3D Orbital Inseguimento in una Modified microscopio a due fotoni: un'applicazione per il monitoraggio di intracellulare vescicole
Summary
In this video protocol we track – at high speed and in three dimensions – fluorescently labeled lysosomes within living cells, using the orbital tracking method in a modified two-photon microscope.
Abstract
L'obiettivo di questo protocollo video è quello di discutere come eseguire e analizzare un esperimento tridimensionale fluorescente orbitale particle tracking utilizzando una versione modificata del microscopio a due fotoni 1. A differenza di approcci convenzionali (scansione raster o largo campo basato su una pila di frame), il tracciamento orbitale 3D permette di localizzare e seguire con un spaziale elevata (10 precisione nm) e risoluzione temporale (risposta in frequenza 50 Hz) lo spostamento 3D di una particella fluorescente passare lunghezza-scale di centinaia di micron 2. Il metodo si basa su un algoritmo di feedback che controlla l'hardware di un microscopio a scansione laser a due fotoni per eseguire un'orbita circolare intorno all'oggetto da tracciare: il meccanismo di feedback manterrà dell'oggetto fluorescente al centro da comandare lo spostamento dei il raggio di scansione 3-5. Per dimostrare i vantaggi di questa tecnica, abbiamo seguito un organello in rapido movimento, il lisosoma, dentro alcellule iving 6,7. Le cellule sono state piastrate secondo protocolli standard, e colorate con un colorante commercialmente lisosoma. Discutiamo brevemente la configurazione hardware e più in dettaglio il software di controllo, effettuare un esperimento di tracciamento orbitale 3D all'interno delle cellule viventi. Si parlerà in dettaglio i parametri richiesti per controllare il microscopio a scansione e consentire il movimento del fascio in un'orbita chiusa attorno alla particella. Concludiamo dimostrando come questo metodo può essere efficacemente utilizzato per tracciare il movimento veloce di un lisosoma marcato lungo i microtubuli in 3D all'interno di una cella dal vivo. Lisosomi possono muoversi con velocità nell'intervallo 0,4-0,5 micron / sec, tipicamente visualizzando un moto diretto lungo la rete microtubuli 8.
Introduction
Un gran numero di approcci sono stati sviluppati fino ad oggi per monitorare le particelle fluorescenti in tre dimensioni utilizzando un microscopio. La maggior parte approcci si basano sull'impiego di telecamere veloci, ideale per monitorare in due dimensioni, di solito in combinazione con modifiche personalizzate dell'ottica emissione del microscopio per ottenere inseguimento in direzione assiale. Microscopi a scansione laser confocale (uno o due fotoni) convenzionalmente in grado di monitorare una particella fluorescente eseguendo una sequenza temporale di z-stack, anche se questo processo è in genere richiede tempo, e produce la risoluzione di tempo ragionevole (10 Hz) solo se la particella monitorata è conservato nel centro di una piccola regione di imaging raster da un meccanismo di feedback attivo 2.
L'idea di bloccaggio-in per la particella è alla base del metodo di monitoraggio orbitale. Invece di un raster scan un'orbita circolare viene eseguita intorno alla particella fluorescente. L'intensità della fluorescenza lungol'orbita localizza con precisione la posizione delle particelle 4.
La posizione localizzato della particella può quindi essere utilizzato per azionare gli scanner microscopio e ri-centro orbita sulla posizione delle particelle. Gli scanner galvanometro del microscopio sono guidate da una tensione analogica. La componente alternata della tensione permette di eseguire un'orbita con il fascio laser focalizzato, cioè un sinusoidale e un'onda coseno applicata agli specchi X e Y scansione consentirà di eseguire un'orbita circolare. Il DC offset del segnale facilita la modifica della posizione del centro orbita. Dopo un periodo di orbita è determinata e la forma d'onda per il segnale AC è configurato, il sistema di retroazione deve aggiornare solo la componente continua del segnale.
Un software in grado di leggere il segnale fluorescente raccolti dai rivelatori è necessario per controllare gli scanner e rivelatori, per calcolare la posizione della particella e aggiornare il DC offset. Per una valutazione di successo di imaging un'accurata scelta dei parametri orbitali (dimensioni e della tempistica) è necessario e questi parametri devono essere regolati in base alle caratteristiche delle particelle fluorescenti che è necessario tenere traccia.
I fondamenti fisici e matematici della tecnica sono stati descritti in passato 4,5 per entrambe le applicazioni 2D e 3D. In questo protocollo si illustrano brevemente le principali componenti hardware del setup, e più in dettaglio la scelta dei parametri e la preparazione del campione richiesto per un tipico esperimento che ci permette in seguito lo spostamento di un lisosoma con una risoluzione temporale elevata all'interno di una cellula vivente.
Protocol
Representative Results
Discussion
Nonostante gli enormi progressi delle tecniche di microscopia a fluorescenza e strumentazioni nel corso degli ultimi anni, raggiungendo traiettorie delle particelle fluorescenti in tre dimensioni con una elevata risoluzione temporale è rimasta una sfida nel campo. Se alta risoluzione temporale è stato raggiunto particelle di inseguimento in due dimensioni, estensione alla direzione assiale comporta tipicamente una drastica riduzione della risposta in frequenza del sistema 10.
In…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
This project was supported by grants NIH NIGMS 8P41 GM103540-28 and P50-GM076516
Materials
| Name | Company | Model |
| Lysotracker DND 26 | Life technologies | L-7526 |
| tubuline tracker Green | Life technologies | T34075 |
| Mitotracker RED | Life technologies | M7512 |
| Coherent Chamelon- ultra II TI | Coherent | |
| Calcite polarize | Melles Griot Glan | |
| Galvanometer-motor mirror | Cambridge technologies | M 6350 |
| Dichroic mirror | Chroma technologies | 700 DCSPXR |
| Motorized stage | ASI | MS2000 |
| Piezo | PI | P721-LLQ |
| Photomultiplier tube | Hamamatsu | H7422P-40 |
| Data acquisition card | IO tech | PCI 1128-4000 |
| Imaging software | LFD | Global for images-SimFCS |
References
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