Abstract
このビデオプロトコルの目的は、改変された二光子顕微鏡1を用いた三次元蛍光軌道粒子追跡実験を行い、分析する方法を議論することである。従来のアプローチ（ラスタスキャンまたは広視野フレームのスタックに基づく）とは対照的に、3D軌道追跡は、3次元変位を局所化し、高い空間（10nmの精度）と時間分解能（50 Hzの周波数応答）で追従させるミクロン2、数百の長さスケールに移る蛍光粒子。方法は、追跡される物体の周りの円軌道を実行するために二光子レーザー走査顕微鏡のハードウェアを制御フィードバックアルゴリズムに基づいている：フィードバック機構は、変位を制御することにより、中央に蛍光被写体を維持する走査ビーム3-5。この技術の利点を実証するために、私たちはアル中で動きの速い細胞小器官、リソソームを、続いてivingセル6,7。細胞は、標準的なプロトコルに従って播種し、商業的にリソソーム色素を用いて染色した。私たちは、生きた細胞内の3D軌道追跡実験を行うために、短時間のハードウェア構成をより詳細に制御ソフトウェアを議論する。私たちは、詳細に走査顕微鏡を制御し、粒子の周りに周回軌道でビームの運動を可能にするために必要なパラメータを議論する。私たちは、この方法が効果的に生きた細胞内の3Dでの微小管に沿っラベルリソソームの速い動きを追跡するために使用することができる方法を示すことで結論付けている。リソソームは、典型的には、微小管ネットワーク8に沿って向けられた動きを表示し、0.4ミクロン/秒の範囲の速度で移動することができる。
Introduction
アプローチは、多数の顕微鏡を用いて三次元で蛍光粒子を追跡するためにこれまでに開発されてきた。ほとんどのアプローチは、理想的には、典型的には、軸方向にトラッキングを達成するために、顕微鏡の発光光学系のカスタマイズされた修飾と組み合わせた二次元的に追跡するために適した、高速カメラの使用に依存する。このプロセスは、典型的には、時間がかかり、かつ粒子が追跡されている場合にのみ、妥当な時間分解能（10 Hz）をされ得たが、レーザ走査型顕微鏡（共焦点またはつの光子のいずれか）は従来のz-スタックの時間シーケンスを実行することにより、蛍光粒子を追跡することができ能動的フィードバック機構2により小さなラスタ撮像領域の中心に保った。
ロックイン粒子にするという考えは、軌道追跡法の拠点となっています。代わりに、ラスタの円軌道を蛍光粒子の周囲に実行されるスキャンします。に沿って蛍光の強度軌道は正確に粒子位置4を局在する。
粒子の局所的な位置は、顕微鏡スキャナおよび再中央粒子位置の軌道を作動させるために使用することができる。顕微鏡のガルバノスキャナはアナログ電圧によって駆動される。この電圧の交流成分、 すなわち正弦波、集束レーザビームを軌道を行うことができ、XとYスキャンミラーに適用される余弦波を円軌道を実行可能にする。信号のDCオフセットは、軌道中心の位置を変化させることを容易にする。軌道周期が決定され、AC信号の波形が設定されると、フィードバックシステムは、信号のDC成分のみを更新する必要がある。
検出器から収集した蛍光シグナルを読み取ることができるソフトウェアは、スキャナおよび検出器を制御するために、粒子の位置を計算し、DC電源をオフに更新が要求されるセット。軌道パラメータ（サイズ及びタイミング）の注意深い選択を撮像成功したフィードバックに必要なこれらのパラメータは、追跡する必要がある蛍光粒子の特性に基づいて調整されなければならないれる。
技術の物理的および数学的な基礎は、2Dと3D両方のアプリケーションのために、過去4,5で説明した。このプロトコルでは、簡単にセットアップの主要なハードウェアコンポーネントを記述し、より詳細にパラメータの選択と私たちは、生細胞内で高い時間分解能でのリソソームの変位を可能にする以下の典型的な実験に必要なサンプル調製。
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Protocol
1試料の調製
- 10％ウシ胎児血清およびペニシリンストレプトマイシン50μgの/ mlの100 IU / mlを補足したDMEMを用いて組織培養フラスコ中CHOK1細胞を維持する。 37℃で5％CO 2の加湿インキュベーターで細胞を培養する。
- 収穫した後、0.16ミリメートルの表面厚さで直径14mmのマイクロウェルにCHOK1細胞をプレート。イメージング、周りの60〜70％の集密度に最適な密度のための種の細胞。
- 37°C、5％CO 2で一晩細胞をインキュベートする。 HBSS（ハンクス緩衝生理食塩液）中で細胞を3回洗浄し、リソトラッカーDND26の50 nMの緑とチューブリントラッカーグリーンの150 nMのを含む溶液で細胞を培養する。 37℃で1時間、細胞をインキュベートする。オプションの手順：インキュベーションに先立って、ミトコンドリアマトリックス染色色素（25 nM）を用いて付加的な染色を行う。
- 未結合の色素を除去し、HBSSで細胞を3回洗浄する。虚部の前に新鮮なDMEM増殖培地を追加します。細胞をる。
2顕微鏡の構成
ビデオプロトコルに記載粒子追跡用顕微鏡は、市販の倒立顕微鏡（ 図4）のフレームに組み付けられている。しかし3D軌道粒子追跡のための商用モジュールが利用可能になりました。
- 690 nmの1040 nmの波長可変出力波長範囲は、Saはフェムト秒レーザー励起光源：コヒーレントカメレオン-ウルトラIIチタンを使用してください。
- レーザ光は、IRコーティングされたミラーを用いて顕微鏡の背面ポートに揃っていることを確認します。レーザビームは、方解石直線偏光子に続いて回転半波長板を用いて減衰される。サンプルの平均電力は、0.5〜2 mWの間にあるようにビームを減衰させる。
注：レーザ光が試料面内の集束ビームの位置および軌道の制御を可能にするガルバノモータ作動一対のミラーによって反射される。中にショートパスダイクロイックミラーでの反射後の顕微鏡対物レンズの後方に入る前に、ビームエキスパンダを通過するガルバノミラーから出るコリメートされたレーザビームが拡大される典型的な構成（10X）。 - 光路内に高開口数水目標（60X、NA 1.2）を配置することにより、試料からの蛍光発光を収集します。 1つまたは2つのチャネル構成で所望の発光波長に応じて蛍光フィルタキューブを選択する。さらに、放出された蛍光のスペクトル範囲を選択するために、発光帯域フィルタを採用している。
- 電動ステージ上にサンプルを置き、客観的なピエゾコントローラを使用して顕微鏡対物レンズの微動を調整します。
- 信号を判別し、デジタルI / Oデータ取得カードに送信される光電子増倍管にフィルターキューブからの光を導く。
注：コンピュータの波形は、I / Oカードのアナログ出力であり、提供します：ある生成されたスキャナ制御エレクトロニクス編。光電子増倍管やスキャナへの出力信号から光子計数入力を測定し、蛍光ダイナミクスSimFCSソフトウェアのための研究所のI / Oカードを介して制御される。
3イメージング
- ステージ上のセルを置き、透過光照明を使用して焦点を合わせる。
- 色素を取り込んだ細胞を同定する基礎となる微小管を可視化するために、ラスタースキャン画像に切り替える。小胞の動きが存在している初期領域を特定します。
- 孤立した小胞が識別されると、軌道追跡のための次のパラメータを設定します。
- 追跡されている粒子の大きさに合わせて円形走査のサイズを定義する軌道の半径を選択します。ポイントエミッタでは、感度および応答を最大にする励起光の点広がり関数（PSF）の腰部に等しい軌道の半径を設定する。
- 軸方向を設定します。軸方向に沿った粒子位置を局在化するために行わ二つの軌道との間の距離を定義する距離。 1.5-3倍のPSF腰までの軸方向の距離を設定します。
- また、光漂白速度を決定する軌道の各点に費やされた時間を設定するために、粒子の明るさに応じて滞留時間を定義する。 10〜100秒の間の滞留時間を使用してください。
- 4-32ミリ秒のオーダーで軌道周期が得られ、粒子の位置を決定するための高い時間分解能を提供するために、64または128にそれぞれ軌道の点の数を設定します。
- ラスタースキャンされた画像のカーソル選択により、グラフィカル·ユーザー·インターフェースを介して粒子上にビームをセンタリングするために、ミラーに送信された信号を、DCオフセットを変更します。
- 軌道スキャンラスタイメージングから顕微鏡モードを切り替えることで、追跡を開始します。
- フィードバックとデータ収集を有効にします。
4。TrajectORY分析
- 軌道に沿って「強度カーペット」の形式で、各時点での各ポイントで収集された蛍光を表示するには、ソフトウェアを使用してください。カーペットに沿って収集された強度は、他の明るい物体と粒子の相互作用に関する情報を提供します。同様に、時系列の形で時間の経過とともに光電子増倍管から採取し、蛍光強度の（x、yスキャナおよびz -piezoの時間にわたってDC変位すなわち ）軌跡情報の両方を表示するためにソフトウェアを使用する。
- 軌道内の関心領域のみを選択するために、時系列表現と「強度カーペット」の情報を使用してください。
- 粒子軌道の選択された部分の2次元投影を表示するには、ソフトウェアを使用してください。粒子の蛍光強度に応じて色分けする軌道を適切なコントロールを選択します。
- ページを表示するオプションを選択します蛍光強度に応じて3Dで記事軌道、および色分けそれ。微小管に沿ってリソソームの動きの特徴を視覚化するためにコントロールを使用して3Dで軌道を回転させます。
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Representative Results
このプロトコルによれば、高速3D単一粒子追跡は、蛍光標識されたリソソームの変位を追跡するために修飾された二光子顕微鏡を用いて生細胞の内部で行うことができる。行った実験は、エンドソーム成熟過程9後の細胞内を移動する孤立したリソソームの追跡で構成されています。リソソームは、蛍光緑の色素を用いて染色し、2光子励起を利用し930 nmで励起した。本発明者らのデータは、32ミリ秒（ 図1a）の時間分解能でのx、y、zの変位軌道を得ることが可能であることを示している。カーペット分析は時間（ 図1b）を介してそれぞれの軌道に沿って記録された強度が表示されます。放出された蛍光の積分強度を記録することができるトラッキング（ 図2a）中に。微小管ネットワーク上を移動する小胞から予想されるように再構成された3D軌道は、指向運動を表示する。 Additionally、それは周辺領域（ 図2b）のラスタ走査画像の3D軌道を相関させることが可能である。これは、微小管の束の方向に沿った粒子の動きを確認する。
ミトコンドリアは、その移動中にこれらのオルガネラと小胞の最終的な相互作用を記録するために、細胞はさらに、赤いマーカーで染色した。これは、のMitoTracker蛍光発光（ 図3b）から記録された強度カーペットにセル（ 図3a）の内側の粒子の3次元軌跡を相関させることが可能である。これは、私たちは、細胞内でのそれらの位置の関数としてミトコンドリアのネットワークと小胞の近接相互作用を記録することができます。 「ミトコンドリアチャネル」に記録されている発光ピークは、細胞小器官が対話する方法についての機能情報を与えるものではありません。これは、それらの相互作用の時間情報のみを提供することができ粒子に関する蛍光物体の相対的な空間位置が追跡されている。この相対位置は、発光ピークが記録された軌道内の角度から抽出される。私たちは、この実験を行うために使用される顕微鏡の概略図を図4に見ることができる。
時間軌跡と強度カーペット対1変位図。時間トレース対A） は、x、y、zのリソソーム変位。b）の強度軌跡（ すなわち 、各円軌道垂直軸に沿って収集された強度がある時間）は、粒子の蛍光周辺の情報を提供します。箱入りの外の明るいスポットは、他の明るい物体と粒子の相互作用に対応しており、目のような軌道でジャンプに関連している電子軌道明るい蛍光ソースで再センター。囲み領域は、2つのジャンプの間に軌道の一部に相当する。
リソソームの3D軌道に続いて図2。 a）はリソソームの軌道の一部の3次元再構成は、粒子追跡を使用して収集。軌跡は、粒子（;青、低い光子カウント赤、高い）から収集した蛍光強度を色分けです。 Axesのスケールは以下にあります。 なお、X、Y、Z軸は異なる範囲を持っています。3D軌道のb）の 2D投影、軌道が収集された直後にスキャンするラスターで撮像された微小管の上に軌跡のオーバーレイを表示する。c）のミトコンドリアはのMitoTrackerで染色。
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図3（930 nmで励起）複数のチャネルに軌道追跡の拡張。 a）細胞。b）の緑チャネル（このチャネルに集め、蛍光の強度カーペット内のリソソームの3次元軌跡が追跡のために使用されます）。c）のミトコンドリアは赤色蛍光基質を用いて染色した赤チャネル、中強度カーペット色素を標的。リソソームを周回ビームは、ミトコンドリアマトリックスに交差するように軌道がミトコンドリア（矢印）と接触して取得した領域は、カーペットの強度バンプとして表示されます。
図実験装置の回路図4：2つの光子顕微鏡を変更しました 。レーザーのセットアップの模式図：2光子のTi：範囲690-1,040 nmのでSaはレーザーは私たちだった編、偏光子と半波長板は、励起パワーを制御するために使用される。他のすべての項目が指示された略語を使用して、図に記載されています。私たちは、1.2のNAと60Xの対物レンズを使用していました。
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Discussion
ここ数年、蛍光顕微鏡技術とインストルメンテーションの驚異的な進歩にもかかわらず、高い時間分解能で三次元での蛍光粒子の軌跡を達成することは、フィールドでの課題となってきた。高い時間分解能は、二次元でトラッキング粒子が達成された場合には、軸方向への拡張は、典型的には、システム10の周波数応答の劇的な減少をもたらす。
このビデオプロトコルでは、二光子顕微鏡を用いて高時間分解能（この実験では32ミリ秒）で生きている細胞内で三次元的に個別の粒子を追跡実証応用に焦点を当てた。このような実験を行うために必要なセットアップは、通常、レーザー走査顕微鏡を実施する研究室が利用できます。 3D軌道追跡のための両方の楽器のアドオンだけでなく、制御ソフトウェアはcommerciaのために、市販されているそのようなオリンパス製のものとしてlのレーザー走査型顕微鏡。それが放出される蛍光の脱スキャンを必要としないので、利用可能なパルス状の高出力赤外線レーザ源の使用は、実験の設計に有利である。さらにそれは、赤外線照射が焦点蛍光及び光退色切れの減少を考えると、特定の条件の下で11、細胞に対してより良性であることが過去に実証された。
二次元の蛍光粒子の高速トラッキング感度カメラを用いて行うことができるが、任意の三次元情報の欠如は、多くの場合、軌跡情報の生物物理学的な意味を解釈を限定することができる。例えば、微小管に沿って移動する小胞は、頻繁に微小管の交差領域8,12ぶつかる。この状況では、3次元追跡技術の使用は、3D構造の2D投影を使用することの限界を克服する。
x方向、y方向は、それが数ミリ秒にまで行くことができますしながら、私たちの目的はナノポジショナーのピエゾ素子の時間応答に起因して、z軸の移動時間は、約30ミリ秒に制限されています。方法の局在化精度がノイズ比4,5に信号としてスケーリングする。この方法の唯一の明白な制限は、粒子の環境をグローバルな視野の喪失、 すなわち 、隣り合う蛍光源と蛍光体粒子との相互作用の歴史をたどる、時間的強度カーペット13を再構築する可能性によって補償される同じまたは異なるスペクトル放出のいずれかを表示する。
私たちは、リソソームの動きは、いずれかのキネシンやダイニンによって、微小管に沿った動きを演出電源受ける小胞は、市販の染料を用いた染色後に生細胞内で追跡することができることを示している。最近では、リソソームの2D追跡がCORRた小胞は、微小管の微小管交差点8にたどるルートを検出する努力において、微小管ネットワークの超解像イメージングに高揚。リソソームの3D軌跡は、単方向の動きよりも複雑な挙動を示す。運動を指示し、平均曲げ、観察することができますが、尿細管に沿ってねじれ、可能な回転がこれらの軌道から観測することができる。
私たちは、これらの実験を実行する2つの重要な段階を同定した：まず、それは明るく染色された粒子を得るのに十分高いと同時に、あるリソソームの標識密度を達成するために必要であると同時に、それは、低粒子密度を提供個別の粒子の追跡を可能にするのに十分。追跡しながら、直交する2粒子の場合、顕微鏡は別の一つの粒子から切り替えてもよい。第二の重要なステップは、合理的なバランスがあることが可能、画素滞留時間の選択に関し、ノイズ比およびトラッキング速度にトゥイーンハイ信号を出力する。私たちは、トラッキング·サイクル当たり32ミリ秒のオーダーの追従速度が1μm/秒以下の速度で高速に向かう動きを受けて、リソソームに従うことが、一般的に十分であることを観察した。
要約すると、軌道追跡は、立体的にし、<40ミリ秒、蛍光標識された小胞の細胞内運動の時間分解能で測定することができます。 3D軌道追跡は、私たち、異なる高度に動的な細胞プロセスクロマチン動態のリアルタイム転写および細胞内媒体中のプラズモニックナノ粒子の拡散の研究の研究のために将来的に採用される可能性を有している。
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Lysotracker DND 26 | Life Technologies | L-7526 | |
| Tubuline tracker Green | Life Technologies | T34075 | |
| Mitotracker RED | Life Technologies | M7512 | |
| Coherent Chamelon- ultra II TI | Coherent | ||
| Glan Taylor Calcite Polarizer | Melles Griot | 03PTA001 | |
| Galvanometer-motor mirror | Cambridge Technologies | M 6350 | |
| Dichroic mirror | Chroma Technologies | 700 DCSPXR | |
| Motorized stage | ASI | MS2000 | |
| Piezo | PI | P721-LLQ | |
| Photomultiplier tube | Hamamatsu | H7422P-40 | |
| Data acquisition card | IO tech | PCI 1128-4000 | |
| Imaging software | LFD | Global for images-SimFCS |
References
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