Abstract
Bu Video protokolün amacı, bir modifiye iki-foton mikroskop 1 kullanarak üç boyutlu floresan yörünge parçacık izleme deneyi gerçekleştirmek ve analiz nasıl tartışmaktır. Geleneksel yaklaşımlar (raster tarama veya kare bir yığın tabanlı geniş alan) aksine, 3D yörünge izleme lokalize ve yüksek uzaysal (10 nm doğruluk) ve temporal çözünürlük (50 Hz frekans tepkisi) 3D deplasman ile takip sağlar mikron 2 yüzlerce uzunluğu-ölçeklerde hareketli bir floresan parçacık. Bu yöntem takip edilecek nesnenin etrafında dairesel bir yörünge gerçekleştirmek için bir iki-fotonlu lazer tarama mikroskobu donanım kontrol eden bir geri besleme algoritmasına dayanır: geri besleme mekanizması yer değiştirme kontrol ederek merkezinde floresan nesne koruyacaktır tarama ışın 3-5. Bu tekniğin avantajlarını göstermek için, biz al içinde hızlı bir hareket organelini, lizozom, takipiving hücre 6,7. Hücreler, standart protokollere göre kaplama, ve bir ticari olarak lizozom boya ile boyandı. Biz yaşayan hücrelerin içinde bir 3D yörünge izleme deneyi gerçekleştirmek için, kısaca donanım yapılandırması ve daha detaylı kontrol yazılımı tartışmak. Ayrıntılı olarak tarama mikroskobu kontrol ve parçacık etrafında kapalı bir yörüngede kirişin hareketi mümkün kılmak için gerekli parametreleri tartışırlar. Bu yöntem etkili bir şekilde canlı hücre içinde 3D mikrotübüller boyunca bir etiketli lizozom hızlı hareketi izlemek için nasıl kullanılabileceğini gösteren sonucuna varmaktadırlar. Lizozomlar tipik olarak mikrotübül ağı 8 boyunca yönlendirilmiş hareketini görüntüleyen, 0.4-0.5 mm / sn aralığında hızlarla hareket edebilir.
Introduction
Yaklaşımlar çok sayıda, bir mikroskop kullanılarak üç boyutlu olarak floresan parçacıkların izlemek için bugüne kadar geliştirilmiştir. En ideal yaklaşımlar, tipik olarak, eksenel yönde izleme elde etmek için mikroskop emisyon optik özel modifikasyonları ile birlikte, iki boyutlu izlemek için uygun, hızlı kameraların kullanımına dayanmaktadır. Bu işlem, uygun bir zaman çözünürlüğü (10 Hz), tipik olarak zaman alıcı ve verir, ancak geleneksel bir partiküldür izlenen halinde, Z yığınlarının bir zaman dizisi gerçekleştirerek, floresan partikül izleyebilir (konfokal ya da iki ya da foton) lazer tarama mikroskobu Etkin bir geri besleme mekanizması 2 ile küçük bir raster görüntüleme bölgenin merkezinde tuttu.
Kilitleme-in parçacığa fikri yörünge izleme yönteminin temelidir. Bunun yerine, bir raster dairesel bir yörünge floresan de yaklaşık tarama gerçekleştirilir. Boyunca floresans yoğunluğuyörünge tam parçacık pozisyonunu 4 lokalize.
Parçacığın lokalize konumu daha sonra mikroskop tarayıcıları ve yeniden merkezi partikül yörünge konumu üzerinde harekete geçirmek için kullanılabilir. Mikroskop galvanometre tarayıcılar bir analog voltaj ile tahrik edilmektedir. Bu gerilimin AC bileşeni, bir sinüs ve dairesel bir yörünge performans sağlayacak X ve Y, tarama ayna uygulanan bir kosinüs dalgası, yani, odaklı lazer ışını ile bir yörüngeye da yapılabilir. Sinyalinin offset DC yörünge merkezinin pozisyonunu değiştirerek kolaylaştırır. Bir yörünge süresi belirlenir ve AC sinyali için dalga yapılandırıldıktan sonra, geri besleme sistemi bir sinyalin DC bileşenini güncellemek gerekir.
Dedektörler toplanan floresan sinyalini okumak mümkün bir yazılım DC kapalı, tarayıcılar ve dedektörleri kontrol etmek parçacığın konumunu hesaplamak için ve güncelleme gereklidirayarlayın. Yörünge parametrelerine (boyut ve zamanlama) dikkatli bir seçim görüntüleme başarılı bir geribildirim için gerekli ve bu parametreler o izlemek için gerekli olan floresan parçacıkların özelliklerine dayalı ayarlanması gerekiyor edilir.
Tekniğinin fiziksel ve matematiksel temelleri 2D ve 3D uygulamaları için geçmiş 4,5'den tarif edilmiştir. Bu protokolde kısaca kurulum ana donanım bileşenlerini tanımlamak ve daha ayrıntılı parametrelerin seçimi ve numune hazırlama canlı bir hücrenin içinde yüksek bir zamansal çözünürlükte bir lizozomun yerinden takip etmemizi sağlayan tipik bir deney için gerekli.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Numune Hazırlama
- % 10 fetal sığır serumu ve penisilin streptomisin 50 ng / ml, 100 IU / ml ile takviye edilen DMEM kullanılarak doku kültürü şişelerinde CHOK1 hücreleri korumak. 37 ° C sıcaklıkta 5% CO2 nemlendirilmiş inkübatör hücreleri inkübe edin.
- Hasat daha sonra 0.16 mm kadar bir kalınlığı olan bir yüzey 14 mm çaplı mikro çukuruna CHOK1 hücreleri ve plaka. 60-70% konfluansa çevresinde görüntüleme için en uygun yoğunluk için, tohum hücreleri.
- 37 ° C'de gece boyunca inkübe hücreleri,% 5 CO2. Yeşil ve tübülin izci yeşil 150 nM Lysotracker DND26 50 nM ihtiva eden bir çözelti içinde hücreleri HBSS (Hank Tamponlu Tuz Çözeltisi) içindeki hücreleri üç kez yıkayın ve inkübe edilir. 37 ° C'de 1 saat boyunca hücrelerin inkübe edin. İsteğe bağlı adım: kuluçkalamadan önce, bir mitokondrial matris boyama boyasının (25 nM) ilave bir leke gerçekleştirir.
- Herhangi bağlanmamış boya kaldırmak için HBSS'de hücreleri üç kez yıkayın. Imag öncesinde taze DMEM büyüme ortamı ilave edinhücreleri ing.
2. Mikroskop Yapılandırmaları
Video protokolde tarif parçacık takibi için mikroskop, bir ticari olarak temin edilebilir, ters çevrilmiş mikroskop (Şekil 4) şasisi üzerine monte edilir. 3D yörünge parçacık izleme Ancak ticari modülleri artık mevcuttur.
- 690 nm-1040 nm arasında ayarlanabilir bir çıkış dalga boyu aralığında, Sa femtosaniye lazer uyarım ışık kaynağı: Tutarlı Bir Bukalemun-Ultra II Ti kullanın.
- Lazer ışını IR-kaplı aynalar kullanılarak mikroskop arka limanında hizalanmış olduğundan emin olun. Lazer ışını, bir kalsit doğrusal polarizörün ardından dönen yarım dalga plakası kullanılarak azaltılır. Örnek olarak, ortalama güç 0.5 mW 2 arasında olacak şekilde ışını zayıflatır.
NOT: Lazer ışını, örnek düzlemde odaklanmış demetin konumunda ve yörüngesini kontrol etmek için kullanılır galvano-motor tahrikli bir çift ayna tarafından yansıtılır. Birkısa geçişli renkli aynadan yansıması sonrasında mikroskop objektif arka girmeden önce, bir ışın genişletici geçen galvanometre aynalar çıkan dengesi ayarlanmış lazer ışını genişletilmiş tipik yapılandırma (10X). - Işık yoluna yüksek sayısal açıklık su hedef (60X NA 1.2) yerleştirerek numuneden floresan ışığı toplamak. Bir ya da iki kanal konfigürasyonunda, istenen emisyon dalga boyuna göre, bir floresan filtre küpü seçin. Ayrıca yayılan floresan spektral aralığını seçmek için emisyon band geçiren filtreler kullanır.
- Motorlu bir sahneye örnek yerleştirin ve objektif bir piezo-kumandayı kullanarak mikroskop objektif ince hareketini ayarlayın.
- Sinyal tefrik ve dijital I / O veri toplama kartı gönderilir photomultiplier tüpler içine filtre küp ışık yönlendirin.
NOT: Bilgisayar dalga I / O kartının analog çıkış ve provid vardır oluşturulantarayıcılar için ed elektronik kontrol. Fotomultiplikatörler tarayıcılar için çıkış sinyalinden foton sayma girişi ölçülür ve Floresan Dynamics SimFCS yazılımı Laboratuvarı tarafından I / O kartı üzerinden kontrol edilir.
3. Görüntüleme
- Sahnede hücreleri yerleştirin ve iletilen ışık aydınlatma kullanarak odaklanın.
- Boya dahil olan hücreleri tespit etmek ve altında yatan mikrotübülleri görselleştirmek için raster tarama görüntüleme geçin. Vezikül hareketi varsa ilk alan tanımlayın.
- Izole bir kese tespit edildikten sonra, yörünge takibi için aşağıdaki parametreleri ayarlayın:
- Parçacığın boyutu izleniyor göre dairesel tarama boyutunu tanımlamak için yörüngenin yarıçapını seçin. Bir nokta Verici için, duyarlılık ve tepki maksimize etmek uyarma kirişin Noktası Yayılması Fonksiyonu (PSF) bel eşit yörüngenin yarıçapı ayarlayın.
- Eksenel ayarlamaeksenel yön boyunca parçacık konumunun belirlenmesi için gerçekleştirilen iki yörünge arasındaki mesafeyi belirlemek için mesafe. 1,5-3 kat PSF bel eksenel mesafeyi ayarlayın.
- Ayrıca fotoğraf ağartmak oranını belirleyecek yörüngesinin her noktasında harcanan zamanı ayarlamak için parçacığın parlaklığına göre bekleme süresini tanımlayın. 10-100 mikro-saniye arasında bir bekleme süresi kullanın.
- 4-32 msn sırayla yörünge dönemleri verim ve parçacık konumunu belirlemek için bir yüksek temporal çözünürlük sağlamak için 64 veya 128, her yörüngede noktalarının sayısını ayarlayın.
- DC raster taranan görüntüde bir imleç seçim yoluyla grafiksel kullanıcı arabirimi yoluyla parçacık üzerindeki kiriş ortalamak için aynalara gönderilen ofset sinyali değiştirin.
- Yörünge tarama tarama-görüntüleme gelen mikroskop moduna geçerek izlemeye başlayabilirsiniz.
- Geribildirim ve veri toplama etkinleştirin.
4. TrajectORY Analizi
- Yörünge boyunca ve bir "yoğunluk halı" şeklinde, her bir zaman noktasında her bir noktada toplanan floresan görüntülemek için yazılımı kullanın. Halının boyunca alınmış yoğunluğu başka parlak nesneler ile parçacığın etkileşimi hakkında bilgi sağlar. Hem de zaman serisi şeklinde zaman foto-çoğaltıcı tüp toplanan floresan yoğunluğu (x, y ve z tarayıcılar -piezo arasında zamanla DC yerinden yani) yörünge bilgileri hem görüntülemek için yazılımı kullanın.
- Yörünge ilgi sadece bir bölgeyi seçmek için zaman serisi temsil ve 'şiddeti halı' bilgileri kullanın.
- Partikül yörünge seçilmiş bir bölümünün 2D çıkıntısının görüntülemek için yazılımı kullanın. Parçacık floresan yoğunluğuna göre renk kodu yörüngesini uygun kontrolleri seçiniz.
- S görüntülemek için seçeneğini seçinfloresan yoğunluğuna göre 3D makale yörünge ve renk-kod. Mikrotubullerin boyunca lizozom hareket özelliklerini görselleştirmek için denetimlerini kullanarak 3D yörünge döndürün.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Bu protokole göre hızlı 3D tek parçacık izleme floresan etiketli lizozomların değiştirmesini izlemek için değiştirilmiş iki-fotonlu mikroskop kullanılarak canlı hücreler içinde gerçekleştirilebilir. Yapılan deney endozom olgunlaştırma işlemi 9 sonra hücre içinde hareket eden, izole edilmiş bir lizozom izleme oluşur. Lizozomlar floresan yeşil boya kullanılarak boyandı ve 2-foton uyarma istismar 930 nm'de heyecanlandırdı. Bizim veriler 32 milisaniye (Şekil 1a) bir zamansal çözünürlüğe sahip x, y, z deplasman yörüngeleri elde etmenin mümkün olduğunu göstermektedir. Halı analiz süresi (Şekil 1b) her yörünge boyunca kaydedilen yoğunluğunu gösterir. Yayılan floresanın entegre yoğunluk kaydedilebilir izleme (Şekil 2a) boyunca. Mikrotübül ağın üzerinde hareket eden bir vezikül beklenebilecek gibi yeniden 3D yörünge, yönlendirilmiş bir hareket gösterir. Birdditionally, çevredeki bölgesi (Şekil 2b) arasında bir çizgi tarama görüntü 3D yörünge ilişkilendirmek mümkündür. Bu, bir mikrotübül demetinin doğrultusu boyunca parçacık hareketini onaylar.
Mitokondri hareketleri sırasında, bu organel vesikül nihai etkileşimi kaydetmek için hücreler ek olarak bir kırmızı işaret ile boyandı. Bu Mitotracker floresan emisyonu (Şekil 3b) için kaydedilen yoğunluğu halı hücresi (Şekil 3a), içindeki partikülün yörünge 3B ilişkilendirmek mümkündür. Bu durum, hücre içindeki konumunun bir fonksiyonu olarak ağ ile mitokondriyal vesikül yakınlığı etkileşimleri kayıt sağlar. "Mitokondri kanalı" kaydedilen emisyon zirve organelleri etkileşim yolu hakkında işlevsel bilgi vermemektedir. Bu etkileşim sırasında sadece bilgi sağlayabilirve parçacık ile ilgili olarak, flüoresan nesnenin göreli uzaysal pozisyon izleniyor. Bu göreli konum emisyon tepe kaydedilir yörüngesinin içinde açısı elde edilir. Bu deneyi gerçekleştirmek için kullanılan mikroskop şematik bir temsili, Şekil 4'te görülmektedir.
Zaman yörüngeleri ve yoğunluğu halı vs 1. Deplasman Şekil. zaman izleri vs) x, y ve z, lizozom yer değiştirme. b) yoğunluğu yörünge (yani her bir dairesel yörünge boyunca alınmış dikey bir eksen yoğunluğu zaman) parçacığın floresan çevresi hakkında bilgi sağlar. Kutulu dışında parlak noktalar başka parlak nesneler ile parçacığın etkileşimler karşılık gelir ve inci gibi yörünge geçişlere ilişkilidir e yörüngeler parlak floresan kaynağına yeniden merkezleri. Kutulu bölgesi iki atlar arasındaki yörünge bölümüne tekabül etmektedir.
Bir lizozomun 3D yörünge ardından Şekil 2.. Bir lizozomun bir yörünge bir kısmının) 3D rekonstrüksiyon parçacık izleme kullanılarak toplanmıştır. (; Mavi, düşük foton sayımı kırmızı, yüksek) yörünge parçacık toplanan floresan yoğunluğu kodlu renktir. Eksen ölçekler nm vardır. Bu x, y Not z eksenleri farklı aralıkları var. 3D yörünge b) 2D projeksiyon, bir raster görüntülü Mikrotubullerin tarama hemen üstüne bir yörünge kaplamasını gösteren yörünge toplanmıştır sonra. C) Mitokondri Mitotracker ile boyandı .
3 re "src =" / files / ftp_upload / 51794 / 51794fig3highres.jpg "/>
Şekil 3. (930 nm uyarma) birden fazla kanala yörünge izleme uzatılması. a) hücre b.) yeşil kanal (bu kanalda toplanan floresanstaki Intensity halı içinde bir lizozomun 3D yörünge takibi için kullanılır). c) mitokondri kırmızı floresan matrisi ile boyandı kırmızı kanal içinde Yoğunluğu halı hedef boya. Lizozomun etrafında yörüngede ışın mitokondrial matriks içine geçerken yörünge mitokondri (ok uçları) ile temas alır bölgeler, halı yoğunluğu darbelere olarak görünür.
Şekil deney düzeneği 4. Şeması: İki foton mikroskop modifiye. Lazer set-up şematik gösterimi: 2-Foton Ti: Bir aralık 690-1,040 nm Sa lazer bize olduBaskı, bir polarize ve yarım dalga plakası uyarım gücü kontrol etmek için kullanılır. Tüm diğer maddeler belirtilen kısaltmalar kullanılarak şekilde listelenir. Biz 1.2 bir NA ile 60X objektif kullanılır.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Yüksek zamansal çözünürlüğe sahip üç boyutlu floresan parçacıkların yörüngeleri elde son yıllarda floresan mikroskopi teknikleri ve instrumentations, muazzam gelişmelere rağmen alanında bir meydan okuma kalmıştır. Yüksek zamansal çözünürlüğü, iki boyutta izleme parçacıkları elde edilmişse, eksenel yöne uzantısı genellikle, sistemin 10 bir frekans yanıtı şiddetli bir azalma getirir.
Bu video protokolde iki foton mikroskop kullanılarak yüksek temporal çözünürlük (bu deneyde 32 msn) ile yaşayan bir hücre içinde üç boyutlu tek bir parçacık izleme demonstrasyon uygulaması üzerinde duruldu. Böyle bir deneyi gerçekleştirmek için gerekli kurulum lazer tarama mikroskobu gerçekleştiren laboratuarlar için genellikle mevcuttur. 3D yörünge takip için, her iki alet eklentileri hem de kontrol yazılımı commercia için, piyasada mevcutturBöyle Olympus tarafından imal edilenler gibi l lazer tarama mikroskopları. , Bu yayılan floresanın de-tarama gerektirmediği için deneysel olarak tasarım avantajlıdır olarak temin edilebilen bir yüksek güç darbeli kızılötesi lazer kaynağı kullanımı. Bunun da ötesinde, odak floresans ve foto-ağartma out azalma göz önüne alındığında, kızıl ötesi ışınlama, belirli koşullar altında 11, hücreye doğru daha iyi huylu geçmişte gösterilmiştir.
İki boyutta bir flüoresan parçacığın hızlandırılmış bir hassas bir kamera kullanılarak gerçekleştirilebilir, ancak, herhangi bir üç boyutlu bilginin olmaması genellikle yörünge bilgilerin biyofiziksel anlamını yorumlanmasında sınırlayıcı olabilir. Örneğin, Mikrotubullerin birlikte hareket kesecikler sık mikrotübülüsler kesişim bölgelerinde 8,12 karşı çalıştırın. Bu durumda, 3B izleme tekniği kullanan bir 3D yapı 2B projeksiyonlar kullanarak limitini üstesinden gelmektedir.
X, y tarifi birkaç milisaniye aşağı gidebilir ederken amacımız nanopositioner piezo cihazın zaman tepki nedeniyle, z-ekseninde hareket döneminde, yaklaşık 30 milisaniye ile sınırlıdır. Yöntemin yeri hassas gürültü oranı 4,5 'için bir sinyal olarak ölçekler. Yöntemin tek belirgin sınırlama, parçacığın ortamının bütüncül bir kaybı, yani, komşu floresan kaynakları ile flüoresans parçacığın etkileşimlerin geçmişi izleme, geçici bir yoğunluk halı 13 yeniden olasılığı ile telafi edilir aynı ya da farklı tayf emisyon ya da sergiler.
Bu lizozomların hareketi, ya da ya da kinesinlerin dyneins ile ilgilidir mikrotübüller boyunca harekete otomatik uğrama, kesecikler, ticari olarak temin edilebilen boya kullanılarak lekelemeden sonra canlı hücre içinde takip edilebileceğini göstermektedir. Son zamanlarda, lizozomların 2D izleme corr olduveziküller mikrotübül-mikrotübül kavşaklarda 8 de almak yolları tespit çaba mikrotübül ağının süper çözünürlüklü görüntüleme, için sevinçli. Lızozomlara 3D yörüngeleri tek yönlü hareket daha karmaşık bir davranış gösterebilir. Ortalama bir hareket, bükme büküm ve tübüller boyunca olası rotasyonlar bu yörüngeleri görülebilir, görülebilir yönetti rağmen.
Bu deneyler, bu iki kritik adım belirledik: birincisi, parlak lekeli parçacıklar elde etmek için yeterince yüksek, aynı zamanda lizozomların bir işaretleme yoğunluğu elde etmek için gerekli olan, ve aynı zamanda, düşük bir parçacık yoğunluğu sağlar bireysel parçacıkların izlenmesine izin için yeterli. İki geçiş parçacıklar durumunda, mikroskop izleme sırasında bir diğerine bir parçacığın geçiş olabilir. İkinci önemli adım, makul bir denge olması izin, piksel bekleme süresinin seçimi ile ilgilidirgürültü oranı ve izleme hızı yüksek sinyal arasını doldurun. Biz izleme siklus başına 32 msn sırayla izleme hızı 1 mm / sn altındaki hızlarda hızlı yönettiği hareketi geçiren lizozomları takip etmek genellikle yeterli olduğunu gözlemledik.
Özetle, yörünge izleme üç boyutlu ve <40 msn floresan etiketli veziküllerin hücre içi hareket bir zamansal çözünürlüğe sahip ölçmek için sağlar. 3D yörünge izleme gibi bize farklı derece dinamik hücresel süreçlerin kromatin dinamikleri gerçek zamanlı transkripsiyon ve hücre içi ortamda plasmonik nanopartiküllerin difüzyon bir çalışma, çalışma için gelecekte istihdam edilecek potansiyeline sahiptir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Lysotracker DND 26 | Life Technologies | L-7526 | |
| Tubuline tracker Green | Life Technologies | T34075 | |
| Mitotracker RED | Life Technologies | M7512 | |
| Coherent Chamelon- ultra II TI | Coherent | ||
| Glan Taylor Calcite Polarizer | Melles Griot | 03PTA001 | |
| Galvanometer-motor mirror | Cambridge Technologies | M 6350 | |
| Dichroic mirror | Chroma Technologies | 700 DCSPXR | |
| Motorized stage | ASI | MS2000 | |
| Piezo | PI | P721-LLQ | |
| Photomultiplier tube | Hamamatsu | H7422P-40 | |
| Data acquisition card | IO tech | PCI 1128-4000 | |
| Imaging software | LFD | Global for images-SimFCS |
References
- So, P. T., Dong, C. Y., Masters, B. R., Berland, K. M. Two photon excitation fluorescence microscopy. Annu Rev Biomed Eng. 2, 399-429 (2000).
- Dupont, A., Lamb, D. C. Nanoscale three dimensional single particle tracking. Nanoscale. 3, 4532-4541 (2011).
- Estrada, L. C., Gratton, E. 3D nanometer images of biological fibers by directed motion of gold nanoparticles. Nano Lett. 11, 4656-4660 (2011).
- Kis-Petikova, K., Gratton, E. Distance measurement by circular scanning of the excitation beam in the two photon microscope. Microscopy Research and Technique. 63, 34-49 (2004).
- Levi, V., Ruan, Q., Gratton, E. 3 D particle tracking in a two photon microscope application to the study of molecular dynamics in cells. Biophys J. 88, 2919-2928 (2005).
- Lund, F. W., Wustner, D. A comparison of single particle tracking and temporal image correlation spectroscopy for quantitative analysis of endosome motility. Journal of Microscopy. 252, 169-188 (2013).
- Nath, S., et al. Spreading of Neurodegenerative Pathology via Neuron to Neuron Transmission of beta Amyloid. Journal of Neuroscience. 32, 8767-8777 (2012).
- Balint, S., Vilanova, I. V., Alvarez, A. S., Lakadamyali, M. Correlative live cell and superresolution microscopy reveals cargo transport dynamics at microtubule intersections. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110, 3375-3380 (2013).
- Huotari, J., Helenius, A.
- Ragan, T., So, P. T., Kwon, H. S., Gratton, E. 3D particle tracking on the two photon microscope. Multiphoton Microscopy in the Biomedical Sciences. 2, 247-258 (2001).
- Konig, K., So, P. T. C., Mantulin, W. W., Gratton, E. Cellular response to near-infrared femtosecond laser pulses in two photon microscopes. Optics Letters. 22, 135-136 (1997).
- Caviston, J. P., Holzbaur, E. L. Microtubule motors at the intersection of trafficking and transport. Trends Cell Biol. 16, 530-537 (2006).
- Cardarelli, F., Lanzano, L., Gratton, E. Capturing directed molecular motion in the nuclear pore complex of live cells. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 109, 9863-9868 (2012).
