Introduction
Den axonal fack av nervceller visar en hög grad av funktionellt oberoende från somato-dendritiska facket. I projektion nervceller, axoner innehåller de flesta av de neuronala protein 1,2. Studiet av fysiologi och patofysiologi axoner har tagit fart i neurovetenskap samhället eftersom nyare studier har visat att tidig axonal dysfunktion verkar vara ett vanligt inslag i neurodegenerativa sjukdomar och neuropsykiatriska sjukdomar 3. Det verkar troligt att en bättre förståelse av axonal-exklusiva mekanismer under normala och patologiska förhållanden kommer att belysa de tidiga händelser som driver dysfunktion.
Den nuvarande protokollet beskriver hur man använder kulturinsatser som bär ett poröst membran (filter) för att erhålla stora mängder ren axonal material som är lämpligt för biokemisk och immuncytokemiska analyser. Användningen av filterinsatser för att studera axonal biologi infördes först av Steward ochkollegor 4 och ytterligare utvecklats av Twiss och kollegor 5 till sin nuvarande konfiguration. Tekniken är nu i bruk av grupper som studerar olika aspekter av axonal och Dendrite biologi, med smärre ändringar i varje enskilt fall för att rymma för befolkningen i nervceller som studerats, de behandlingar som utförs och vilken typ av biokemiska analyser används 6-9. Den nuvarande protokollet har inte för avsikt att rymma alla alternativ för så många olika applikationer, utan snarare ger en enkel metod som är lämplig för de flesta applikationer. Särskilt det protokoll som beskrivs här använder en trippel beläggning som maximerar axonal avkastning för biokemiska analyser och är lämpligast att studera axonal degeneration-andra beläggningar som beskrivs i litteraturen producerade mindre axoner som drar tillbaka och urarta snabbare när miste trofiska faktorer 9.
I detta förfarande förblir neuronala cellkroppar isolerade ovanpå filter while axoner passera genom porerna och växa längs sin bottenyta. Rena axoner (gratis glia och neuronala cellkropps föroreningar) som växer på undersidan av filtret kan tas för biokemiska analyser eller kan fixeras på plats och granskas av immunocytokemiska tekniker 9. Förfarandet förlitar sig på användningen av embryonala sensoriska neuroner från dorsala rotganglier (DRG). Embryonala DRG används ofta för att studera axonal biologi eftersom neuriter från dessa celler genomgår snabb och robust tillväxt in vitro då upprätthålls i nervtillväxtfaktorn (NGF), och eftersom de snabbt genomgår degeneration när de berövas denna faktor. Även DRG nervceller saknar dendriter, så att alla neuriter som samlas in av denna metod är rent axoner.
Filterinsatser utgör en stor fördel jämfört med andra metoder som används för att studera axoner. Studier som förlitar sig på användning av mikroskopi för att differentiera processer som förekommer i cellen soma från dem i enXON ger begränsad biokemisk information. Som ett annat exempel, compartmentalized kultursystem (t.ex. Campenot kammare 10 eller mikrofluidikanordningar 11) är användbara för avbildning och differentierad behandling av cellfack utan ger endast små mängder av axonal material, utgör hinder för att använda dessa tekniker för biokemiska analyser som kräver relativt stora mängder prov. Vidare kräver användningen betydande utbildning samt specialiserade enheter, och de är tidskrävande. En annan metod som ofta används för att isolera axoner från explants är att manuellt ta bort en Explantation center (innehåller neuronala cellkroppar) före axonal provsamling. Även om detta kan producera stora mängder axon-berikade preparat, kan axoner i denna beredning vara insvept i glia och snabbt avlägsna 20 Explantation kroppar i följd från 6 brunnar (som ett exempel på en minimal experiment) är tidskrävande och på gränsen till genomförbarhet.
Däremot den metod som presenteras här ger rikliga och rena axonal preparat som sedan kan analyseras av praktiskt taget alla biokemiska teknik som ofta används för att analysera hela cellysat, som western blot, immunprecipitering 6, norra blot 5 masspektrometri 6, RNA-rening 7,12,13, bland andra. Dessutom kan protokollet tillämpas på immunofluorescens (IF)-tekniker, eftersom det är möjligt att fixera axoner som växer i den undre sidan av filtret för att ytterligare undersöka dem genom IF. Detta tillvägagångssätt underlättar i hög grad analysen av axonal specifika processer, eftersom det inte finns några cellkroppar i den slutliga beredningen. Detta är en betydande fördel eftersom en hög immunfluorescerande signal från cellkroppar gräver ofta undersökning och analys av en svagare signal som kommer från tunna strukturer såsom axoner.
Två tillämpningar av odlingsmetod för att studera axonal degeneration ARe beskrivits; en modell för utvecklings beskärning och en modell av skada-inducerad degeneration (vanligen kallad Wallerian degeneration). Modelleringen av utvecklings beskärning är baserad på det faktum att sensoriska neuroner in vivo konkurrera om begränsande mängder av mål-härlett NGF och de som misslyckas med att få tillräckligt med neurotrofisk stöd degenererad 14. Detta fenomen kan efterliknas i embryonala DRG-kulturer genom att dra tillbaka NGF från odlingsmediet, vilket som inträffar in vivo, initieras axonal degenerering följt av cellkroppen förstörelse. För att modellera Wallerian degeneration, är den övre sidan av filtret med cellkropparna bortskrapad. De axoner som hade vuxit på undersidan av filtret blir fysiskt separerade från cellkroppar och därefter genomgå en snabb och stereotypa degenerativ process som kallas Wallerian degeneration 15, uppkallad efter A. Waller som först rapporterade fenomenet 1850 16.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
OBS: Följande procedurer är i enlighet med riktlinjer som godkänts av den kanadensiska rådet om Animal Care. Alla ansträngningar görs för att minimera smärta och ångest av djur under förfarandena.
1. Beläggning av Filters
ANMÄRKNING: När kulturen Filterinsatserna placeras i brunnarna av flerbrunnsplattor är två fack definieras: det översta facket är det område ovanför insatsen och bottenfacket är en nedanför insatsen Figur 1A.ab. Explantat ympas i topputrymmet där de fäster vid den övre sidan av filtret; många axoner att växa genom filtret och sträcker sig på den undre sidan av filtret, i den undre avdelningen Figur 1A.c. Standardarbets volymer (dvs. för tillämpning beläggningslösning, tvättar, odlingsmedier, etc) är 2 ml för bottenfack och 1 ml för det övre facket och kommer att hänvisas till i protokollet som ", Standard volymer ". Lägg lösningar som börjar med bottenfacket genom att placera spetsen på pipetten i gapet mellan insatsen och den sida av brunnen. Också, luta insatsen till en sida medan dispensering av lösningen för att förhindra bubblor från att fastna på undersidan av filtret.
- Börja beläggning filtren dagen före plätering. Under den sterila vävnadsodling huva, placera 24 mm filterinsatser i en 6-väl emot platta. Inkubera skär med poly-D-lysin i vatten (1 mg / ml) under 1 h vid RT med användning av standardvolymer: 2 ml i den undre avdelningen och 1 ml i toppen.
- Aspirera poly-D-lysin och skölj gång med vatten. Sug vatten, stäng locket och låt plattorna torka i huven O / N. Under aspiration av vätskor, se till att ta bort en kvarleva av vätska som blir fångade direkt under filtret.
- Nästa morgon, späd laminin i vatten (10 mikrogram / ml), blanda och varm vid 37 ° C. Inkubera skär med laminin 1 timme i cell-inkubator vid 37 ° C, med användning av standardvolymer.
- Aspirera laminin och lägga till kollagen i vatten (0,1 mg / ml) och inkubera under 1 h vid RT. I detta fall använder 2 ml för den undre avdelningen och 2 ml för topputrymmet.
- Aspirera kollagen och tvätta en gång med sterilt vatten. Filtren är nu redo att ta emot odlingsmedia och DRG-explantat, som beskrivs i steg 3.
2. Analysera Embryonala dorsalrotganglia (DRG) Explantat
- Söva en 13-dagars gravida kvinnliga musen med en IP-injektion av Avertin (250 mg / kg). Vänta 10-15 minuter och kontrollera om avsaknaden av ögon-och pedalabstinens reflexer. När reflexer är frånvarande, utföra halsdislokation.
- Desinficera alla kirurgiska instrument och kvinnlig buken med 70% etanol. Låt instrument för att torka. Håll i huden på buken och klipp genom huden och muskelskikten för att exponera bukhålan.
- Ta bort livmodern genom att lossa från livmoderhalsen och äggstockarna. I en sterile huva, ta bort embryon från livmodern med sax och samla dem i en petriskål fylld med iskallt L15 media. Håll på is.
OBS: Se tidigare tekniska rapporter för ytterligare information om hur man får embryon av 13 dagars dräktighet 17,18. - Under mikroskop, låg embryot på en sida och använda små våren sax för att avlägsna huvudet. Gör ett snitt på långsidorna för att göra sig av med bröstet, magen, ben och svans. Håll ryggen med ryggraden, lägg ventrala sidan uppåt och ta bort alla inre organ.
- Med små våren sax, utsätta hela ryggmärgen genom att skära av ryggraden från den ventrala sidan längs mittlinjen. Håll stommen ner med en pincett (# 3) och använder ett andra par för att hålla ryggmärgen med dess mest rostrala aspekten.
- Långsamt och försiktigt dra sladden borta från ryggradskaviteten och nypa bort DRG från ryggmärgen med hjälp av ultratunna pincett (# 5). Gruppen de DRG som skall samlas in påbotten av skålen.
- Samla grupperade DRG genom att aspirera med en 200 l pipett spets som har skurits för att förstora dess öppning. Placera DRG i ett rör och lämna på is tills DRG kollektionen är klar.
OBS: Vit / transparent tips är att föredra eftersom DRG inte fastnar på väggarna i detta tips (jämfört med vanliga gula spetsar). Flushing tips med media före användning ytterligare förhindrar DRG fastnar på dess väggar.
3. Sådd och underhåll av dorsalrotganglia Explantat på Filter
- Lägg komplett DRG medier vid 37 ° C till de belagda skär med användning av standardvolymer. Supplement bottenfacket media med 15 ng / ml av NGF, och samtidigt hålla den översta facket NGF-fri.
OBS: Även om NGF diffunderar effektivt över filtret och dess koncentration jämvikt inom några timmar, har vi observerat att tillämpa NGF till botten facket direkt innan sådd signifikant ökar axonal avkastning på bottom ytan av filtret. - Överför DRG från röret till filtren med hjälp av en 1000 l pipett med en spets trimmas för att förstora dess öppning.
- Rita media i spetsen 2-3x innan insamling av DRG. Detta hindrar dem från att klibba fast vid den inre sidan av spetsen. Samma spets kan återanvändas för alla brunnar. Användningen av färglösa tips (kontra vanliga blåa tips) minskar DRG fastnar på spetsytan.
- För att överföra DRG, ställa pipetten på 800 pl. Sug ca 200 l av media från ovansidan av filtret, sedan gå till DRG-innehållande rör och pipet en liten volym upp och ner - för att suspendera DRG som har sjunkit till botten. Sug upp hela volymen och pipettspetsar DRG dränka spetsen i mitten av skäret.
- När alla insatser är laddade, stäng locket plattan och snurra plattan 10x, knacka försiktigt på huven bänken mellan varje virvel. Dessa rörelser ökar axonal avkastning genom att hjälpa DRG explants handfat ochfästa till filtret. Detta bidrar också fördela explants jämnt så att axoner från olika explantat inte överlappar varandra.
OBS! Explantation seeding förfarande som beskrivs i föregående steg avsevärt ökar den totala frekvensen av Explantation fastsättning på underlaget (upp till 75%). Mest påtagligt, pipetteringsförfarandet hindrar lätt explants från flyter på medieytan istället för att sjunka till botten av insatsen. - För biokemiska analyser, frö DRG från ett embryo (cirka 30) per filter. För morfologiska analyser, använda antingen hälften eller en tredjedel av de DRG från ett embryo (10-15). Detta beslut måste fattas innan insamling av DRG i rör, så att alla DRG i ett rör är seedade i en enda bra (om det är 30, 15, eller 10 DRG).
- Bibehåll kulturer i en cellinkubator vid 37 ° C, ändra media var 2-3 dagar. För att ändra media, aspirera översta facket först, följt av den undre avdelningen. Lägg till nya medier i standardvolyms som börjar med bottenfacket.
OBS: För att förhindra att celler / axoner från torkning, inte ändrar medier i mer än 3 insatser samtidigt. DRG odlas på filter i närvaro av NGF kommer att sträcka sig långa axoner, når upp till 2 mm efter 2 dagar i odling.
4. Trofisk faktor Återkallande Behandling
NGF tillbakadragande framkallar axonal degeneration med axonal fragmentering (bestäms av fas kontrast och β-III-tubulin IF) som först visas runt 12 timmar efter uttag. Komplett fragmentering uppnås genom 36 timmar. Hur länge degeneration lämnas att fortskrida under måste väljas av slutanvändaren i enlighet med den experimentella utformningen.
- Efter 2-dagars axonal förlängning fas, ändrar media från topp-och bottenutrymmena till media som saknar NGF och innehåller anti-NGF-antikroppar (1 pg / ml) att binda eventuellt återstående (eller endogent producerat) NGF.
- Återgå plattorna till cellinkubator (37 ° C) för att tillåtaNGF tillbakadragande-inducerad degenerering fortgå under önskad tid.
- Proceed to proteinextraktion (steg 6) för undersökning med western blöt eller direkt undersöka filtren genom IF (steg 7).
5. Axonal transection att inducera Wallerian degeneration
Denna procedur lämnar axoner på bottensidan av filter lösgöras från sin cellkroppen, men annars intakt. Därefter dessa axoner initiera snabbt Wallerian degeneration. Axonal fragmentering (framgår av fas kontrast eller β-III-tubulin IF) först visas med 3 tim efter transektion; med 9 tim, axoner är helt splittrade och är fristående från filtret. Hur länge degeneration lämnas att fortskrida under måste väljas av slutanvändaren i enlighet med den experimentella utformningen.
- Skrapa den övre sidan av filtret, innehållande odlade DRG-explantat med en cellskrapa. Se till fullständigt avlägsnande av toppmaterialet genom att föra skrapan i X-, Y-och cirkulärriktningar.
- Släng media från översta facket som innehåller flytande explants som har skrapats från filtret och ersätta med 1 ml förvärmda, komplett DRG media som innehåller NGF (10 ng / ml).
- Återgå plattan till cellinkubator (37 ° C) för att tillåta Wallerian degeneration fortgå under den tid som valts av slutanvändaren.
- Proceed to proteinextraktion (steg 6) för undersökning med western blöt eller direkt undersöka filtren genom IF (steg 7).
6. Protein Extraction av axonal Prov
- Fyll uppsamlingsrören (1,5 ml) med 75 l av Laemmli provbuffert. Håll rören på is samtidigt skörda axoner från hela uppsättningen av filter.
- Tvätta filtret med DRG-explantat i PBS och skrapa den övre sidan av filtret. Ta bort insatsen från plattan, rengör den övre sidan av filtret med en bomullspinne applikator och aspirera någon extra PBS från de övre och nedre sidorna.
- Placera insatsen upsidener på bänken och skär filtret ur insatsen med en vass skalpell. Håll filtret med pincett, nerifrån och upp. Skär ett snitt från periferin till centrum av filtret med en sax.
- Placera filtret ovanpå uppsamlingsröret, och med pincett, tryck på mitten av filtret ner i röret. Medan du gör detta, bör en tratt bildas. Skjut den trattformade filter till botten av röret, så att den är nedsänkt i provbuffert Laemmli.
- Komplett proteinextraktion genom kokning av rör för 4 min. Avlägsna filtret med pincett för att placera den upp och ned in i toppen av röret och att utföra en kort centrifugering (2000 x g under 15 sek). Kasta de torkade filter.
- Lös 10 | il av axonal proteinberedningen på en SDS-PAGE följt av Western blöt för att detektera proteinerna av intresse.
NOTERA: Som en referens, en axonal beredning från 20 explantat odlas för två dagar och lyserades i 100 | il av RIPA-lysbuffert kommer att ha en proteinkoncentration av 4-6ig / | il.
7. Immunfluorescens Granskning av Axoner på Filter
I det följande beskrivs de allmänna manipulationer för att utföra IF färgning på filterinsatser, som exemplifieras genom detektion av β-III-tubulin. Fixativ, bör inkubationstider, koncentrationer och andra uppgifter optimeras för andra antigen-antikropps par.
- Utnyttja tidigare använda 6-brunnar, grundligt rengjorda, för följande tvättar och inkubationer av insatserna.
- Tvätta snabbt skär i PBS. Fix dem i nygjord 4% paraformaldehyd i PBS under 10 min vid RT på skak.
- Efter fixering, skrapa och rengöra den övre sidan av insatsen för att samla in de axoner som växte endast på bottenytan av filtret. Fortsätt med standard inkubationer för IF.
- Inkubera skär i blockeringslösning (TBS, 0,05% Tween 20, 5% skummjölk), med användning av standardvolymer, under 1 timme vid rumstemperatur med försiktig skakning.
- Överför skär till primär antikropp utspädd i blockeringsbuffert (anti-β-III-tubulin, 1:5000), med hjälp av standardvolymer. Inkubera O / N (~ 18 timmar) vid 4 ° C med varsam skakning.
- Tvätta den första antikroppen två gånger i PBS (2 x 10 min vid RT).
- Överför skär till fluorescerande-konjugerade sekundära antikroppar utspädda i blockerande buffert (get anti-mus, 1:2000), med hjälp av standardvolymer. Inkubera täckt från ljus under 2 timmar vid rumstemperatur med försiktig skakning.
- Tvätta den sekundära antikroppen 3x i PBS (3 x 10 min vid RT).
- Efter IF är klar, ta infoga ut, häll bort PBS från den sista tvättningen och rengör den övre sidan av filtret med en bomullspinne applikator. Aspirera all vätska från de övre och nedre sidorna.
- Placera sätta upp och ner på bänken, och klipp ut filtret av insatsen med en vass skalpell.
- Håll filtret med pincett, nackdelen upp, och placera på mikroskopi bild. Överlägg med ett täckglas och fluorescerande-kompatibel mounting media. Låt torka lägenhet i kylrum, täckt från ljus. Undersök och ta bilder med hjälp av en fluorescerande mikroskop.
OBS: Vid förvaring vid 4 ° C och skyddas från ljus, kan dessa preparat förvaras i veckor med minimal förlust av fluorescens. - EXTRA: Alternativt IF kan utföras på filter som har tagits bort från insatsen. För att göra det, skrapa och rengöra den övre sidan av filtren direkt efter fixering.
- Ta filter av skären med en vass skalpell och placera filtren axoner upp på botten av en sex-brunnar.
- Därefter utför inkubationer för IF som anges i 7,4-7,8 och 7.11. Fördelen med detta alternativ är att det sparar reagenser, eftersom, till exempel, kan inkubationstider volymer gå ned till 500 | il (i förhållande till de 3 ml används när filtren är direkt färgas på skären, såsom visas i 7,1 till 7,11).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Dorsala ganglion explants från E13.5 möss växer mycket på filter belagda sekventiellt med poly-D-lysin, laminin och kollagen (Figur 1B, vänster) och når upp till 2 mm inom 2 dagar i odling. Detta substrat kombination ger särskilt översvallande tillväxt; andra kombinationer ger axoner som är betydligt kortare (Figur 1B, höger). Dessutom DRG underhålls på filter förlänga fler och längre axoner än DRG odlas på plast figur 1C.
Filter med porer 1 mikrometer i diameter, som används i detta protokoll, behålla cellkroppar på ovansidan av filtret, samtidigt som neuriter växa genom porerna och sträcker sig på undersidan. Detta visas tydligt genom epifluorescensmikroskopi av filter färgade för kärnor (DAPI) och β-III-tubulin Figur 1D. I intakta filter är det möjligt att observera cellkärnor, båda från neuroner och icke-neuronala celler, koncentrerade i Explantation centrum och en del bestrålning från det. Emellertid, när den övre sidan av filtret skrapas, kärnorna är borta och endast axoner kan detekteras på filter undersidan.
Figur 1E visar ett exempel på en filter botten som ursprungligen ihållande tillväxt på cirka 17 explantat. I detta exempel var den övre sidan rengöras före fixering och därför med immunofluorescens signalen representerar rena axoner på den undre sidan av filtret. Protein utvinning från axonal preparat (undersidan av filtret) saknar nukleära proteiner Figur 1F, vilket visar att beredningen är fri från cellkroppar. Alternativt, när man arbetar med RNA-extraktion, är det möjligt att bekräfta renheten av axonal preparatet genom att jämföra förekomsten av differentiellt lokaliserade mRNA (dvs. γ-aktin) mellan hel-cellysat och axonala preparat (såsom visas med andra 5
Utvecklings beskärning av sensoriska nervceller kan modelleras i filter som utsätts för trofisk faktor deprivation. Efter 2-3 dagar av axon förlängning i närvaro av NGF, är mediet ändras till en som saknar NGF och innehållande en anti-NGF-antikropp som kommer att binda eventuellt återstående NGF figur 2A. Vid önskade tidpunkter, är filter behandlas för biokemi eller immuncytokemi.
Figur 2B visar typiska exempel på undersidorna av filter som färgats för β-III-tubulin före och efter deprivation. Efter 12 timmar av fattigdom finns det lite axonal fragmentering, även om vissa axoner börjar visa beading. Dock är omfattande axonal degeneration uppnås efter 36 av deprivation.
Wallerian degeneration som inducerats av axon transektion av sensoriska neuroner är lätt modelleras i explantaten odlas på filter genom att skrapa den övre sidan av filtret och lämnar efter sig den distala portion av axoner som växte på bottensidan av filter fig 3A. Figur 3B visar typiska exempel på undersidorna av filter som färgats för β-III-tubulin före och efter in-filter axotomy. Vid 3 h efter axotomi, det är liten fragmentering, även om vissa axoner börja visa beading. Av 7,5 timmar, är de flesta axoner fragmenterade eller helt borta. Förbehandling av explantat med nikotinamidadenindinukleotid (NAD +, 5 mM, 30 min förbehandling) skyddar från Wallerian degeneration framkallad på filter, som det gör i andra in vitro-och in vivo-modeller 19.
Figur 1. Filterinsats producerar stora kvantiteter av rena axonala preparat. A) Ett schema av en insats (a), av ett skär i en brunn (b) ochslutliga konfigurationen med DRG explants (c). B) Den sekventiella beläggning av filter med poly-D-lysin, laminin och kollagen ger explantat som växer mer och längre axoner jämfört med de som odlas med poly-D-lysin ensam eller poly-D -lysin och kollagen. Bilderna producerades av kakel överlappande, låg förstoring bilder med bildbehandlingsprogram. C) Under samma substratbeläggningsförhållanden, DRG explants underhålls på filter visar betydligt mer översvallande axonal tillväxt än explantat odlas på plast. D) Den axonal preparatet erhållits genom skrapning den övre sidan av filtret saknar cellkärnor. E) Exempel på axoner som härrör från ca 17 explantat och odlas på bottensidan av ett 24 mm filter. Så mycket som 30 explants kan lätt växa i dessa preparat, vilket ger tillräckligt axonal material för vanliga biokemiska metoder. F) Immunoblots av lysat coll sad från filter toppar kontra bottnar visar att histoner H3, en nukleär markör, är begränsad till filter toppar. Den totala proteinhalten normaliserades i de olika proven. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 2. Studien av axonal degenerering inducerad av trofisk faktor abstinens hos filterinsatserna. A) Schema som beskriver en typisk NGF-deprivation experiment. DRG explants växer omfattande axoner i närvaro av NGF, och urarta på NGF. B) Bilderna på olika förstoringar (5x och 20x mål) av axonal preparat från explantat hållna i NGF eller berövats NGF för 12 eller 36 timmar."Https://www.jove.com/files/ftp_upload/51795/51795fig2highres.jpg" target = "_blank"> Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 3. Studien av Wallerian axonal degeneration inducerad av axonal transection i filterinsatser. A) Schema som beskriver en typisk axotomy experiment. Axon avskärande uppnås genom att skrapa den övre sidan av filtret, vilket lämnar avskurna axoner (som saknar cellkroppar) på bottensidan. B) Representativa bilder av axonala beredningar från intakta explantat eller efter 3 eller 7,5 h efter transektion i närvaro eller frånvaro av 5 mM av NAD +. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Viktiga parametrar för att ta hänsyn till vid anpassning av denna teknik inkluderar den neuronala populationen som kommer att studeras, substratet, porstorleken hos filtret och ytarea. Alla dessa parametrar påverkar specificiteten, kvalitet och kvantitet av neurit preparatet erhållits, och måste övervägas noga av slutanvändaren. I de exempel som återges i detta protokoll, användning av DRG nervceller har fördelen att utvidga bara axoner, vilket ger en ren (specifik) axonal förberedelser.
Axonal tillväxt av embryonala DRG är mycket snabb jämfört med neuroner från det centrala nervsystemet, vilket gör axonal prover som skall beredas efter bara 2 dagar i odling. Porstorleken för en xm har visat sig tillräckligt liten för att förhindra cellkroppar från att migrera in i bottenytan, samtidigt som en effektiv passage av växande axoner. Jämfört med mindre storlekar (dvs. 0,4 mikrometer) den inte ålägger selektivitet för tunna axoner.För studiet av DRG explants, den 24 mm filterinsatsen (för användning i 6-brunnar plattor) producerar tillräckliga mängder av axonal proteinprov för de flesta tekniker, inklusive immunfällning, vilket ofta kräver en stor mängd protein ingång. Emellertid mindre storlekar (dvs. filterinsatser för 12-brunnsplattor) är lämpliga för vissa tillämpningar, speciellt om användning av dissocierade celler och / eller immunocytokemi.
Även filterinsatsen isolerar effektivt neuriter från cellkroppar för undersökning, är det viktigt att notera att båda avdelningarna har samma odlingsmedia, begränsar de experimentella manipulationer till hel-cellbehandlingar. Andra isoleringsstrategier, inbegripet compartmentalized Campenot kammare eller mikroflödeskammare, tillåta särbehandling av de olika facken. Försöksledaren måste bestämma vilken av dessa cellfacksisoleringstekniker som är mest lämplig för sina egna specifika experimentella designen.
Naturligtvis kan isoleringsförmåga filterinsatser vara fördelaktigt än axonal degeneration. Till exempel kan biokemi regeneretillväxtkoner vara lättstuderas genom skrapning bottensidan av filter med vuxna DRG-explantat. Inom några timmar kommer axotomiserade DRG nervceller regenerera tillväxt kottar i undersidan av filtren att, som beskrivs i detta protokoll, kan sedan isoleras för rening av regeneretillväxtkotte proteiner. Dessutom kan de axonala prover erhållna genom denna metod analyseras genom andra än western blotting biokemiska metoder. Till exempel kan axoner lyseras i RIPA eller CHAPS lysis buffertar för att erhålla ett prov protein som kan vara ytterligare kastades immunfällning eller neddragsvideokällor experiment 9. Alternativt kan axonala prover behandlas för RNA-extraktion, såsom beskrivits tidigare 5.
Fördelen med odlingssystemet som presenteras är inte begränsad till sensoriska neuroner. Till exempel kommer kortikala neuroner sträcker dendriter och axoner som bildar synapser på bottensidan av filtret 7. Således kan rena neurite prover (berikad med synapser) vara isolated från cellkroppar för detaljerade biokemiska analyser av processer som sker uteslutande i synapser. Användningen av denna teknik är enkel och har inga utestående kritiska steg. Emellertid är axonal längd och morfologi ganska känslig för kvaliteten på beläggningen av filtren. Därför måste man vara försiktig att använda färska och homogena beläggning lösningar för de angivna mängder tid att erhålla robusta och konsekventa axonal prover. Den utbredda användningen av denna teknik kommer att bidra till att öka vår kunskap om fysiologi av axoner, under normala förhållanden och i sjukdom.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| CD-1 mouse, E13 timed pregnancy | Charles River | In house timed pregnancies can be done by mating mice and checking for vaginal plugs (Day E0) | |
| Falcon cell culture inserts | Corning | 353102 | 1 µm pore size, fits 6-well receiving plate |
| Falcon cell culture companion plates | Corning | 353502 | Receiving plates for inserts |
| Poly-D-lysine | Sigma-Aldrich | P6407 | Used at 1 mg/ml in water. Can re-use once. |
| Laminin | Sigma-Aldrich | L2020 | Used at 10 µg/ml in water. Take 100x stock from -80 °C and thaw O/N at 4 °C |
| PureCol bovine collagen solution | Advanced Biomatrix | 5005-B | |
| Leibovitz's L-15 Medium | Invitrogen | 11415-064 | Can be replaced by DMEM |
| Neurobasal medium | Invitrogen | 21103-049 | |
| B-27 serum-free supplement | Invitrogen | 17504-044 | |
| 5-Fluoro-2′-deoxyuridine (FDU) | Sigma-Aldrich | F0503 | |
| NGF (2.5S, beta subunit) | Cedarlane | CLMCNET-001 | |
| Anti-NGF antibody | Prepared in-house | As described in: Acheson, A. et al. Detection of brain-derived neurotrophic factor-like activity in fibroblasts and Schwann cells: inhibition by antibodies to NGF. Neuron. 7, 265-75, (1991). | |
| Alomone Labs | AN-240 | Commercial option | |
| Anti-tubulin antibody | Millipore | MAB5564 | |
| Alexa Fluor 488 goat anti-mouse antibody | Invitrogen | A-11029 | |
| DRG culture medium | |||
| Neurobasal Medium 2% B27 Neurobasal Supplement 2 mM l-Glutamine 1% Penicillin-streptomysin 10 µM FDU 15 ng/ml NGF (bottom compartment only) |
|||
| 1x Laemmli sample buffer | |||
| 2% SDS 50 mM DTT 60 mM Tris (pH 6.8) 5% Glycerol 0.01% (w/v) Bromophenol blue |
|||
References
- Conde, C., Caceres, A. Microtubule assembly, organization and dynamics in axons and dendrites. Nat. Rev. Neurosci. 10, 319-332 (2009).
- Rasband, M. N. The axon initial segment and the maintenance of neuronal polarity. Nat. Rev. Neurosci. 11, 552-562 (2010).
- Lingor, P., Koch, J. C., Tonges, L., Bahr, M. Axonal degeneration as a therapeutic target in the CNS. Cell Tissue Res. 349, 289-311 (2012).
- Torre, E. R., Steward, O. Demonstration of local protein synthesis within dendrites using a new cell culture system that permits the isolation of living axons and dendrites from their cell bodies. J. Neurosci. 12, 762-772 (1992).
- Zheng, J. Q., et al. A functional role for intra-axonal protein synthesis during axonal regeneration from adult sensory neurons. J. Neurosci. 21, 9291-9303 (2001).
- Willis, D., et al. Differential transport and local translation of cytoskeletal, injury-response, and neurodegeneration protein mRNAs in axons. J. Neurosci. 25, 778-791 (2005).
- Poon, M. M., Choi, S. H., Jamieson, C. A., Geschwind, D. H., Martin, K. C. Identification of process-localized mRNAs from cultured rodent hippocampal neurons. J. Neurosci. 26, 13390-13399 (2006).
- Schoenmann, Z., et al. Axonal degeneration is regulated by the apoptotic machinery or a NAD+-sensitive pathway in insects and mammals. J. Neurosci. 30, 6375-6386 (2010).
- Unsain, N., Higgins, J. M., Parker, K. N., Johnstone, A. D., Barker, P. A. XIAP regulates caspase activity in degenerating axons. Cell Rep. 4, 751-763 (2013).
- Ure, D. R., Campenot, R. B. Retrograde transport and steady-state distribution of 125I-nerve growth factor in rat sympathetic neurons in compartmented cultures. J. Neurosci. 17, 1282-1290 (1997).
- Taylor, A. M., et al. Axonal mRNA in uninjured and regenerating cortical mammalian axons. J. Neurosci. 29, 4697-4707 (2009).
- Minis, A., et al. Subcellular transcriptomics-Dissection of the mRNA composition in the axonal compartment of sensory neurons. Dev. Neurobiol. , (2013).
- Niekerk, E. A., et al. Sumoylation in axons triggers retrograde transport of the RNA-binding protein La. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 104, 12913-12918 (2007).
- Huang, E. J., Reichardt, L. F. Neurotrophins: roles in neuronal development and function. Annu. Rev. Neurosci. 24, 677-736 (2001).
- Vargas, M. E., Barres, B. A. Why is Wallerian degeneration in the CNS so slow. Annu. Rev. Neurosci. 30, 153-179 (2007).
- Waller, A. Experiments on the Section of the Glossopharyngeal and Hypoglossal Nerves of the Frog, and Observations of the Alterations Produced Thereby in the Structure of Their Primitive Fibres. Philosophical Transactions of the Royal Society of London. 140, 423-429 Forthcoming.
- Albuquerque, C., Joseph, D. J., Choudhury, P., MacDermott, A. B. Dissection, Plating, and Maintenance of Dorsal Root Ganglion Neurons for Monoculture and for Coculture with Dorsal Horn Neurons. Cold Spring Harbor Protocols. , (2009).
- Leach, M. K., et al. The culture of primary motor and sensory neurons in defined media on electrospun poly-L-lactide nanofiber scaffolds. J Vis Exp. (48), (2011).
- Sasaki, Y., Araki, T., Milbrandt, J. Stimulation of nicotinamide adenine dinucleotide biosynthetic pathways delays axonal degeneration after axotomy. J. Neurosci. 26, 8484-8491 (2006).
