Abstract
इस वीडियो प्रोटोकॉल का उद्देश्य एक संशोधित दो photon माइक्रोस्कोप 1 का उपयोग कर एक तीन आयामी फ्लोरोसेंट कक्षीय कण ट्रैकिंग प्रयोग और विश्लेषण के लिए चर्चा करने के लिए है. परंपरागत तरीके (रेखापुंज स्कैन या फ्रेम के ढेर पर आधारित व्यापक क्षेत्र) के लिए विरोध के रूप में, 3 डी कक्षीय ट्रैकिंग स्थानीय बनाना और एक उच्च स्थानिक (10 एनएम सटीकता) और लौकिक संकल्प (50 हर्ट्ज आवृत्ति प्रतिक्रिया) के 3 डी विस्थापन के साथ पालन करने के लिए अनुमति देता है माइक्रोन 2 के सैकड़ों की लंबाई तराजू पर एक चलती फ्लोरोसेंट कण. विधि लगाया जा वस्तु के चारों ओर एक परिपत्र कक्षा प्रदर्शन करने के क्रम में एक दो photon लेजर स्कैनिंग खुर्दबीन के हार्डवेयर को नियंत्रित करता है कि एक प्रतिक्रिया एल्गोरिथ्म पर आधारित है: प्रतिक्रिया तंत्र के विस्थापन को नियंत्रित करने से केंद्र में फ्लोरोसेंट वस्तु बनाए रखना होगा स्कैनिंग बीम 3-5. इस तकनीक का लाभ प्रदर्शित करने के लिए, हम अल भीतर एक तेजी से बढ़ organelle, लाइसोसोम, पीछाiving सेल 6,7. प्रकोष्ठों मानक प्रोटोकॉल के अनुसार चढ़ाया, और एक व्यावसायिक रूप से लाइसोसोम डाई का उपयोग दाग रहे थे. हम जीवित कोशिकाओं के अंदर एक 3 डी कक्षीय ट्रैकिंग प्रयोग को करने के लिए, संक्षेप में हार्डवेयर विन्यास और अधिक विस्तार में नियंत्रण सॉफ्टवेयर पर चर्चा की. हम विस्तार से खुर्दबीन स्कैनिंग नियंत्रण और कण के चारों ओर एक बंद कक्षा में बीम की गति को सक्षम करने के लिए आवश्यक मापदंडों पर चर्चा की. हम इस पद्धति को प्रभावी ढंग से एक जीवित कोशिका के भीतर 3 डी में सूक्ष्मनलिकाएं साथ एक लेबल लाइसोसोम की तेज गति को ट्रैक करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है कि कैसे प्रदर्शन से समाप्त. लाइसोसोम आमतौर पर microtubule नेटवर्क 8 के साथ एक निर्देशित गति प्रदर्शित 0.4-0.5 मीटर / सेकंड की सीमा में गति के साथ स्थानांतरित कर सकते हैं.
Introduction
दृष्टिकोण की एक बड़ी संख्या में एक माइक्रोस्कोप का उपयोग तीन आयामों में फ्लोरोसेंट कणों को ट्रैक करने के लिए तिथि करने के लिए विकसित किया गया है. अधिकांश दृष्टिकोण आदर्श आम तौर पर अक्षीय दिशा में ट्रैकिंग प्राप्त करने के लिए माइक्रोस्कोप का उत्सर्जन प्रकाशिकी के अनुकूलित संशोधनों के साथ संयुक्त दो आयामों में ट्रैक करने के लिए अनुकूल है, जल्दी कैमरों के उपयोग पर निर्भर हैं. इस प्रक्रिया उचित समय संकल्प (10 हर्ट्ज) आम तौर पर समय लगता है, और पैदावार हालांकि पारंपरिक कण है पता लगाया जा रहा है, तभी Z-ढेर की एक समय अनुक्रम प्रदर्शन से एक फ्लोरोसेंट कण ट्रैक कर सकते हैं (confocal या दो फोटॉनों या तो) लेजर स्कैनिंग सूक्ष्मदर्शी एक सक्रिय प्रतिक्रिया तंत्र 2 द्वारा एक छोटे रेखापुंज इमेजिंग क्षेत्र के केंद्र में रखा.
लॉकिंग-में कण के विचार कक्षीय ट्रैकिंग पद्धति का आधार है. इसके बजाय एक रेखापुंज के एक परिपत्र कक्षा फ्लोरोसेंट कण के आसपास किया जाता है स्कैन. साथ प्रतिदीप्ति की तीव्रताकक्षा ठीक कण स्थिति 4 localizes.
कण की स्थानीयकृत स्थिति तो माइक्रोस्कोप स्कैनर और फिर से केंद्र कण स्थिति पर कक्षा अत्यधिक इस्तेमाल किया जा सकता है. माइक्रोस्कोप के गैल्वेनोमीटर स्कैनर एक एनालॉग वोल्टेज से प्रेरित हैं. इस वोल्टेज के एसी घटक एक साइन और एक परिपत्र कक्षा प्रदर्शन की अनुमति देगा एक्स और वाई स्कैनिंग दर्पण के लिए लागू एक कोज्या लहर यानी, लेजर बीम ध्यान केंद्रित के साथ एक कक्षा के प्रदर्शन की अनुमति देता है. संकेत की भरपाई डीसी कक्षा केन्द्र की स्थिति को बदलने की सुविधा. एक कक्षा की अवधि निर्धारित किया जाता है और एसी संकेत के लिए तरंग विन्यस्त हो जाता है, अपनी प्रतिक्रिया में संकेत के ही डीसी घटक को अद्यतन करने की जरूरत है.
डिटेक्टरों से एकत्र फ्लोरोसेंट संकेत पढ़ने में सक्षम एक सॉफ्टवेयर डीसी बंद, स्कैनर और डिटेक्टरों को नियंत्रित करने के कण की स्थिति की गणना करने और अद्यतन की आवश्यकता हैसेट. कक्षा मानकों (आकार और समय) के एक सावधान चयन इमेजिंग एक सफल प्रतिक्रिया के लिए आवश्यक है और इन मानकों यह ट्रैक करने के लिए आवश्यक है कि फ्लोरोसेंट कणों की विशेषताओं पर आधारित समायोजित करना है.
तकनीक की भौतिक और गणितीय नींव 2 डी और 3 डी अनुप्रयोगों दोनों के लिए पिछले 4,5 में वर्णित किया गया. इस प्रोटोकॉल में हम संक्षेप में सेटअप के मुख्य हार्डवेयर घटकों का वर्णन है, और अधिक विस्तार में मापदंडों का चुनाव और नमूना तैयार एक जीवित कोशिका के भीतर एक उच्च अस्थायी समाधान पर एक लाइसोसोम के विस्थापन निम्नलिखित हमें की अनुमति एक ठेठ प्रयोग के लिए जरूरी है.
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Protocol
1 नमूना तैयार
- 10% भ्रूण गोजातीय सीरम और पेनिसिलिन 50 स्ट्रेप्टोमाइसिन की माइक्रोग्राम / एमएल की 100 आइयू / एमएल के साथ पूरक DMEM का उपयोग टिशू कल्चर बोतल में CHOK1 कोशिकाओं को बनाए रखें. 37 डिग्री सेल्सियस पर एक 5% सीओ 2 humidified इनक्यूबेटर में कोशिकाओं को सेते हैं.
- हार्वेस्ट फिर 0.16 मिमी की सतह मोटाई के साथ एक 14 मिमी व्यास सूक्ष्म अच्छी तरह पर CHOK1 कोशिकाओं प्लेट और. 60-70% confluency आसपास इमेजिंग के लिए इष्टतम घनत्व, के लिए बीज कोशिकाओं.
- 37 डिग्री सेल्सियस पर रातोंरात कोशिकाओं को सेते हैं, 5% सीओ 2. हरे और ट्यूबिलिन ट्रैकर हरी की 150 एनएम Lysotracker DND26 के 50 एनएम युक्त समाधान में कोशिकाओं HBSS (हांक buffered खारा समाधान) में कोशिकाओं तीन बार धोएं, और सेते हैं. 37 डिग्री सेल्सियस पर 1 घंटे के लिए कोशिकाओं को सेते हैं. वैकल्पिक कदम: ऊष्मायन से पहले, एक mitochondrial मैट्रिक्स धुंधला डाई (25 एनएम) के साथ एक अतिरिक्त दाग प्रदर्शन करते हैं.
- किसी भी अपार डाई हटाने के लिए HBSS में कोशिकाओं तीन बार धोएं. Imag करने से पहले ताजा DMEM मध्यम विकास जोड़ेंकोशिकाओं आईएनजी.
2 माइक्रोस्कोप विन्यास
वीडियो प्रोटोकॉल में वर्णित कण ट्रैकिंग के लिए माइक्रोस्कोप एक व्यावसायिक रूप से उपलब्ध उलटा माइक्रोस्कोप (चित्रा 4) के फ्रेम पर इकट्ठा किया है. 3 डी कक्षीय कण ट्रैकिंग के लिए हालांकि वाणिज्यिक मॉड्यूल अब उपलब्ध हैं.
- 690 एनएम 1,040 एनएम के बीच एक tunable उत्पादन तरंगदैर्ध्य रेंज के साथ, सा femtosecond लेजर उत्तेजना प्रकाश स्रोत: एक सुसंगत गिरगिट अल्ट्रा द्वितीय तिवारी का प्रयोग करें.
- लेजर बीम आईआर में लिपटे शीशे का उपयोग कर खुर्दबीन के पीछे बंदरगाह में गठबंधन किया है कि सुनिश्चित करें. लेजर बीम एक केल्साइट रेखीय polarizer के बाद घूर्णन आधे लहर प्लेट का उपयोग तनु है. नमूना में बिजली की औसत 0.5 और 2 मेगावाट के बीच इतना है कि किरण attenuate.
नोट: लेजर बीम नमूना विमान में केंद्रित बीम की स्थिति और प्रक्षेपवक्र के नियंत्रण की अनुमति है कि गैल्वेनोमीटर मोटर actuated दर्पण की एक जोड़ी से परिलक्षित होता है. में एककम पास dichroic दर्पण पर प्रतिबिंब के बाद खुर्दबीन उद्देश्य के पीछे प्रवेश करने से पहले, एक किरण विस्तारक से गुजर गैल्वेनोमीटर दर्पण के बाहर निकलने collimated लेजर बीम का विस्तार किया है ठेठ विन्यास (10X). - प्रकाश पथ में एक उच्च संख्यात्मक एपर्चर पानी उद्देश्य (60X, एनए 1.2) रखकर नमूना से प्रतिदीप्ति प्रकाश लीजिए. या तो एक या दो चैनल विन्यास में वांछित उत्सर्जन तरंग दैर्ध्य के अनुसार एक प्रतिदीप्ति फिल्टर घन चुनें. आगे उत्सर्जित प्रतिदीप्ति की वर्णक्रमीय रेंज का चयन करने के उत्सर्जन bandpass फिल्टर रोजगार.
- एक मोटर चालित मंच पर नमूना, जगह और एक उद्देश्य piezo नियंत्रक का उपयोग कर खुर्दबीन उद्देश्य के ठीक गति समायोजित करें.
- संकेत भेदभाव और एक डिजिटल मैं / हे डाटा अधिग्रहण कार्ड के लिए भेजा जाता है, जहां photomultiplier ट्यूब में फिल्टर क्यूब से प्रकाश प्रत्यक्ष.
नोट: कंप्यूटर waveforms मैं / हे कार्ड के अनुरूप उत्पादन कर रहे हैं और प्रदान कर रहे हैं उत्पन्नस्कैनर के लिए एड इलेक्ट्रॉनिक्स नियंत्रित करते हैं. photomultipliers और स्कैनर के लिए उत्पादन में संकेत से फोटॉन गिनती इनपुट मापा और प्रतिदीप्ति गतिशीलता SimFCS सॉफ्टवेयर के लिए प्रयोगशाला से आई / ओ कार्ड के माध्यम से नियंत्रित कर रहे हैं.
3 इमेजिंग
- मंच पर कोशिकाओं स्थिति और प्रेषित प्रकाश रोशनी का उपयोग ध्यान केंद्रित.
- डाई को शामिल किया है कि कोशिकाओं की पहचान करने के लिए और अंतर्निहित सूक्ष्मनलिकाएं कल्पना करने के लिए रेखापुंज स्कैन इमेजिंग में बदलें. पुटिका आंदोलन मौजूद है, जहां प्रारंभिक क्षेत्र को पहचानें.
- एक अलग पुटिका पहचान की है, कक्षीय ट्रैकिंग के लिए निम्नलिखित मानकों सेट:
- कण के आकार पर नज़र रखी जा रही है के अनुसार परिपत्र स्कैन के आकार को परिभाषित करने के लिए कक्षा की त्रिज्या का चयन करें. एक बिंदु emitter के लिए, संवेदनशीलता और प्रतिक्रिया को अधिकतम करने के लिए उत्तेजना बीम की बात फैल समारोह (पीएसएफ) के कमर के बराबर कक्षा की त्रिज्या निर्धारित किया है.
- अक्षीय सेटअक्षीय दिशा साथ कण स्थिति स्थानीयकरण का प्रदर्शन कर रहे हैं कि दो कक्षाओं के बीच की दूरी को परिभाषित करने के लिए दूरी. 1.5-3 गुना पीएसएफ कमर को अक्षीय दूरी निर्धारित करें.
- यह भी तस्वीर विरंजन दर का निर्धारण करेगा, जो कक्षा के प्रत्येक बिंदु पर खर्च समय निर्धारित करने कण की चमक के अनुसार बसना समय निर्धारित करें. 10-100 μsec के बीच एक ध्यान केन्द्रित करना समय का उपयोग करें.
- 4-32 मिसे के क्रम में कक्षा अवधि उपज और कण की स्थिति का निर्धारण करने के लिए एक उच्च अस्थायी समाधान प्रदान करने के लिए 64 या 128 के लिए प्रत्येक कक्षा में अंकों की संख्या निर्धारित करें.
- डीसी रेखापुंज स्कैन की गई छवि में एक कर्सर चयन के माध्यम से ग्राफिकल यूजर इंटरफेस के माध्यम से कण पर बीम केंद्र के क्रम में दर्पण के लिए भेजा ऑफसेट संकेत बदलें.
- कक्षीय स्कैनिंग करने के लिए रेखापुंज इमेजिंग से माइक्रोस्कोप मोड स्विचन द्वारा ट्रैकिंग शुरू.
- राय और डेटा संग्रह को सक्रिय करें.
4 trajectORY विश्लेषण
- कक्षा साथ और एक 'तीव्रता कालीन' के रूप में हर समय बिंदु पर प्रत्येक बिंदु पर एकत्र प्रतिदीप्ति प्रदर्शित करने के लिए सॉफ्टवेयर का उपयोग करें. कालीन के किनारे एकत्र तीव्रता अन्य उज्ज्वल वस्तुओं के साथ कण की बातचीत के बारे में जानकारी प्रदान करता है. साथ ही समय श्रृंखला के रूप में समय के साथ photomultiplier ट्यूब से एकत्र प्रतिदीप्ति तीव्रता (एक्स, वाई स्कैनर और जेड -piezo के समय के साथ डीसी विस्थापन यानी) प्रक्षेपवक्र जानकारी दोनों प्रदर्शित करने के लिए सॉफ्टवेयर का उपयोग करें.
- प्रक्षेपवक्र में ब्याज की केवल एक क्षेत्र का चयन करने के लिए समय की श्रृंखला प्रतिनिधित्व और 'तीव्रता कालीन' जानकारी का उपयोग करें.
- कण प्रक्षेपवक्र के चयनित भाग का एक 2D प्रक्षेपण प्रदर्शित करने के लिए सॉफ्टवेयर का उपयोग करें. कण प्रतिदीप्ति तीव्रता के अनुसार रंग कोड को प्रक्षेपवक्र उचित नियंत्रण का चयन करें.
- पी प्रदर्शित करने के लिए विकल्प का चयन करेंप्रतिदीप्ति तीव्रता के अनुसार 3 डी में लेख प्रक्षेपवक्र, और रंग कोड यह. Microtubule साथ लाइसोसोम गति की सुविधाओं कल्पना करने के लिए नियंत्रण का उपयोग कर 3 डी में प्रक्षेपवक्र घुमाएँ.
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Representative Results
इस प्रोटोकॉल के अनुसार तेजी से 3 डी एक कण ट्रैकिंग fluorescently लेबल लाइसोसोम के विस्थापन को ट्रैक करने के लिए एक संशोधित दो photon माइक्रोस्कोप का उपयोग जीवित कोशिकाओं के अंदर किया जा सकता है. प्रदर्शन प्रयोग endosome परिपक्वता की प्रक्रिया 9 के बाद सेल के अंदर घूम रहा है एक अलग लाइसोसोम ट्रैकिंग के होते हैं. लाइसोसोम एक फ्लोरोसेंट हरे रंग का उपयोग सना हुआ और 2 फोटॉन उत्तेजना का शोषण 930 एनएम पर उत्साहित थे. हमारे डेटा यह 32 मिसे (चित्रा 1 ए) की एक अस्थायी समाधान के साथ एक्स, वाई, जेड विस्थापन trajectories प्राप्त करने के लिए संभव है कि दिखा. कालीन विश्लेषण समय (चित्रा 1 बी) पर प्रत्येक कक्षा साथ दर्ज की तीव्रता को प्रदर्शित करता है. उत्सर्जित प्रतिदीप्ति की एकीकृत तीव्रता दर्ज किया जा सकता ट्रैकिंग (चित्रा 2A) के दौरान. microtubule नेटवर्क पर चलती एक पुटिका से उम्मीद की जा सकती रूप खंगाला 3D प्रक्षेपवक्र, एक निर्देशित प्रस्ताव को प्रदर्शित करता है. एकdditionally, यह आसपास के क्षेत्र (चित्रा 2 बी) के एक रेखापुंज स्कैन छवि को 3 डी प्रक्षेपवक्र सहसंबंधी संभव है. यह एक microtubule बंडल की दिशा साथ कण के आंदोलन की पुष्टि करता है.
माइटोकॉन्ड्रिया उनके आंदोलन के दौरान इन अंगों के साथ पुटिका के अंतिम बातचीत रिकॉर्ड करने के लिए कोशिकाओं साथ ही एक लाल मार्कर के साथ दाग रहे थे. यह Mitotracker प्रतिदीप्ति उत्सर्जन (चित्रा 3B) से दर्ज की तीव्रता कालीन को सेल (चित्रा 3 ए) के अंदर कण की 3 डी प्रक्षेपवक्र सहसंबंधी संभव है. यह हमें कोशिका के भीतर अपनी स्थिति के एक समारोह के रूप में mitochondrial नेटवर्क के साथ पुटिका की निकटता बातचीत रिकॉर्ड करने के लिए अनुमति देता है. "माइटोकॉन्ड्रिया चैनल" में दर्ज उत्सर्जन शिखर organelles बातचीत रास्ते के बारे में कार्यात्मक जानकारी देना नहीं है. यह उनकी बातचीत के समय पर ही जानकारी प्रदान कर सकते हैंऔर कण के संबंध में फ्लोरोसेंट वस्तु के सापेक्ष स्थानिक स्थिति पर नज़र रखी जा रही है. इस रिश्तेदार की स्थिति उत्सर्जन शिखर दर्ज की गई है, जहां कक्षा के भीतर कोण से निकाला जाता है. हम इस प्रयोग को करने के लिए इस्तेमाल किया माइक्रोस्कोप का एक योजनाबद्ध प्रतिनिधित्व चित्रा 4 में देखा जा सकता है.
समय trajectories और तीव्रता कालीन बनाम 1 विस्थापन चित्रा. समय निशान बनाम एक) एक्स, वाई और जेड लाइसोसोम विस्थापन. ख) तीव्रता प्रक्षेपवक्र (यानी प्रत्येक परिपत्र कक्षा ऊर्ध्वाधर अक्ष के साथ एकत्र तीव्रता है समय) कण की प्रतिदीप्ति परिवेश के बारे में जानकारी प्रदान करता है. बॉक्सिंग के बाहर चमकीले धब्बों अन्य उज्ज्वल वस्तुओं के साथ कण की बातचीत के अनुरूप है, और वें के रूप में प्रक्षेपवक्र में कूदता से जुड़े हुए हैं ई कक्षाओं प्रतिभाशाली प्रतिदीप्ति स्रोत पर फिर से केंद्र. बॉक्सिंग क्षेत्र दो कूदता के बीच में प्रक्षेपवक्र के भाग से मेल खाती है.
एक लाइसोसोम की 3 डी प्रक्षेपवक्र के बाद चित्रा 2. एक लाइसोसोम के प्रक्षेपवक्र के एक हिस्से की एक) 3 डी पुनर्निर्माण कण ट्रैकिंग का उपयोग कर एकत्र की. (नीले, कम फोटोन मायने रखता लाल, उच्च) प्रक्षेपवक्र कण से एकत्र प्रतिदीप्ति तीव्रता के लिए कोडित रंग है. अक्ष तराजू एनएम में हैं. कि एक्स, वाई नोट, जेड कुल्हाड़ियों विभिन्न श्रेणियों है. 3 डी प्रक्षेपवक्र बी) 2 डी प्रक्षेपण, एक रेखापुंज में imaged microtubule तुरंत स्कैन के शीर्ष पर प्रक्षेपवक्र का ओवरले प्रदर्शित प्रक्षेपवक्र एकत्र किया गया था के बाद. ग) Mitochondria Mitotracker के साथ दाग .
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चित्रा 3 (930 एनएम उत्तेजना) एक से अधिक चैनल के लिए कक्षीय ट्रैकिंग का विस्तार. एक) सेल. ख) ग्रीन चैनल (इस चैनल में एकत्र प्रतिदीप्ति में तीव्रता कालीन के भीतर एक लाइसोसोम की 3 डी प्रक्षेपवक्र ट्रैकिंग के लिए प्रयोग किया जाता है). ग) माइटोकांड्रिया एक लाल फ्लोरोसेंट मैट्रिक्स के साथ दाग रहे थे जहां लाल चैनल में तीव्रता कालीन लक्षित डाई. लाइसोसोम चारों ओर परिक्रमा किरण mitochondrial मैट्रिक्स में पार के रूप में प्रक्षेपवक्र माइटोकांड्रिया (तीर) के साथ संपर्क में हो जाता है, जहां क्षेत्रों, कालीन में तीव्रता धक्कों के रूप में दिखाई देते हैं.
चित्रा प्रयोगात्मक स्थापना के 4 Schematics: दो photon माइक्रोस्कोप संशोधित. लेजर सेट अप की योजनाबद्ध प्रतिनिधित्व: एक 2 फोटॉन तिवारी: एक रेंज 690-1,040 एनएम के साथ सा लेजर हमें थाएड, एक polarizer और एक आधा waveplate उत्तेजना शक्ति को नियंत्रित करने के लिए उपयोग किया जाता है. अन्य सभी मदों के संकेत संक्षिप्त रूपों का उपयोग आंकड़ा में सूचीबद्ध हैं. हम 1.2 की एक एनए के साथ एक 60x उद्देश्य में इस्तेमाल किया.
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Discussion
एक उच्च अस्थायी समाधान के साथ तीन आयामों में फ्लोरोसेंट कणों के trajectories प्राप्त करने के अंतिम वर्षों में प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोपी तकनीक और इंस्ट्रुमेन्टेशन्स, की जबरदस्त प्रगति के बावजूद क्षेत्र में एक चुनौती बनी हुई है. उच्च अस्थायी समाधान दो आयामों में ट्रैकिंग कणों हासिल किया गया है, तो अक्षीय दिशा को विस्तार आम तौर पर प्रणाली 10 की आवृत्ति प्रतिक्रिया में भारी कमी लाता है.
इस वीडियो प्रोटोकॉल में हम एक दो photon माइक्रोस्कोप का उपयोग एक उच्च अस्थायी समाधान (इस प्रयोग में 32 मिसे) के साथ एक जीवित कोशिका के भीतर तीन आयामों में एक व्यक्ति कण ट्रैकिंग की प्रदर्शनात्मक आवेदन पर ध्यान केंद्रित किया. इस तरह के एक प्रयोग का प्रदर्शन करने के लिए आवश्यक सेटअप लेजर स्कैनिंग माइक्रोस्कोपी प्रदर्शन प्रयोगशालाओं के लिए आम तौर पर उपलब्ध है. 3 डी कक्षीय नज़र रखने के लिए दोनों साधन Add-ons के साथ ही नियंत्रण सॉफ्टवेयर commercia के लिए, बाजार में उपलब्ध हैंऐसे ओलिंप द्वारा निर्मित उन के रूप में एल लेजर स्कैनिंग सूक्ष्मदर्शी. , यह उत्सर्जित प्रतिदीप्ति के डी स्कैनिंग की आवश्यकता नहीं है क्योंकि प्रयोगात्मक स्थापना के डिजाइन में फायदेमंद है जहां उपलब्ध एक स्पंदित उच्च शक्ति अवरक्त लेजर स्रोत का उपयोग. इसके अलावा यह ध्यान प्रतिदीप्ति और फोटो विरंजन के बाहर की कमी को देखते हुए अवरक्त विकिरण विशेष परिस्थितियों 11 के तहत, सेल की ओर अधिक सौम्य है कि अतीत में प्रदर्शन किया गया.
दो आयामों में एक फ्लोरोसेंट कण की तेजी से ट्रैकिंग एक संवेदनशील कैमरे का उपयोग किया जा सकता है, किसी भी तीन आयामी जानकारी के अभाव में अक्सर प्रक्षेपवक्र जानकारी के biophysical अर्थ की व्याख्या में सीमित हो सकता है. उदाहरण के लिए, microtubule साथ चलती पुटिकाओं अक्सर सूक्ष्मनलिकाएं चौराहे क्षेत्रों 8,12 खिलाफ चला. इस स्थिति में, एक 3 डी ट्रैकिंग तकनीक का उपयोग एक 3 डी संरचना के 2 डी अनुमानों के उपयोग की सीमा पर काबू.
एक्स, वाई दिशाओं यह कुछ मिसे के लिए नीचे जा सकते हैं, जबकि हमारा उद्देश्य nanopositioner piezo डिवाइस का समय प्रतिक्रिया के कारण, जेड अक्ष में आंदोलन की अवधि के बारे में 30 मिसे तक सीमित है. विधि का स्थानीयकरण सटीक शोर अनुपात 4,5 करने के संकेत के रूप में तराजू. विधि की ही स्पष्ट सीमा, कण के वातावरण की एक वैश्विक दृष्टि के नुकसान यानी, पड़ोसी फ्लोरोसेंट स्रोतों के साथ फ्लोरोसेंट कण की बातचीत के इतिहास अनुरेखण, एक अस्थायी तीव्रता कालीन 13 पुनर्गठन की संभावना से मुआवजा दिया है एक ही या एक अलग वर्णक्रमीय उत्सर्जन या तो प्रदर्शित.
हम लाइसोसोम की गति, या तो kinesins या dyneins द्वारा, सूक्ष्मनलिकाएं साथ गति निर्देशित संचालित गुजरना पुटिका, एक व्यावसायिक रूप से उपलब्ध डाई का उपयोग धुंधला के बाद एक जीवित कोशिका के भीतर का पालन किया जा सकता है. हाल ही में, लाइसोसोम के 2 डी ट्रैकिंग Corr थापुटिका microtubule-microtubule चौराहों 8 पर ले कि मार्गों का पता लगाने के प्रयास में microtubule नेटवर्क की सुपर संकल्प इमेजिंग, को उत्तेजित. लाइसोसोम की 3 डी trajectories यूनिडायरेक्शनल गति की तुलना में एक अधिक जटिल व्यवहार प्रदर्शित करते हैं. एक औसत गति, झुकने घुमा और नलिकाओं साथ संभव घुमाव इन trajectories से मनाया जा सकता है, देखा जा सकता है का निर्देशन किया है.
हम इन प्रयोगों प्रदर्शन में दो महत्वपूर्ण कदम की पहचान की है: पहला, यह चमकते दाग कणों को प्राप्त करने के लिए पर्याप्त उच्च एक ही समय में है कि लाइसोसोम की लेबलिंग घनत्व को प्राप्त करने के लिए आवश्यक है, और एक ही समय में है कि कम कणों के घनत्व प्रदान करता है व्यक्तिगत कणों की ट्रैकिंग की अनुमति के लिए पर्याप्त. दो पार कणों के मामले में, माइक्रोस्कोप ट्रैकिंग करते हुए एक दूसरे को एक कण से स्विच कर सकते हैं. दूसरा महत्वपूर्ण कदम के लिए एक उचित संतुलन हो, की अनुमति पिक्सेल ध्यान केन्द्रित करना समय की पसंद का सवालशोर अनुपात और ट्रैकिंग गति के लिए उच्च संकेत tween. हम ट्रैकिंग चक्र के अनुसार 32 मिसे के क्रम में ट्रैकिंग गति 1 माइक्रोन / सेक नीचे गति में तेजी का निर्देश गति के दौर से गुजर लाइसोसोम पालन करने के लिए आमतौर पर पर्याप्त हैं कि देखा है.
संक्षेप में, कक्षीय ट्रैकिंग तीन आयामों में और <40 मिसे fluorescently लेबल पुटिका के intracellular गति की एक अस्थायी समाधान के साथ मापने के लिए अनुमति देता है. 3 डी कक्षीय ट्रैकिंग हमें ऐसे विभिन्न अत्यधिक गतिशील सेलुलर प्रक्रियाओं chromatin गतिशीलता वास्तविक समय प्रतिलेखन और intracellular माध्यम में plasmonic नैनोकणों के प्रसार के अध्ययन के अध्ययन के लिए भविष्य में कार्यरत होने की संभावना है.
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Lysotracker DND 26 | Life Technologies | L-7526 | |
| Tubuline tracker Green | Life Technologies | T34075 | |
| Mitotracker RED | Life Technologies | M7512 | |
| Coherent Chamelon- ultra II TI | Coherent | ||
| Glan Taylor Calcite Polarizer | Melles Griot | 03PTA001 | |
| Galvanometer-motor mirror | Cambridge Technologies | M 6350 | |
| Dichroic mirror | Chroma Technologies | 700 DCSPXR | |
| Motorized stage | ASI | MS2000 | |
| Piezo | PI | P721-LLQ | |
| Photomultiplier tube | Hamamatsu | H7422P-40 | |
| Data acquisition card | IO tech | PCI 1128-4000 | |
| Imaging software | LFD | Global for images-SimFCS |
References
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