3D Orbital Tracking i en modificeret to-foton mikroskop: en ansøgning til sporing af intracellulære vesikler
Summary
In this video protocol we track – at high speed and in three dimensions – fluorescently labeled lysosomes within living cells, using the orbital tracking method in a modified two-photon microscope.
Abstract
Formålet med denne video protokol er at diskutere, hvordan man kan udføre og analysere en tredimensionel fluorescerende orbital partikel sporing eksperiment ved hjælp af en modificeret to-foton mikroskop 1. I modsætning til konventionelle metoder (rasterskandering eller bredt felt baseret på en stak af rammer), 3D orbital sporing giver mulighed for at lokalisere og følge med en høj rumlig (10 nm nøjagtighed) og tidsmæssig opløsning (50 Hz frekvens respons) 3D forskydning af en bevægende fluorescerende partikel på længde-skalaer hundrede mikrometer 2. Metoden er baseret på en feedback-algoritme, der styrer hardwaren på et to-foton-laserscanningmikroskop for at udføre en cirkulær bane omkring genstanden, der skal spores: feedback mekanisme vil opretholde det fluorescerende objekt i midten ved at styre forskydningen af scanningsstrålen 3-5. For at vise fordelene ved denne teknik, vi fulgte en hurtig bevægelse organel, lysosomet inden aliving celle 6,7. Celler blev udpladet i overensstemmelse med standardprotokoller og farvet under anvendelse af en kommercielt lysosom farvestof. Vi diskuterer kort hardwarekonfiguration og mere detaljeret kontrol software, til at udføre en 3D orbital sporing eksperiment inde levende celler. Vi diskutere i detaljer de parametre, der kræves for at styre scanning mikroskop og muliggøre bevægelse af strålen i et lukket kredsløb omkring partiklen. Vi konkluderer ved at demonstrere, hvordan denne metode kan bruges effektivt til at spore den hurtige bevægelse af en mærket lysosom langs mikrotubuli i 3D i en levende celle. Lysosomer kan bevæge sig med hastigheder i området 0,4-0,5 um / s, der typisk viser en rettet bevægelse langs mikrotubulære netværk 8.
Introduction
Et stort antal af fremgangsmåder er blevet udviklet til dato til at spore fluorescerende partikler i tre dimensioner ved hjælp af et mikroskop. De fleste metoder hviler på anvendelse af hurtige kameraer, velegnet til at spore i to dimensioner, typisk kombineret med tilpassede modifikationer af emission optik mikroskop for at opnå tracking i den aksiale retning. Laserscanningmikroskoper (enten konfokal eller to fotoner) konventionelt kan spore en fluorescerende partikel ved at udføre en sekvens af z-stakke, selv om denne proces er typisk tidskrævende, og giver rimelig tid opløsning (10 Hz), hvis partikel, der spores, er holdes i centrum af en lille raster billeddannelse region af en aktiv feedback-mekanisme 2.
Ideen om at binde sig til partiklen er grundlaget for orbital sporing metode. I stedet for en raster scanne en cirkulær bane udføres omkring fluorescerende partikel. Intensiteten af fluorescensen langskredsløb nøjagtigt lokaliserer partiklen stilling 4.
Den lokaliserede stilling af partiklen kan derefter anvendes til at aktivere mikroskop scannere og recentrere orbit på partiklen stilling. Galvanometret scannere mikroskopet som drives af en analog spænding. AC komponent af denne spænding gør det muligt at udføre en bane med den fokuserede laserstråle, dvs en sinus og en cosinus bølge påføres X og Y scanning spejle vil tillade udførelse af en cirkulær bane. DC offset signalet lettere at ændre positionen af kredsløbet centrum. Når en bane, bestemmes og bølgeform til AC signalet er konfigureret, feedback-systemet behov for at opdatere kun DC-komponenten af signalet.
En software i stand til at læse det fluorescerende signal opsamlet fra detektorerne er nødvendig for at styre scannere og detektorerne, at beregne positionen af partiklen og opdatere DC fraindstillet. For en succesfuld tilbagemelding imaging et omhyggeligt valg af Orbit parametre (størrelse og timing) er påkrævet, og disse parametre skal justeres på grundlag af de særlige kendetegn ved de fluorescerende partikler, at det er nødvendigt at spore.
De fysiske og matematiske grundlag for teknikken blev beskrevet tidligere 4,5 for både 2D og 3D-applikationer. I denne protokol vi kort beskrive de vigtigste hardwarekomponenter opsætningen, og mere detaljeret valget af parametre og af prøveforberedelse kræves for en typisk eksperiment tillader os efter forskydningen af en lysosom ved en høj tidslig opløsning i en levende celle.
Protocol
Representative Results
Discussion
Trods de enorme fremskridtene i fluorescensmikroskopi teknikker og besætninger i de seneste år, opnåede baner fluorescerende partikler i tre dimensioner med en høj tidsmæssig opløsning er forblevet en udfordring på området. Hvis høj tidsmæssig opløsning er opnået sporing partikler i to dimensioner, udvidelse til den aksiale retning bringer typisk en drastisk reduktion i frekvensgangen af systemet 10.
I denne video-protokol fokuserede vi på den demonstrative anvendelse…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
This project was supported by grants NIH NIGMS 8P41 GM103540-28 and P50-GM076516
Materials
| Name | Company | Model |
| Lysotracker DND 26 | Life technologies | L-7526 |
| tubuline tracker Green | Life technologies | T34075 |
| Mitotracker RED | Life technologies | M7512 |
| Coherent Chamelon- ultra II TI | Coherent | |
| Calcite polarize | Melles Griot Glan | |
| Galvanometer-motor mirror | Cambridge technologies | M 6350 |
| Dichroic mirror | Chroma technologies | 700 DCSPXR |
| Motorized stage | ASI | MS2000 |
| Piezo | PI | P721-LLQ |
| Photomultiplier tube | Hamamatsu | H7422P-40 |
| Data acquisition card | IO tech | PCI 1128-4000 |
| Imaging software | LFD | Global for images-SimFCS |
References
- So, P. T., Dong, C. Y., Masters, B. R., Berland, K. M. Two photon excitation fluorescence microscopy. Annu Rev Biomed Eng. 2, 399-429 (2000).
- Dupont, A., Lamb, D. C. Nanoscale three dimensional single particle tracking. Nanoscale. 3, 4532-4541 (2011).
- Estrada, L. C., Gratton, E. 3D nanometer images of biological fibers by directed motion of gold nanoparticles. Nano Lett. 11, 4656-4660 (2011).
- Kis-Petikova, K., Gratton, E. Distance measurement by circular scanning of the excitation beam in the two photon microscope. Microscopy Research and Technique. 63, 34-49 (2004).
- Levi, V., Ruan, Q., Gratton, E. 3 D particle tracking in a two photon microscope application to the study of molecular dynamics in cells. Biophys J. 88, 2919-2928 (2005).
- Lund, F. W., Wustner, D. A comparison of single particle tracking and temporal image correlation spectroscopy for quantitative analysis of endosome motility. Journal of Microscopy. 252, 169-188 (2013).
- Nath, S., et al. Spreading of Neurodegenerative Pathology via Neuron to Neuron Transmission of beta Amyloid. Journal of Neuroscience. 32, 8767-8777 (2012).
- Balint, S., Vilanova, I. V., Alvarez, A. S., Lakadamyali, M. Correlative live cell and superresolution microscopy reveals cargo transport dynamics at microtubule intersections. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110, 3375-3380 (2013).
- Huotari, J., Helenius, A. Endosome maturation. Embo Journal. 30, 3481-3500 (2011).
- Ragan, T., So, P. T., Kwon, H. S., Gratton, E. 3D particle tracking on the two photon microscope. Multiphoton Microscopy in the Biomedical Sciences. 2, 247-258 (2001).
- Konig, K., So, P. T. C., Mantulin, W. W., Gratton, E. Cellular response to near-infrared femtosecond laser pulses in two photon microscopes. Optics Letters. 22, 135-136 (1997).
- Caviston, J. P., Holzbaur, E. L. Microtubule motors at the intersection of trafficking and transport. Trends Cell Biol. 16, 530-537 (2006).
- Cardarelli, F., Lanzano, L., Gratton, E. Capturing directed molecular motion in the nuclear pore complex of live cells. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 109, 9863-9868 (2012).
