Abstract
이 동영상 프로토콜의 목적은 변형 된 이광자 현미경을 사용하여 1 입체 형광 입자 궤도 추적 실험을 수행하고 분석하는 방법을 설명하는 것이다. 종래의 접근 방식 (래스터 스캔 또는 프레임들의 스택에 기초하여 넓은 시야)에 대향 된 바와 같이, 3D 궤도 추적 지역화 및 높은 공간 (10 nm의 정확도) 및 시간 해상도 (50 Hz에서의 주파수 응답)의 3 차원 변위에 따라 허용 마이크론이 수백의 길이 비늘에 이동 형광 입자. 이 방법은 추적 된 대상물 주위에 원형 궤도를 수행하기 위해 두 개의 광자 레이저 스캐닝 현미경의 하드웨어를 제어하는 피드백 알고리즘을 기반으로한다 : 피드백기구의 변위를 제어하여 중심에 형광 물체를 유지 주사 빔 3-5. 이 기술의 장점을 설명하기 위해, 우리는 알 내에서 빠르게 움직이는 세포 기관, 리소좀을 따라iving 셀 6,7. 세포는 표준 프로토콜에 따른 도금 및 상업적 리소좀 염료를 사용하여 염색 하였다. 우리는 살아있는 세포의 내부 3D 궤도 추적 실험을 수행하기 위해, 간단히 하드웨어 구성과보다 상세히 제어 소프트웨어를 논의한다. 우리는 상세히 주사 현미경을 제어하고 입자 주위 닫힌 궤도 빔의 움직임을 사용하기 위해 필요한 파라미터들을 논의한다. 우리는이 방법이 효과적으로 생균 내에 3 차원 미세 소관을 따라 표시된 리소좀의 빠른 움직임을 추적 할 수있는 방법을 보여줌으로써 결론. 리소좀은 일반적으로 미세 소관 네트워크 8 따라 모션을 지시 표시, 0.4-0.5 μM / 초 범위의 속도로 이동할 수있다.
Introduction
방법 중 다수의 현미경을 사용 입체적으로 형광 발색 입자를 추적하는 날짜로 개발되어왔다. 대부분의 접근은 일반적으로 이상적인 축 방향으로 트래킹을 달성하기 위해 현미경 출사 광학계의 정의 수정과 조합이 차원에서 추적하기 적합한 고속 카메라의 사용에 의존한다. 이 프로세스가 적절한 시간 해상도 (10Hz의)는 일반적으로 시간 소모적이며, 얻을 수 있지만, 종래의 입자가있다 추적되는 경우에만, Z-스택의 시계열을 수행하여 형광체 입자를 추적 할 수있다 (촛점 또는 두 개의 광자 중) 레이저 주사 현미경 액티브 피드백 메커니즘 (2)에 의해 작은 래스터 촬상 영역의 중심에 있었다.
록킹에서 입자로의 개념은 궤도 추적 방법의 기초이다. 대신 래스터의 원형 궤도가 형광 입자의 주위에 수행되는 검사합니다. 따라서 형광의 강도궤도 정확하게 입자의 총수 4 편재.
입자의 국부적 위치는 현미경 스캐너 재 중심 위치에 입자 궤도를 작동하는 데 사용될 수있다. 현미경의 갈바 노 스캐너는 아날로그 전압에 의해 구동된다. 이 전압의 AC 성분은 사인 및 원 궤도를 수행 할 수 있도록 X 및 Y 스캐닝 미러에 적용 코사인 파 즉, 집속 레이저 빔의 궤도를 수행 할 수 있습니다. 신호의 DC 오프셋은 궤도의 중심 위치를 변경하는 것을 용이. 궤도주기가 결정되며, AC 신호 파형이 구성되면, 피드백 시스템은 신호의 단지 DC 성분을 업데이트 할 필요가있다.
검출기로부터 수집 된 형광 신호를 판독 할 수 소프트웨어는 DC 전원을, 스캐너 및 검출기를 제어하기 위해 입자의 위치를 계산하고 갱신 할 필요설정합니다. 궤도 파라미터 (크기 및 타이밍)의 신중한 선택을 묘화 성공적인 피드백에 필요한 이들 파라미터는 추적 할 필요가 형광 물질의 특성에 기초하여 조절 될 필요가있다.
기술의 물리적 및 수학적 기초는 2D 및 3D 애플리케이션 모두에 대해 과거 4,5에 기재 하였다. 이 프로토콜에서는 간단히 셋업의 주요 하드웨어 구성 요소를 설명하고, 더욱 구체적으로 파라미터의 선택과 시료 전처리는 살아있는 세포 내의 높은 시간적 해상도 리소좀의 변위 다음 우릴 있도록 일반적인 실험에 필요한.
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Protocol
1 샘플 준비
- 10 % 소 태아 혈청 및 페니실린 스트렙토 마이신 50 ㎍ / ml의 100 IU / ㎖로 보충 된 DMEM을 사용하여 조직 배양 플라스크에 CHOK1 세포를 유지한다. 37 ° C에서 5 % CO 2 가습 인큐베이터에있는 세포를 품어.
- 수확 후 0.16 mm의면 두께 14mm 직경 마이크로 웰에 CHOK1 세포를 플레이트. 60~70% 자랄 때 주변의 이미징을위한 최적의 밀도에 대한 종자 세포.
- 37 ° C에서 하룻밤 세포를 품어, 5 % CO 2. 녹색과 튜 불린 추적기 녹색의 150 nm의 Lysotracker DND26의 50 nm의를 포함하는 용액에 세포를 HBSS (행크 버퍼 식염수)의 셀을 세 번 세척하고, 부화. 37 ° C에서 1 시간 동안 세포를 품어. 선택 단계 : 부화하기 전에, 미토콘드리아 매트릭스 염색 염료 (25 nM의)와 추가로 얼룩을 수행합니다.
- 어떤 언 바운드 염료를 제거 HBSS에있는 세포를 세 번 씻으십시오. IMAG 이전에 신선한 DMEM 성장 매체를 추가세포를 보내고.
2 현미경 구성
비디오 프로토콜에 기재된 입자 추적 현미경 시판 도립 현미경 (도 4)의 프레임에 조립된다. 3D 궤도 입자 추적을위한 그러나 상용 모듈을 사용할 수 있습니다.
- 690 nm의 1,040 nm의 사이에 조정 가능한 출력 파장 범위, 사 펨토초 레이저의 여기 광원 : 코 히어 런트 카멜레온 - 울트라 II 티를 사용합니다.
- 레이저 빔이 IR 코팅 거울을 사용하여 현미경의 후면 포트에 정렬되어 있는지 확인합니다. 레이저 빔은 방해석 선형 편광자 다음 회전 반 파장 판을 이용하여 감쇠된다. 샘플에서의 평균 전력은 0.5과 2 mW의 사이가되도록, 빔을 감쇠.
주 : 레이저 빔이 시료면에 집속 빔의 위치 및 궤적의 제어를 허용 검류계 미러 구동 모터의 쌍에 의해 반사된다. 에서짧은 패스 다이크로 익 미러에 반사 한 후 현미경 대물의 후방에 들어가기 전에, 빔 익스팬더 통과 갈바 노 미러의 출사 평행 레이저 빔 확장 전형적인 구성 (10X). - 광로에 높은 개구 물 대물 (60X, NA 1.2)를 배치하여 샘플에서 형광 광을 수집한다. 하나 또는 두 개의 채널 구성에 원하는 발광 파장에 의한 형광 필터 큐브를 선택. 상기 방출 된 형광 스펙트럼의 범위를 선택하는 발광 대역 통과 필터를 사용한다.
- 전동 무대에 샘플을 놓고 객관적 압전 컨트롤러를 사용하여 현미경 목표의 미세한 움직임을 조정합니다.
- 신호 판별 및 디지털 I / O 데이터 수집 카드로 전송되는 광전자 증 배관 튜브에 필터 정육면체로부터의 광을 직접.
NOTE : 컴퓨터 파형은 I / O 카드의 아날로그 출력 및 제공하기 아르 생성스캐너에 에드는 전자를 제어 할 수 있습니다. 광전자 증 배관 및 스캐너로 출력 신호에서 광자의 카운트 입력은 측정 된 형광 SimFCS 역학 소프트웨어를위한 실험실에 의해 I / O 카드를 통해 제어된다.
3 이미징
- 무대에서 세포를 놓고 투과광 조명을 사용하여 초점을 맞 춥니 다.
- 염료를 혼입 한 세포를 식별하고 기본 미세 소관을 시각화하는 래스터 스캔 영상으로 전환. 소포 운동이 존재하는 초기 영역을 식별합니다.
- 고립 된 소포가 확인되면, 궤도 추적에 대해 다음 매개 변수를 설정합니다 :
- 입자의 크기에 따른 추적되는 원형 주사의 크기를 정의하기 위해 궤도 반경을 선택한다. 포인트 이미 터, 감도 및 응답을 최적화 여기 빔의 점 확산 함수 (PSF)의 허리 동일한 궤도의 반경을 설정한다.
- 축 설정축 방향을 따라 파티클 위치 국산화 수행이 궤도 사이의 거리를 정의하는 거리. 1.5-3 배 PSF 허리에 축 방향의 거리를 설정합니다.
- 또한 광 표백 속도를 결정할 것이다 궤도의 각 시점에 소비되는 시간을 설정하는 입자의 밝기에 따라 체류 시간을 정의한다. 10 ~ 100 마이크로 초 사이의 체류 시간을 사용합니다.
- 4-32 밀리의 순서 궤도주기를 산출하고, 입자의 위치를 결정하기위한 높은 시간 해상도를 제공하기 위해 64 또는 128로 각각의 궤도에있는 포인트의 수를 설정한다.
- DC보기 래스터 스캔 이미지에서 커서 선택을 통해 그래픽 사용자 인터페이스를 통해 입자에 빔 중앙 위해 거울에 전달 상쇄 신호를 변경한다.
- 궤도 검사에 래스터 이미지에서 현미경 모드를 전환하여 추적을 시작합니다.
- 피드백 및 데이터 수집을 활성화합니다.
4 Traject모리 분석
- 궤도와 함께 '강도 카펫'의 형태로 각 시점의 각 시점에서 수집 된 형광을 표시하도록 소프트웨어를 사용한다. 카펫을 따라 수집 된 강도는 다른 밝은 물체로 입자의 상호 작용에 대한 정보를 제공합니다. 물론 시계열의 형태로 시간에 걸쳐 광전자 증 배관으로부터 수집 형광 강도 (x, y 스캐너 및 Z의 -piezo의 시간 동안 DC 변위 즉) 궤적 정보를 모두 표시하도록 소프트웨어를 사용한다.
- 궤도에 대한 관심 만 지역을 선택하는 시계열 표현하고 '강도 카펫의 정보를 사용합니다.
- 입자 궤적의 선택된 부분의 2D 투영을 표시 할 소프트웨어를 사용합니다. 입자의 형광 강도에 따라 색상 코드로 궤도를 적절한 컨트롤을 선택합니다.
- 페이지를 표시하는 옵션을 선택합니다형광 강도에 따라 3D로 문서 궤도, 색상 코드 그것. 미세 소관을 따라 리소좀 운동의 특징을 시각화하기 위해 컨트롤을 사용하여 3D의 궤도를 돌립니다.
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Representative Results
이 프로토콜에 따라 고속 3D 단일 입자 추적은 형광 표지 리소좀의 변위를 추적하는 개질 이광자 현미경을 이용하여 살아있는 세포 내부에서 수행 될 수있다. 실험 수행 엔도 좀의 성숙 과정 9 후 셀 내부 이동 절연 리소좀 추적 이루어져있다. 리소좀은 녹색 형광 염료를 사용하여 염색하고 2 광자 여기 악용 930 nm에서 여기시켰다. 우리의 데이타는 32 밀리 초 (도 1A)의 시간 해상도와 X, Y, Z 변위 궤도를 얻을 수 있음을 보여준다. 카펫 분석 시간 (그림 1b)를 통해 각각의 궤도를 따라 기록 강도를 표시합니다. 방출 된 형광의 통합 강도가 기록 될 수있는 추적 (도 2a) 중. 미세 소관 네트워크에서 이동 소포로부터 예상 될 수있는, 재구성 된 3 차원 궤적은, 동작 지시를 표시한다.dditionally, 상기 주변 영역 (도 2b)의 래스터 스캔 이미지에 3 차원 궤적을 연관시킬 수있다. 이를 미세 소관 다발의 방향을 따라 파티클의 움직임을 확인한다.
미토콘드리아가 이동중 이러한 소기관과 소포의 최종 상호 작용을 기록하는 세포를 추가로 적색 마커로 염색 하였다. 그것은 mitotracker 형광 발광 (도 3b)로부터 기록 강도 카펫에 셀 (도 3a) 내부의 입자 차원 궤적을 연관시킬 수있다. 이것은 우리가 셀 내에서 자신의 위치의 함수로서 미토콘드리아 네트워크와 소포의 근접성 상호 작용을 기록 할 수있다. "미토콘드리아 채널"에 기록 된 발광 피크는 세포 기관이 상호 작용하는 방식에 대한 기능 정보를 제공하지 않습니다. 이 상호 작용의 시간 정보만을 제공 할 수있다및 입자에 대해 형광 물체의 상대적인 공간 위치가 추적된다. 이 상대 위치는 발광 피크가 기록되어 궤도 내의 각도에서 추출된다. 우리는이 실험을 수행하는 데 사용되는 현미경의 개략도는도 4에서 관찰 될 수있다.
시간의 궤적과 강도 카펫 대 1 변위 그림. 시간 추적 대) x, y 및 z 리소좀 변위. b) 강도 궤적 (즉, 각각의 원 궤도 종축을 따라 수집 된 강도는 시간) 입자의 형광의 주변에 대한 정보를 제공한다. 박스 외부의 밝은 반점은 다른 밝은 물체로 입자의 상호 작용에 해당하고, 일 등의 궤도에서 점프에 관련된 전자 궤도 밝은 형광 소스에 다시 센터. 박스 영역은이 점프 사이의 궤적 부분에 대응한다.
리소좀의 3D 궤적에 따라 그림 2. 리소좀의 궤적의 일부의) 3D 재구성 입자 추적을 사용하여 수집 하였다. (청색, 낮은 광자 카운트 레드, 높음) 궤도 입자에서 수집 된 형광 강도 코딩 색상입니다. 축 저울 나노에 있습니다. 그 x, y를 참고, Z 축이 서로 다른 범위를 가지고있다. 차원 궤적 b) 2D 투영을, 래스터 묘화 미세 소관 바로 스캔 위에 궤적 오버레이 표시하는 궤도는 수거 후. c) 미토콘드리아 mitotracker 물들 .
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그림 3 (930 nm에서 여기) 하나 이상의 채널에 궤도 추적을 확장. ) 셀. b)는 녹색 채널 (이 채널에서 수집 한 형광 강도 카펫 내 리소좀의 3D 궤도를 추적하는 데 사용됩니다). C) 미토콘드리아는 적색 형광 매트릭스 염색 빨강 채널에서 강도 카펫 대상 염료. 리소좀 주위를 공전 빔이 미토콘드리아 매트릭스로 통과 할 때 궤도가 미토콘드리아 (화살촉)와 접촉에 도착 지역, 카펫 강도 범프로 나타납니다.
그림 실험 장치의 4 회로도 : 두 광자 현미경을 수정했습니다. 레이저 셋업의 도식 표현 : 두 광자 티 : 범위 690-1,040 nm의와 사 레이저는 우리를했다ED, 편광판 및 반 파장 판은 구동 전력을 제어하는 데 사용된다. 다른 모든 항목이 표시된 약어를 사용하여 그림에 나와 있습니다. 우리는 1.2의 NA와 60X 목표를 사용했다.
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Discussion
높은 시간 분해능으로 3 차원 형광 입자의 궤적을 달성 지난 년 동안 형광 현미경 기술과 계장의 엄청난 진행됨에도 불구 분야에서 도전을 유지하고있다. 높은 시간 해상도가 이차원 추적 입자를 달성 한 경우, 축 방향에 확장은 전형적으로 시스템 (10)의 주파수 응답에서의 급격한 감소를 가져온다.
이 동영상 프로토콜에서는 이광자 현미경을 사용하여 높은 시간 해상도 (이 실험에서는 32 밀리 초)으로 살아있는 세포 내에 입체적 개별 입자의 추적의 실증 애플리케이션에 초점을 맞추었다. 이러한 실험을 수행하기 위해 필요한 설정은 레이저 주사 현미경 검사를 수행하는 실험실 전형적 가능하다. 3D 궤도 추적을위한 두 악기 추가 기능뿐만 아니라 제어 소프트웨어 Commercia에 대 한 시장에서 사용할 수있는이러한 올림푸스 사제 것과 리터 레이저 주사 현미경. 그것이 발광 형광 디 주사를 필요로하지 않기 때문에, 실험 장치의 설계에 유리하다 가능한 펄스 고전력 적외선 레이저 소스의 사용. 또한 그것은 초점 형광 및 사진 표백 중의 감소 주어진 적외선 조사는 특정 조건 11에서 셀을 향해 더 양성 과거에 증명되었다.
2 차원 형광 입자의 빠른 추적 민감한 카메라를 사용하여 수행 될 수 있지만, 임의의 입체 정보의 부재는 종종 궤적 정보의 생물 리 학적 의미를 해석하는데 한정 될 수있다. 예를 들어, 미세 소관을 따라 이동 소포 자주 미세 소관의 교차 영역 8,12 상대로 실행합니다. 이 상황에서, 3D 추적 기법의 사용은 3 차원 구조의 돌기를 사용하여 2 차원의 한계를 극복한다.
X 방향, Y 방향은 몇 밀리로 내려갈 수있는 반면 우리 대물 나노 위치 압전 소자의 시간 응답으로 인해, Z 축으로의 이동의주기는 약 30 밀리 초에 한정된다. 방법의 지역화 정밀도 잡음비 4,5 신호로서 비늘. 방법의 유일한 명백한 한계는 입자의 환경의 글로벌 뷰의 손실, 즉, 인접하는 형광 소스와 형광체 입자의 상호 작용에 대한 이력을 추적, 순간 세기 카펫 (13)을 복원하는 가능성에 의해 보상된다 동일하거나 서로 다른 스펙트럼 방사를 표시.
우리는 리소좀의 움직임, 또는 어느 키네신 dyneins 의해, 미세 소관을 따라 모션을 지시 전원 거친다 소체는, 시판의 염료를 사용하여 염색 한 후 살아있는 세포 내에 따라야 할 수 있음을 보여준다. 최근 리소좀의 2D 추적 CORR이었다소포는 미세 소관 미세 소관 교점 8에서 취할 경로를 검출하는 노력 미세 소관 네트워크의 수퍼 - 해상도 이미징에 양양. 리소좀의 3D 궤도는 단방향 움직임보다 더 복잡한 동작을 표시합니다. 평균 움직임은 굽힘과 비틀림 세뇨관 따라 가능한 회전 궤적이 관찰 될 수 있고, 직접 관찰 할 수 있지만.
우리는이 실험을 수행하는 두 가지 중요한 단계를 확인했다 : 첫째, 밝게 염색 입자를 수득하기에 충분히 높은 동시에이다 리소좀 라벨링 밀도를 달성하기 위해 필요하며, 동시에 그것은 낮은 입자의 밀도를 제공한다 개개의 입자의 추적을 허용 할만큼. 이 횡단 입자의 경우는 현미경의 추적하면서 다른 하나의 입자에서 스위칭 할 수있다. 초 임계 공정은 적당한 균형 될 수 있도록, 화소 드웰 시간의 선택에 관한잡음비와 추적 속도로 하이 신호를 트위닝. 우리는 추적 사이클 당 32 밀리의 순서로 추적 속도가 1 μm의 / 초 이하의 속도로 빠르게 지시 운동을 진행 리소좀을 따르 일반적으로 충분하다는 것을 발견했다.
요약하면, 궤도 추적은 세 차원 및 <40 밀리 형광 표지 소포의 세포 내 움직임의 시간 분해능으로 측정 할 수 있습니다. 3D 궤도 추적 우릴 상이한 매우 동적 인 세포 과정 염색질 역학 실시간 전사 및 세포 배지에서 플라즈몬 나노 입자의 확산에 대한 연구의 연구를 위해 미래에 이용 될 가능성이있다.
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Lysotracker DND 26 | Life Technologies | L-7526 | |
| Tubuline tracker Green | Life Technologies | T34075 | |
| Mitotracker RED | Life Technologies | M7512 | |
| Coherent Chamelon- ultra II TI | Coherent | ||
| Glan Taylor Calcite Polarizer | Melles Griot | 03PTA001 | |
| Galvanometer-motor mirror | Cambridge Technologies | M 6350 | |
| Dichroic mirror | Chroma Technologies | 700 DCSPXR | |
| Motorized stage | ASI | MS2000 | |
| Piezo | PI | P721-LLQ | |
| Photomultiplier tube | Hamamatsu | H7422P-40 | |
| Data acquisition card | IO tech | PCI 1128-4000 | |
| Imaging software | LFD | Global for images-SimFCS |
References
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