Abstract
许多大脑相关的疾病具有参与其病理生理学的神经元细胞死亡。改进的体外模型来研究药物和涉及将有助于深入了解神经保护/神经毒性的分子机制和可能潜在地促进药物开发下游途径的神经保护或神经毒性作用。然而，许多现有的体外毒性实验有很大的局限性-大多数评估神经毒性和神经保护在一个单一的时间点，而不是让观察的时间过程和效果动力学。此外，机会来收集关于涉及神经保护中的实时下游信号传导途径的信息是非常重要的。在当前的协议中，我们描述了使用实时的基于阻抗的细胞分析装置，以确定血清素2A（5-HT 2A）受体激动剂在神经元细胞系在无标记和实时康迪特治疗作用使用阻抗测量离子。此外，我们证明，第二信使途径的抑制剂可用于描绘参与神经保护作用的下游分子。我们还描述了该技术的实用程序来确定对细胞增殖的效果，是否有助于所观察到的保护作用。该系统采用称为E-平板的包含交替的孔的底部表面的金微电极阵列上，作为细胞传感器专用微电子板。阻抗读出是通过贴壁细胞，细胞生存力，形态和粘附的数量进行修改。一种称为细胞指数无量纲参数是从所述电阻抗测量得到和用于表示该细胞的状态。总体而言，实时基于阻抗的细胞分析装置允许进行实时，神经保护和神经毒性的无标记的评估，以及第二信使途径参与了评价，有助于更在体外的潜在的神经保护化合物的详细的和高通量的评估，选择治疗的候选人。
Introduction
神经细胞死亡起到许多脑相关疾病1的病理生理学中起关键作用。的可靠和高通量的体外毒性试验的可用性是至关重要的，以获得更好的洞察神经毒性的作用机制并帮助选择神经保护分子作为治疗候选药物开发2。不过，也有不少限制使用最广泛的体外神经毒性assays.They评估神经毒性/神经保护在单一时间点不让动力学拆分;经常使用的标签或探针可与信号通路干扰，并在同一细胞群限制进一步的研究，并且通常是劳动密集型的，并且在许多情况下，不提供机械性的认识。在本研究中我们展示了一个实时的阻抗为基础的细胞分析仪的实用程序来确定神经毒性和神经保护作用的实时，并在神经元细胞系无标签条件，并通过所涉及到的作用的第二信使途径的分析洞察下游机制。
先前的研究已经证实了实时细胞分析的有效性，以确定在标准技术3,4,5,6对比的细胞毒性以及对细胞系的细胞增殖的影响。例如，在标准细胞存活力WST-1法的读数与细胞指数值之间观察到几个时间点下基底扩散条件和HeLa细胞3两种不同的有毒范式后的良好相关性。在A549和MDA-MB-231细胞增殖和细胞毒性挑起与微管 稳定剂紫杉醇表现出非常相似的值时，通过细胞指数测量，评估和标准地使用磺酰罗丹明B（SRB）法4。在永生的海马神经元的神经细胞系HT-22细胞指数测量，验证了自己的能力吨ö检测细胞增殖，谷氨酸毒性和细胞保护作用对广泛使用的3（4,5 -二甲基-2-基） - 2,5 -二苯基溴（MTT）法5。在同一研究中的MTT法检测结果和细胞指数测量也由泛Caspase抑制剂QVD 5个测量神经元祖细胞的增殖，细胞毒性后的生长因子剥夺和细胞毒性的救援很好的相关性。细胞毒性通过凡德他尼（血管内皮生长因子受体和表皮生长因子受体抑制剂）诱导的NIH 3T3细胞显示出与细胞指数值或中性红摄取试验6测定结果相似。
我们最近使用的实时细胞分析系统，以评估血清素2A的神经保护作用（5-HT 2A）受体激动剂（±）-2,5 -二甲氧基-4-iodoamphetamine盐酸盐（DOI）的神经元细胞系（ SK-N-SH细胞），并筛选山高的参与通过监测上观察到的神经保护7的化学抑制的效果第二信使通路。有趣的是，对5-HT 2A受体具有两个致幻和nonhallucinogenic激动剂（如DOI和麦角乙脲，分别），其可以激活两个共同和不同的第二信使通路8。
所提出的技术的优点是，它允许收集在天的过程中对细胞存活的实时信息，划定第二信使途径参与其中，以评估增殖效应的神经保护作用的可能贡献，并选择一个最佳的时间为在相同的细胞群附加端点研究。在当前的协议的工作流程的示意图示于图1。
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Protocol
1，准备工作
- 将实时细胞分析仪的台在组织培养箱设定为37℃，并用5％的CO 2。完成所有的细胞培养操作和药物治疗在无菌条件下，组织培养罩。
- 注：神经元细胞系中，需要不同的温度设置进行比较，以对培养的标准条件下，应作相应的调整。对于弱粘附细胞系，用包衣剂，以促进细胞的金微电极中的电子板96的孔的底部的相互作用。
- 制备1,000倍原液的药理化合物用于细胞培养的治疗（神经保护剂或第二信使通路的抑制剂，在适当的溶剂 - 二甲亚砜或无菌水），并将其存储在-20℃。使用溶剂作为车辆在以下的处理。
- 培养人成神经细胞瘤SK-N-SH细胞在DMEM / F12培养基中在细胞培养烧瓶中的10％胎牛血清（FBS）（增殖培养基）175 cm 2的表面到约75％的密度。保持一个范围（约10次传代）中的细胞传代次数，以确定在细胞增殖和响应于细胞毒性率方面的实验之间的一致性。最好是通过较低的数字。
- 用PBS洗涤附着的SK-N-SH细胞层，并trypsinize与在37℃5分钟，0.05％胰蛋白酶-EDTA溶液。离心将细胞在170×g下5分钟以除去胰蛋白酶。悬浮细胞在10毫升增殖培养基。计数细胞与权杖细胞计数，并通过与增殖培养基稀释细胞调节细胞数至300,000个细胞/ ml。
2，电镀和SK-N-SH细胞增殖
- 加入100μl扩散介质向E-Plate 96上的每个孔中，将其放置在组织培养罩在室温下平衡30分钟。将E-解放军TE 96中在37℃下的实时细胞分析站中的CO 2培养箱中培养。
- 启动实时细胞分析软件。在布局页面选择包括在实验孔中，并在编辑框中输入有关的细胞类型，细胞数目，名称和用于细胞治疗的化学化合物的浓度的信息。
注：在本协议的目的，至少4个重复，建议每次治疗。 - 在计划软件页确定包括在该实验中，通过选择扫描测量细胞指数和扫描的每个步骤之间的时间间隔的数目“步骤”。自第1步是预定为背景测量，选择“添加步骤”，并设置第2步以测量细胞指数每隔15分钟进行96小时。
注：对于治疗，其中具有快速反应动力学的影响，预计在较短的时间间隔设置扫描。 - 单击开始启动自动预定第1步和测量介质的背景阻抗。此值由软件自动在每个数据点减去一旦细胞被加入到孔中。
- 使用300,000个细胞/ ml的先前在步骤1.5的方法制备）的细胞悬浮液中的扩散介质。 30,000个细胞/孔的细胞毒性/神经保护研究和15,000个细胞/孔细胞增殖的研究。取出电子盘，加入100微升细胞悬液，每孔的细胞毒性/神经保护作用的研究，加入50微升细胞悬液和50微升增殖培养基，每孔细胞增殖的研究。需要细胞每孔接种的数量必须为每个细胞系凭经验优化。
- 轻轻摇动电子盘96连电镀细胞。离开E-板96在组织培养罩在RT以使细胞沉淀均匀地向孔的底部30分钟。
- 插入电子板96中的实时细胞分析站，并开始在计划页的步骤2年龄。通过查看绘图页面和软件的细胞指数页面上的原始细胞指数数据在细胞曲线监测整个实验细胞指数值。
3，血清剥夺
- 电镀细胞24小时后，暂停该实验中，并从实时细胞分析站取出电子板96。稀从1,000X股第二信使抑制剂的DMEM / F12无血清介质 - 以200×的最终浓度。治疗细胞的第二信使通路1μl的抑制剂，以用于其在神经/神经保护前30分钟开始的细胞毒作用的参与进行测试，以抑制各通路。返回电子盘96台，恢复实验细胞指数的测量。
- 30分钟后，再次暂停实验。小心地从电子盘全面清除增殖培养基中96井用移液管（或者多道移液器），注意不要破坏贴壁细胞层通过将移液管尖的边缘到阱的角落。加入200μl/无血清的DMEM / F12培养基（血清饥饿培养基）中的井。确保细胞培养基的快速交换，以最小化细胞的机械搅拌。
- 稀释的化合物其从1,000X股票神经保护作用的无血清DMEM / F12培养基，以200×的最终浓度进行试验。加入1μl化合物对于其治疗作用和对第二信使通路中的各个孔中加入1μl酶抑制剂根据实验方案进行测试。
- 在细胞增殖的研究并没有改变中。稀释的化合物可以从1,000X库存进行测试，以200×在增殖培养基中的最终浓度，治疗与每孔1微升，并继续培养中增殖培养基。
- 恢复实验继续进行细胞指数的测量，每15分钟进行96小时为预先设定的。
4，数据Analysis
- 对于神经毒性/神经保护数据的标准化细胞指数，以药物治疗或换液前的最后一个时间点，选择“正常化细胞指数”，以减少实验之间的差异和“规范化时代”的情节页面上。
- 突出显示绘图页上的井感兴趣的实验条件，然后点击“添加”来绘制归一化细胞指数曲线。观察的神经毒性/神经保护作用的，或第二信使抑制作为归一化的细胞指数曲线作为时间的函数的动力学。
- 观察细胞指数曲线测试的药物治疗在增殖培养基中作为时间的函数来评估是否参与了神经保护/神经毒性作用，对细胞增殖的效果。
- 出口从细胞指数的软件页面中的所有细胞指数的时间点实验信息到一个Excel文件来启动结果进行统计评估
- 对于不同的处理条件下在特定时间点在细胞指数值的差异的统计分析，在从该导出的Excel文件中各个时间点选择细胞指数值。具有单向或双向方差分析（ANOVA），接着利用统计软件的事后检验分析所选择的时间点的细胞指数值。
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Representative Results
血清剥夺导致在细胞指数值，它可以连续地实时细胞分析仪进行监测，以减少
神经刺激的细胞导致的降低细胞指数值，它可在实时的呈现技术和动态这是依赖于特定的神经刺激和研究的细胞类型进行监测。 图2显示了增加的当SK-N-SH细胞生长在增殖培养基中，直到达到平台（绿线）和细胞指数的下降之后稳定在新的水平较低的开关的细胞血清剥夺介质（红色线）后的细胞指数。这种下降可能代表因撤血清中细胞粘附的变化。
药物治疗的神经保护作用可以持续地与实时细胞分析仪进行监测
“>之前（预处理）中加入化合物中，在同一时间（辅助治疗）或神经毒性刺激后（这表明细胞回收）的神经保护作用，也可以连续地实时细胞分析仪后面，从而提供了关于信息。率和神经保护作用的持续时间图3示出了两个5-HT 2A受体激动剂的神经保护作用的动力学的代表性结果- 5μM的DOI（ 图3A）和20μM的麦角乙脲（ 图3B）中加入在开关单元到时缺乏血清培养基。实时细胞分析仪允许对细胞存活和细胞增殖的效果来区分
在神经保护研究的重要问题在神经元细胞是细胞增殖的作用是否有助于对细胞生存所观察到的复合效应。与实时细胞肛门yzer上增殖的效果可以用相同的E-板进行测试96评估神经毒性。 图4显示了缺乏对SK-N-SH细胞增殖为5μMDOI治疗的效果，这表明在细胞增殖的效果不向观察神经保护作用。
实时细胞分析允许确定其第二信使途径参与神经保护/神经毒性作用
受体激活启动的第二信使作用的级联。当前协议允许以筛选了许多第二信使在实时神经保护/神经毒性作用的参与，通过预处理和它们的抑制剂。自的第二信使的作用，对细胞存活的抑制剂可以显着，并且在许多情况下不随时间呈线性，以下的动力学是非常丰富的， 图5呈现为10μMPHOS效果phatidylinositol 3 - 激酶（PI3-K）抑制剂LY294002对细胞存活和DOI神经保护作用在血清剥夺的SK-N-SH细胞。在图中呈现，10μMLY294002防止DOI的神经保护作用的血清剥夺，但也有其自身的一些毒性作用。
有关第二信使途径和抑制剂浓度为每测试的化合物可通过文献检索来确定。第二信使抑制剂浓度适宜性已经得到验证，并在需要时优化实验。优化的目标是选择的浓度，这对由自身细胞指数值的影响最小，同时仍抑制有效的各自的第二信使。作为一个例子，一些第二信使通路的抑制剂，它可以是相关的5-HT 2A受体，在表1中给出这些抑制剂先前已经用于评估所涉及的分机号码的血清素能增加下游目标racellular信号调节激酶磷酸化9。我们已经表明它们的效用，确认后，在某些情况下，优化它们的浓度为我们的实验范例7，以评估5-HT 2A受体的激动剂牵涉于神经保护下游途径。
图1：在当前协议提出的工作流程示意图。 请点击这里查看该图的放大版本。
血清剥夺对细胞指数，血清剥夺图2的影响 （红色线）诱导迅速下降，细胞指数相比，在增殖培养基（绿线）细胞指数值逐渐增加。 请点击这里查看该图的放大版本。
对细胞指数的5-HT 2A受体激动剂血清剥夺之后，图3的影响。治疗与细胞保护药（在该实验中的5-HT 2A受体激动剂DOI（5μM）（A）（品红色线）和麦角乙脲（20μM）（ 乙 ）（深紫红色线）部分恢复细胞指数值下降了血清饥饿（红线）。 请点击这里查看这个数字的放大版本。
在细胞增殖过程中，治疗药物的扩散介质如图4细胞指数值 （在当前的实验5μM，DOI）（品红色系）允许评估与载体治疗相比（绿线）上增殖的影响。 请这里查看这个数字的放大版本。
图5第二信使抑制剂可影响细胞存活对自己和可用于画面的上OBSE第二信使通路的影响rved神经保护作用，在该实验中的细胞进行血清剥夺所治疗用载体（红色线），1μM的DOI（品红色系），预先用10μM的PI3-K抑制剂LY294002和与1μM的DOI（蓝线）或预处理的处理用10微米的LY294002和车辆（黑线）处理。 请点击这里查看该图的放大版本。
表1：第二信使的抑制剂，它可以是相应于在实时细胞分析实验中使用由我们的5-HT 2A受体的下游通路和它们的浓度的例子。
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Discussion
当前协议提出了一种实时的细胞分析仪的实用程序，在连续和无标记的条件下评估的化合物在神经元细胞系中的神经保护/神经毒性作用，并深入了解所涉及的效果的第二信使途径。
即使在实时细胞分析仪的实用程序来研究细胞毒性和药物对细胞增殖的影响一般认为，只有很少的研究已经在神经元相关的细胞类型中使用它。我们先前的研究显示了实时细胞分析仪的实用程序来监视人神经母细胞瘤SK-N-SH细胞中5-HT 2A受体激动剂的神经保护作用，而加兰特等人 ，已经表明它可用于评估的神经毒性的β-淀粉状蛋白肽在人成神经细胞瘤SH-SY5Y细胞7,10。最近的一项研究表明，虽然测得的实时细胞分析仪可靠的细胞增殖和细胞死亡的euronal细胞和神经元前体细胞，其在评估细胞死亡的原代神经元的精度取决于污损5的严重性。重要的是，用于实时细胞分析系统的交流电流是非常低的量值，产生微安的电流。这些电流远低于可兴奋细胞如神经元的阈值电位。实时细胞分析系统依赖于阻抗测量从E-Plate 96上的孔的底表面上，因此，细胞粘附的程度是至关重要的。可能的是在E-板孔与胞外基质蛋白为更好附着的涂料的进一步优化可以改善与原代神经元获得的结果。
当前手稿展示了一种新的使用实时细胞分析系统来描绘参与神经保护作用的第二信使途径的方法。我们的协议依赖于第二展览的化学抑制作用能参与神经保护剂的作用NGERS假设。表1列出了一些常用的第二信使通路的抑制剂，它可以是相关的5-HT 2A受体，例如，其浓度适合于所呈现的实验范式。本实验设计允许的潜在相关的第二信使途径快速筛选，通过互补的方法来选择更详细的研究下游目标。
实时细胞分析仪的一个重要优点是也以评估对细胞增殖的作用是否是一个观察到的神经保护作用的一部分的能力。利用神经细胞系，而不是毒性实验小学的神经元提供了一些优势，如成本低，容易获得，无需进行动物实验。然而，由于这一事实，即在对比原代神经元的神经元细胞系的增殖，需要对细胞增殖的潜在影响被控制为在神经毒性试验。机会的实时细胞分析仪提供了在相同的实验电子板96执行这样的控制，有利于实验设计。
几个工艺参数需要与实时细胞分析实验来加以考虑。要电镀的细胞数，每孔应凭经验通过滴定实验为每个测试的细胞类型来确定。细胞毒性和增殖治疗的细胞在培养开始后24小时之后都启动，以使细胞的充分的粘附性。在细胞毒性实验最佳结果开始时，细胞已经达到65-70％融合是在当前协议获得的。对于增殖实验较低的电池汇合是首选（20-30％），按照药物的扩散曲线的影响。
在当前的协议血清剥夺的神经毒性模式是由于其坚固性呈现，易用性和实用的近似营养剥夺介导的神经元死亡，这是发展的，急性脑或神经损伤，神经退行性疾病和11中很重要的。然而，可以使用实时细胞分析系统中的广泛的神经毒性范式。在这里，共治疗在细胞毒性时的细胞保护剂呈现。但是，前处理或治疗的毒性事件（评估细胞回收）之后，也可以根据不同的化合物被测试使用。
总体而言，目前的协议提出了一个实时细胞分析系统的实用性，不断和无标记评估神经毒性和神经保护作用的神经细胞系，并深入了解参与这些影响下游通路。
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Disclosures
当前视频文章出版费用由“ACEA Biosciences公司”进行了赞助。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| xCELLigence RTCA SP system bundle | ACEA Biosciences | No: 00380601030 | Consists of RTCA Analyzer, RTCA SP Station and RTCA Control Unit |
| E-plate 96 | ACEA Biosciences | No: 05232368001 | For culturing the cells, inserted in the RTCA SP Station |
| SK-N-SH cells | ATCC (in partnership with LGC Standards) | HTB-11 | Can be replaced by another adherent neuronal cell line of interest |
| DMEM/F12 | Sigma-Aldrich | D8437 | Cell culture medium |
| Fetal bovine serum | Life Technologies | 16140-063 | Supplements proliferation, but not serum deprivation medium |
| Tissue culture flask T175 | Sarstedt | 83.1812.302 | For culturing cells, which will be later plated on the E-Plate 96 |
| 0.05% Trypsin-EDTA | Life Technologies | 25300-054 | For trypsinization of cells cultured in tissue culture flasks |
| Scepter 2.0 cell counter | Merck Millipore | PHCC20060 | Automated cell counter |
| Phosphate-buffered saline | Life Technologies | 10010-015 | For washing the cells |
| (±)-DOI hydrochloride | Sigma-Aldrich | D101 | 5-HT2A agonist for cell culture treatment |
| LY-294002 hydrochloride | Sigma-Aldrich | L9908 | PI3-K inhibitor for cell culture treatment |
| Lisuride maleate | Tocris Bioscience | 4052 | Compound with 5-HT2A agonistic activity for cell culture treatment |
| Dimethyl sulfoxide | Sigma-Aldrich | D4540 | For dissolving LY-294002 and lisuride maleate |
References
- Cavallucci, V., D'Amelio, M. Matter of life and death: the pharmacological approaches targeting apoptosis in brain diseases. Curr. Pharm. Des. 17 (3), 215-229 (2011).
- Bull, S. HPA CHaPD 001: Review of Environmental Chemicals and Neurotoxicity. Focus on Neurological Diseases. , Health Protection Agency. (2007).
- Ke, N., Wang, X., Xu, X., Abassi, Y. A. The xCELLigence system for real-time and label-free monitoring of cell viability. Methods Mol. Biol. 740, 33-43 (2011).
- Limame, R., et al. Comparative analysis of dynamic cell viability, migration and invasion assessments by novel real-time technology and classic endpoint assays. PLoS One. 7 (10), e46536 (2012).
- Diemert, S., et al. Impedance measurement for real-time detection of neuronal cell death. J. Neurosci. Methods. 203 (1), 69-77 (2012).
- Kustermann, S., et al. A label-free, impedance-based real time assay to identify drug-induced toxicities and differentiate cytostatic from cytotoxic effects. Toxicol In Vitro. 27 (5), 1589-1595 (2013).
- Marinova, Z., Walitza, S., Grünblatt, E. 5-HT2A serotonin receptor agonist DOI alleviates cytotoxicity in neuroblastoma cells: role of the ERK pathway. Prog. Neuropsychopharmacol. Biol. Psychiatry. 44, 64-72 (2013).
- González-Maeso, J., et al. Hallucinogens recruit specific cortical 5-HT(2A) receptor-mediated signaling pathways to affect behavior. Neuron. 53 (3), 439-452 (2007).
- Tsuchioka, M., Takebayashi, M., Hisaoka, K., Maeda, N., Nakata, Y. Serotonin (5-HT) induces glial cell line-derived neurotrophic factor (GDNF) mRNA expression via the transactivation of fibroblast growth factor receptor 2 (FGFR2) in rat C6 glioma cells. J. Neurochem. 106 (1), 244-257 (2008).
- Galante, D., et al. Differential toxicity, conformation and morphology of typical initial aggregation states of Aβ1-42 and Aβpy3-42 beta-amyloids. Int. J. Biochem. Cell. Biol. 44 (11), 2085-2093 (2012).
- Sheline, C. T., Cai, A. L., Zhu, J., Shi, C. Serum or target deprivation-induced neuronal death causes oxidative neuronal accumulation of Zn2+and loss of NAD. Eur. J. Neurosci. 32, 894-904 (2010).
