatin per produrre nuovi farmaci che sono in grado di superare la resistenza acquisita da visualizzare per una migliore stabilità biologica e meno gravi side-effects (ad esempio, la Figura 1). In tal modo, una serie di complessi di platino diciclici stati preparati con leganti bispyridine ponte 20. I leganti sono realizzati utilizzando reazioni di accoppiamento ammide con acido isonicotinico, o suoi derivati come 2-metil-isonicotinico acido, diaminoalkanes lunghezza variabile. Reazione di un equivalente molare di ligandi con due equivalenti molari dei transplatin produce i complessi di platino desiderati (Schema 1).
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Protocol
1 Sintesi della N, N '-. (Alcano-1, n-diil) diisonicotinamide
- Essiccare un singolo collo o tre colli pallone a fondo tondo in un forno (100 ° C, 1 ora) per garantire tutta l'umidità viene rimossa.
- Aggiungere acido isonicotinico solido, o del suo derivato, al pallone con un agitatore magnetico. Se il ligando diaminoalkane (s) sono solidi a temperatura ambiente, poi 0,5 mole (al numero moli di acido isonicotinico) viene aggiunta al pallone in questa fase.
- Cap collo (s) del pallone con setti di gomma e sostituire l'aria nel pallone con azoto tramite un flusso di azoto continuo o attraverso l'uso di azoto riempito palloncini.
- Utilizzare un ago ipodermico e una siringa per aggiungere dimetilformammide o dimetilsolfossido anidro (4 ml per 500 mg di acido isonicotinico o acido 2-metil-isonicotinico) per dissolvere il solido. Se i solidi non si sciolgono facilmente, poi riscaldare lentamente la soluzione.
- Aggiungere 7 equivalenti talpa (al dimonte di acido isonicotinico usato) di trietilammina (base debole) e 0,5 equivalenti talpa del diaminoalkane. Se la soluzione è un liquido a temperatura ambiente, quindi aggiungere 1,5 equivalenti molari.
- Aggiungi un equivalente mole di anidride 1-propylphosphonic (agente di accoppiamento) con agitazione continua e consentire la reazione di completare più di 5-12 ore.
2. Purificazione dei leganti
- Per bispyridine ligandi realizzati con leganti diaminoalkane con 10 o più gruppi di metilene, attendere per i prodotti di precipitare dalla soluzione come la reazione progredisce.
- Per bispyridine ligandi realizzati con diaminooctane, precipitare il prodotto aggiungendo ~ 40 ml di acqua.
- Per bispyridine realizzato con diaminoalkanes di 2-6 gruppi di metilene, aggiungere ~ 40 ml di acqua e consente i composti di cristallizzare oltre 1-3 giorni.
- Raccogliere ogni ligando bispyridine mediante filtrazione sotto vuoto e ricristallizzare da circa 400-500 ml di acqua bollente per 200mg di ligando. Nota: è necessaria Più acqua per i ligandi più bispyridine grazie alla loro solubilità in acqua molto ridotto.
- Aggiungere NaOH e KOH (pH 9) alla soluzione per garantire che i composti sono basi libere su ricristallizzazione.
3. Sintesi e purificazione dei diciclici Platinum Complessi
- Sciogliere completamente trans-diamminodichloridoplatinum (II), transplatin, in (70-80 ° C) l'acqua calda (150 ml per 200 mg di transplatin) per produrre una soluzione colorata fortemente trasparente di colore giallo.
- Aggiungere un equivalente di 0,5 mole del ligando bispyridine e agitare la soluzione a temperatura fino a quando le si scioglie ligando (soluzione chiara). Attendere che la soluzione di girare vicino incolore, spegnere il fuoco, e mescolare a temperatura ambiente per un paio di ore aggiuntive.
- Eliminare il solvente per evaporazione rotante, che produrrà una polvere di colore giallo.
- Purificare, il complesso di platino (es) sciogliendo in una quantità minima di acqua calda (~ 50 &# 186; C). Se rimanenti solidi di colore giallo o bianco sono presenti, poi filtrare questi fuori.
- Aggiungere acetone alla soluzione fino a formazione di un precipitato bianco che sembra essere una forma polimerica di complessi metallici e rappresenta fino al 10% del prodotto di reazione. Continuare l'aggiunta di acetone (~ supplementari 20-30 ml) fino a quando appare non più precipitato. Nota: questo precipitato bianco è un'impurità.
- Rimuovi questo precipitato filtrando i contenuti attraverso carta da filtro di nylon (0,2 micron dimensione dei pori) e rotante evaporare la soluzione rimanente a secchezza, che produrrà un prodotto puro. Nota: Se necessario, quindi ulteriori passi acetone precipitazione possono essere eseguite fino a quando il complesso è puro.
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Representative Results
I ligandi bispyridine ei loro rispettivi complessi di platino diciclici sono caratterizzati da 1 H, 13 C e 195 Pt NMR (Tabelle 1 e 2), e spettroscopia di massa a ionizzazione elettrospray. Punti di fusione precisi possono essere determinate utilizzando la calorimetria differenziale a scansione e la purezza è meglio determinata mediante analisi elementare per C, H e N contenuto percentuale. Di maggiore utilità è 1 H NMR in quanto è veloce e facile da usare, dando risultati in pochi minuti di isolamento dei prodotti finali con risonanze che possono dimostrare definitivamente successo accoppiamento ammide e coordinazione del platino (Tabelle 1 e 2).
L'acido Isonicotinic ha tre risonanze; due doppietti nella regione aromatica (7 a 9 ppm) e una molto ampia risonanza a circa 13 ppm per il protone acido carbossilico. Le risonanze diaminoalkane protoni sono tutti situati nella regione alifatici tra 1 e 4 ppm. Come tegli lunghezza della catena aumenta diaminoalkane molte delle risonanze metilene diventa equivalente, e come tale, meno picchi sono osservate nella regione alifatico quanto ci si aspetterebbe; anche se sono più intenso e possono essere assegnati liberamente dai loro integrazioni (Tabelle 1 e 2). Ad esempio si vedano le figure 1 e 2 per la struttura chimica e 1 H NMR del N, N '- (1-ottano ,8-diil) bis (isonicotinamide), biao, ligando. Grazie alla simmetria nella molecola cinque risonanze alifatici quello che normalmente per biao; ma le quattro cime più metilene interni sono tutti magneticamente equivalenti e si presentano come una grande risonanza a ~ 1.2 ppm.
La risonanza protonica ammina della catena diaminoalkane disaccoppiato si trova nella regione alifatico e la risonanza è più importante che si muove in modo significativo a fondo campo, nella regione aromatica, su accoppiamento to l'acido carbossilico. La successiva risonanza protonica ammide è visto a circa 8,7 ppm per tutti questi ligandi, come una relativamente ampia tripletta risonanza (Figura 2).
Coordinamento del gruppo del platino ai ligandi bispyridine viene osservato attraverso spostamenti selettivi risonanze aromatiche del ligando (0,15 ppm downfield spostamento delle risonanze Ha e 0,07 ppm ci prova spostamento delle risonanze Hb) e l'osservanza di accoppiamento platino sulla risonanza doppietto per l' Ha protoni (Figura 3). Coordinamento dei gruppi di platino al ligando bispyridine può anche essere osservato agevolmente utilizzando 195 Pt NMR. Il chemical shift di risonanza platino è direttamente correlata ai tipi di atomi coordinati 21. Ligandi Chlorido spostano 195 risonanze Pt fondo campo (verso 0 ppm) e am (m) ino ligandi spostano le risonanze ci prova (verso -2500 ppm). I complessi di platino diciclici sintetizzati qui mostrano un unico r esonance circa -2300 ppm dovuto alla 3 x am (m) ino e 1 x stato coordinamento chlorido (Figura 4) 22. Reagito transplatin impurità mostrerebbe come una risonanza intorno -2100 ppm mentre se due leganti hanno reagito con una singola molecola transplatin (4 x am (m) ambiente ino), allora questa impurità sarebbe campi alti di -2400 ppm 22.
Schema 1 Le strutture chimiche dei farmaci platino picoplatin e BBR3464 e lo schema generale di sintesi per la sintesi dei leganti bispyridine ei loro rispettivi complessi di platino dinucleare.; R = H o CH 3; . n = 1-6 ioni di conteggio per i complessi di platino sono stati omessi; utilizzando il metodo qui descritto sono sali dicloruro.
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Figura 1 La struttura chimica della N, N '-.. (Ottani-1 ,8-diil) bis (isonicotinamide) ligando, Biao, e lo schema di numerazione protonica utilizzati per l'assegnazione delle risonanze nel 1 H NMR nota l'equivalenza dei quattro protoni di metilene (HE) nel centro della molecola.
Figura 2 Il 1 H NMR (DMSO-d 6, 400 MHz) spettro di N, N '-. (Ottani-1 ,8-diyl) bis (isonicotinamide), Biao Nota la posizione della risonanza tripletta amide a circa 8.7. ppm, fino 1-2 ppm per la risonanza diaminooctane ammina prima dell'accoppiamento.
Figura 3. L'1 H NMR (D 2 O, 400 MHz) Spettro di trans-[{Pt (NH 3) 2 Cl 2} μ-biao] 2 +. Noti l'accoppiamento platino sulla risonanza Ha aromatico a 8.82 ppm.
Figura 4. L'195 Pt NMR (D 2 O, 400 MHz) Spettro di trans-[{Pt (NH 3) 2 Cl}. 2 μ-Biao] 2 + Notare la singola ampia risonanza attorno -2300 ppm che è coerente con un ambiente PtN 3 Cl; N = am (m) ine.
Tabella 1 I 1 H NMR dati di caratterizzazione dei leganti bispyridine in DMSO-d 6 a 400 MHz d = doppietto..; t = tripletta; q = quartetto; m = multipletto.
Tabella 2. I 1 H NMR dati di caratterizzazione dei complessi di platino diciclici in D 2 </ Strong> O a 400 MHz d = doppietto.; t = tripletta; q = quartetto; m = multipletto.
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Discussion
In questo lavoro complessi dinucleari di platino sono stati sintetizzati come potenziali agenti antitumorali. In tal modo ligandi bispyridine ponte sono stati sintetizzati tramite una reazione di accoppiamento ammide utilizzando acido isonicotinico e diaminoalkanes lunghezza variabile. In precedenza sono stati riportati la sintesi di bispyridine ligandi e loro analoghi metilici con 2 a 8 gruppi di metilene e loro rispettivi complessi di platino. In questo documento, il metodo di sintesi e di purificazione è stata rivista rendendo più veloce e più economico e hanno dimostrato questa sintetizzando ligandi bispyridine con 8, 10 e 12 gruppi di metilene (il più breve con otto gruppi metilenici, biao, è stato fatto per confrontare la nuova metodo di purificazione per il vecchio metodo). Diciclici complessi di platino sono stati realizzati con questi ligandi.
La sintesi dei leganti bispyridine stata completata nel solvente anidro e sotto atmosfera inerte di azoto utilizzando trietilammina come una base debole eanidride propylphosphonic come l'agente di accoppiamento. Sia DMF o DMSO possono essere utilizzati come solvente, sebbene l'acido isonicotinico scioglie meglio in DMSO che fa in DMF. Per entrambi solvente, leggero riscaldamento sotto un ruscello di acqua calda può essere utilizzata per facilitare la soluzione.
Questo vecchio metodo richiesto tempi lunghi di reazione (diversi giorni) e un processo di purificazione a due fasi multiple compresa l'estrazione liquido / liquido contro etere dietilico e neutralizzazione con NaHCO3, che ora è eliminato. Le reazioni di sintesi ligando sono state completate in poche ore a temperatura ambiente dopo tutti i reagenti vengono sommati in un solo passo. I ligandi bispyridine precipitano dalla soluzione con l'aggiunta di acqua (per ligandi con 8 o meno gruppi metilene) e precipitano dalla soluzione sulla formazione per i 10 e 12 metilene ligandi gruppo. Tutti i ligandi possono essere ricristallizzato da acqua bollente e in alcuni casi la loro recrystall lentozazione può produrre cristalli adatti per diffrazione di raggi X.
I complessi di platino diciclici sono realizzati facendo reagire due moli di transplatin ad una mole di leganti bispyridine. L'effetto trans-labializing dei leganti chlorido assicura che il prodotto principale è il coordinamento dei farmaci platino attraverso un singolo sito su ligandi bispyridine (l'atomo di azoto dell'anello). I complessi di platino diciclici hanno una buona solubilità come sali dicatione sia in acqua, DMF e DMSO.
La purificazione viene ottenuta mediante precipitazione frazionata con acetone. L'impurità non identificato precipita prima che il prodotto e viene rimosso mediante filtrazione attraverso carta da filtro stretto poro. E 'importante notare che la precipitazione acetone funziona meglio con crescente quantità di prodotto da depurare. Al importi inferiori a 200 mg, il metodo non funziona così e precipitazioni acetone ripetuti può essere richiesto. Per gli importi di circa 200 mg opiù abbiamo scoperto che i singoli passi acetone precipitazioni sono generalmente richiesti solo.
Mentre dettagli Questa carta la sintesi di ligandi specifici e complessi di platino, le tecniche utilizzate qui possono essere applicate per sintetizzare una più vasta gamma di ligandi e complessi di platino multinucleate. Ad esempio, con gruppi protettivi adatti altri ligandi diaminoalkane, come spermina e spermidina, possono essere utilizzati per effettuare ligandi bispyridine. Ligandi bispyridine non simmetriche potrebbero anche essere effettuate utilizzando acido isonicotinico su un'estremità e 2-metil-isonicotinico acido sull'altra estremità. Questi leganti non simmetrici possono essere generate attraverso l'uso di FMOC / BOC-protezione su una estremità delle catene diaminoalkane. L'ammina protetta della catena può essere fatto reagire con un derivato isonicotinico base alle reazioni di accoppiamento ammidici descritti. Il gruppo protettore viene poi scisso dalla catena diaminoalkane e un derivato di acido isonicotinico differente è collegato tramite unaltra reazione di accoppiamento ammide. Trinucleari platino complessi potrebbero potenzialmente essere realizzati con qualsiasi di questi ligandi mediante l'adattamento di un metodo che utilizza leganti basati pirazolile fare trinuclear, BBR3464-like, complessi 22.
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Disclosures
Gli autori non hanno nulla da rivelare.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| D2O | Aldrich | 151882 | 99.9% D |
| DMSO-d6 | Aldrich | 156914 | 99.96% D |
| 1,8-diaminooctane | Aldrich | D22401 | 98% |
| 1,10-diaminodecane | Aldrich | D14204 | 98% |
| 1,12-diaminododecane | Aldrich | D1,640-1 | 98% |
| Isonicotinic acid | Aldrich | I17508 | 99% |
| 1-Propylphosphonic anhydride solution | Aldrich | 431303 | 50 wt% in ethyl acetate |
| Trans-diaminodichloridoplatinum(II) | Aldrich | P1525 | |
| Dimethylsulfoxide | Sigma-Aldrich | Z76855 | >99.9%, anhydrous |
| N,N’-dimethylformamide | Sigma-Aldrich | 227056 | 99.8%, anhydrous |
| Triethylamine | Sigma-Aldrich | T0886 | >99% |
| Nylon filter membranes | Whatman | 7402-004 | Pore size, 0.2 µm |
| Magnetic stirring hotplate | |||
| Magnetic stirring bar | |||
| Round bottom or three neck flask | |||
| Rubber septums of sufficient size for chosen round bottom or three neck flask | |||
| 5 ml hypodermic syringes | |||
| Hypodermic needles | |||
| Rubber party ballons | |||
| Rubber bands | |||
| A source of N2 gas | |||
| Rotary evaporator | |||
| Drying oven | |||
| NMR tubes | |||
| NMR spectrometer | |||
| 500 ml beakers | |||
| Glass or plastic pipettes |
References
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