Introduction
De axonale compartiment van neuronen toont een grote mate van functionele onafhankelijkheid van de somato-dendritische compartiment. In projectie neuronen, axonen bevatten meeste neuronale proteïne 1,2. Het onderzoek van de fysiologie en pathofysiologie van axonen heeft impuls in de neurowetenschappen gekregen omdat recente studies hebben aangetoond dat vroege axonale disfunctie lijkt een gemeenschappelijk kenmerk van neurodegeneratieve ziekten en neuropsychiatrische stoornissen 3 zijn. Het lijkt waarschijnlijk dat een beter begrip van axonale-exclusieve mechanismen onder normale en pathologische omstandigheden licht zal werpen op de vroege gebeurtenissen die dysfunctie rijden.
Het huidige protocol beschrijft hoe cultuur inserts te gebruiken, voorzien van een poreus membraan (filter) om grote hoeveelheden zuivere axonale materiaal dat geschikt is voor biochemische en immunocytochemische analyses te verkrijgen. Het gebruik van de filter voegt studeren axonale biologie werd voor het eerst uitgevoerd door Steward encollega's 4 en verder ontwikkeld door Twiss en collega's 5 tot zijn huidige configuratie. De techniek is nu in het huidige gebruik door groepen te bestuderen verschillende aspecten van axonen en dendrieten biologie, met lichte wijzigingen in elk geval geschikt voor de bevolking van neuronen bestudeerd, de behandelingen uitgevoerd en de aard van biochemische analyses gebruikt 6-9. Het huidige protocol is niet van plan om alle alternatieven voor een dergelijke verscheidenheid aan toepassingen tegemoet te komen, maar eerder een eenvoudige aanpak die geschikt is voor de meeste toepassingen. Met name de hier beschreven protocol gebruikt een drievoudige coating die axonale opbrengst biochemische analyses maximaliseert en het meest geschikt is axonale degeneratie andere coatings die in de literatuur beschreven onderzoeken geproduceerd minder axonen die ingetrokken en degenereren sneller wanneer beroofd van trofische factoren 9.
In deze procedure blijven neuronale cellichamen geïsoleerd bovenop de filter while axonen passeren de poriën en groeien langs de onderkant. Zuiver axonen (vrij van glia en neuronale cellichaam verontreinigingen) die groeien op het onderoppervlak van het filter kan worden verzameld voor biochemische analyse of kunnen in situ worden vastgesteld en immunocytochemische technieken 9 onderzocht. De procedure is gebaseerd op het gebruik van embryonale sensorische neuronen in de dorsale wortel ganglia (DRG). Embryonale DRG worden veel gebruikt om axonale biologie studeren omdat neurieten uit deze cellen ondergaan snelle en robuuste groei in vitro als gehandhaafd zenuwgroeifactor (NGF), en omdat zij snel degeneratie ondergaan wanneer beroofd van deze factor. Ook DRG neuronen missen dendrieten, zodat de door deze methode verzameld neurieten zuiver axonen.
Inserts filter vertegenwoordigen een groot voordeel in vergelijking met andere benaderingen gebruikt om axonen bestuderen. Studies die gebruikmaken van microscopie onderscheiden processen in de cel soma dan in eenXON bieden beperkte biochemische informatie. Als een ander voorbeeld, verzuilde cultuur systemen (bijvoorbeeld, Campenot kamers 10 of microfluïdische apparaten 11) zijn nuttig voor de beeldvorming benaderingen en voor de verschillende behandeling van celcompartimenten maar bieden slechts kleine hoeveelheden axonale materiaal, zich verzet tegen het gebruik van deze technieken voor biochemische analyses die vereisen dat relatief grote hoeveelheden monster. Verder, het gebruik ervan vereist aanzienlijke opleiding en gespecialiseerde apparatuur, en ze zijn tijdrovend. Een andere benadering vaak gebruikt om axonen isoleren van explantaten is om een explantatie centrum (met neuronale cellichamen) handmatig verwijderen voordat axonale monstername. Hoewel grote hoeveelheden van axon verrijkte preparaten kunnen produceren, kunnen axonen in dit preparaat worden gehuld in glia en snel organen 20 explantaat's verwijderd uit de reeks van 6 putjes (als een voorbeeld van een minimale experiment) is tijdrovend en op de grens van uitvoerbaarheid.
In tegenstelling, de hier gepresenteerde methode geeft veel en zuiver axonale preparaten die vervolgens kunnen worden geanalyseerd door vrijwel elke biochemische techniek die algemeen wordt gebruikt om volledige-cellysaten te analyseren, zoals western blot, immunoprecipitatie 6, Northern blot 5 massaspectrometrie 6, RNA zuivering 7,12,13, onder anderen. Bovendien kan het protocol worden toegepast (IF) immunofluorescentie technieken, aangezien het mogelijk is om axons groeien in de onderzijde van het filter om deze verder te onderzoeken IF lossen. Deze benadering vergemakkelijkt aanzienlijk de analyse van axonale specifieke werkwijzen omdat er geen cellichamen in het uiteindelijke preparaat. Dit is een belangrijk voordeel omdat een hoge immunofluorescente signaal van cellichamen ondermijnt vaak onderzoek en analyse van een zwakker signaal afkomstig dunne structuren zoals axonen.
Twee toepassingen van de kweekmethode tot axonaledegeneratie ar studerene beschreven; een model van ontwikkelings snoeien en een model van letsel-geïnduceerde degeneratie (meestal aangeduid als Wallerian degeneratie). Het modelleren van ontwikkelings snoeien is gebaseerd op het feit dat sensorische neuronen in vivo concurreren beperking hoeveelheden doelsoorten afgeleide NGF en die niet genoeg neurotrofe steun gedegenereerde 14 ontvangen. Dit verschijnsel kan in embryonale DRG culturen worden nagebootst door intrekking NGF uit het kweekmedium, die, zoals in vivo, initieert axonale degeneratie gevolgd door cellichaam vernietiging. Om Wallerian degeneratie modelleren, wordt de bovenkant van het filter met de cellichamen weggeschraapt. De axonen dat op de bodem van het filter worden fysiek gescheiden van de cellichamen en daarna ondergaan een snelle en stereotiep degeneratieve proces dat bekend staat als Wallerian degeneratie 15, vernoemd naar A. Waller die het eerst melding gemaakt van het fenomeen in 1850 16 was gegroeid.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
OPMERKING: De volgende procedures zijn in overeenstemming met de richtlijnen door de Canadese Raad van Animal Care goedgekeurd. Alle inspanningen worden gedaan om de pijn en het leed van de dieren tijdens de procedures zoveel mogelijk te beperken.
1. Coating van Filters
OPMERKING: Bij cultuur filterelementen in putjes multi-well platen zijn geplaatst, worden twee compartimenten gedefinieerd: het bovenste compartiment is het gebied boven het inzetstuk en het onderste compartiment is een onder het inzetstuk Figuur 1A.ab. Explantaten worden gezaaid in het bovenste compartiment waar zij hechten aan de bovenzijde van het filter; vele axons groeien door het filter en strekken zich aan de onderzijde van het filter, in het onderste compartiment Figuur 1A.c. De standaard werkt volumes (dwz voor het aanbrengen van coating oplossing, wast, cultuur media, enz.) zijn 2 ml voor het onderste compartiment en 1 ml voor het bovenste vak en gaan in het protocol te worden aangeduid als "; Standaard volumes ". Oplossingen beginnen met het onderste compartiment door de punt van de pipet in de ruimte tussen het inzetstuk en de zijkant van de well. Ook kantelen het inzetstuk opzij terwijl afgeven van de oplossing om luchtbellen te voorkomen dat gevangen op de bodem van het filter.
- Start het bekleden van de filters op de dag voor plating. Onder de steriele weefselkweek kap, plaats 24 mm filter inserts in een 6-wells plaat ontvangen. Incubeer inzetstukken met poly-D-lysine in water (1 mg / ml) gedurende 1 uur bij kamertemperatuur met standaardvolumes: 2 ml in het onderste compartiment en 1 ml bovenin.
- Aspireren poly-D-lysine en een keer spoelen met water. Aspireren water, sluit het deksel en laat platen te drogen in de kap O / N. Tijdens aspiratie van vloeistoffen, zorg ervoor om een overblijfsel van vloeistof die direct onder de filter wordt gevangen verwijderen.
- De volgende ochtend, verdunnen laminin in water (10 ug / ml), meng en warm bij 37 ° C. Incubeer wisselplaten met laminine 1 uur in cell incubator bij 37 ° C, met standaardvolumes.
- Zuig laminine en voeg collageen in water (0,1 mg / ml) en incubeer gedurende 1 uur bij kamertemperatuur. In dit geval gebruik maken van 2 ml voor het onderste compartiment en 2 ml voor het bovenste compartiment.
- Aspireren collageen en een keer wassen met steriel water. De filters zijn nu klaar om de cultuur media en DRG explantaten ontvangen, zoals beschreven in stap 3.
2. Dissecting embryonale ruggenmergganglion (DRG) Explantaten
- Verdoven van een 13-daagse zwangere vrouwelijke muis door een IP injectie van Avertin (250 mg / kg). Wacht 10-15 minuten en controleer op het gebrek aan hoornvlies en pedaal terugtrekking reflexen. Zodra reflexen afwezig zijn, voeren cervicale dislocatie.
- Desinfecteer alle chirurgische instrumenten en vrouwelijke buik met 70% ethanol. Laat instrumenten drogen. Houd de huid van de buik en dwars door de huid en spieren lagen om de buikholte bloot.
- Verwijder de baarmoeder door losmaken van de baarmoederhals en eierstokken. In een sterile kap, verwijder de embryo's uit de baarmoeder met een schaar en verzamelen ze in een petrischaal gevuld met ijskoude L15 media. Blijf op ijs.
OPMERKING: Raadpleeg de vorige technische rapporten voor meer informatie over hoe om embryo's van 13 dagen van de dracht 17,18 te verkrijgen. - Onder de microscoop, lag het embryo op een kant en gebruik maken van kleine voorjaar schaar om het hoofd te verwijderen. Maak een insnijding langs de zijkanten van de borst, buik, ledematen en staart weggooien. Houd de rug met de wervelkolom, lag ventrale zijde naar boven en verwijder alle viscerale organen.
- Met kleine lente schaar, bloot het gehele ruggenmerg door het snijden van de wervelkolom vanaf de buikzijde over de middellijn. Houd het karkas neer met een pincet (# 3) en gebruik een tweede paar aan het ruggenmerg te houden door zijn meest rostrale aspect.
- Langzaam en voorzichtig aan het snoer uit de buurt van het wervellichaam holte en knijpen DRG's van het ruggenmerg met behulp van ultra-dunne pincet (# 5). Groep de DRG's worden verzameldde bodem van de schaal.
- Verzamelen gegroepeerd DRGs door opzuigen met een 200 ul pipet tip die is gesneden om te vergroten haar opening. Plaats de DRG's in een buis en laat op ijs tot de DRG collectie is afgewerkt.
OPMERKING: Wit / transparant tips hebben de voorkeur omdat DRG's zich niet aan de wanden van deze tip (in vergelijking met standaard geel tips). Vlissingen tips met media voor gebruik verder voorkomt DRG's te plakken aan de muren.
3. Zaaien en onderhoud van ganglion Explantaten op Filters
- Toevoegen volledige DRG media bij 37 ° C de met coating met standaardvolumes. Supplement het onderste compartiment media met 15 ng / ml NGF, terwijl NGF-vrij houden van het bovenste compartiment.
OPMERKING: Hoewel NGF efficiënt verspreidt over het filter en de concentratie in evenwicht binnen enkele uren, hebben we geconstateerd dat het toepassen van NGF naar het onderste compartiment direct voor het zaaien verhoogt axonale rendement op de bottom oppervlak van het filter. - Breng de DRG's van de buis naar de filters met behulp van een 1000 ui pipet met een tip bijgesneden om te vergroten haar opening.
- Trekken media in de punt 2-3x voor het verzamelen van de DRG. Dit voorkomt dat ze vasthouden aan de binnenzijde van de punt. Dezelfde tip kan worden hergebruikt voor alle putjes. Het gebruik van ongekleurd tips (versus standaard blauw tips) vermindert DRG kleven aan het uiteinde oppervlak.
- Om DRG's overdragen, stelt de pipet 800 pi. Zuig ongeveer 200 ul van media vanaf de bovenzijde van het filter, ga dan naar de DRG-bevattende buis en pipet een klein volume omhoog en omlaag - naar DRG's die gezonken naar de bodem opnieuw in suspensie. Zuig het gehele volume pipet DRG onderdompelen van het punt in het midden van het inzetstuk.
- Zodra alle inserts zijn geladen, sluit de plaat deksel en schud de plaat 10x, zachtjes tikken op de motorkap bankje tussen elke wervel. Deze bewegingen verhogen axonale opbrengst door te helpen DRG explants wastafel enhechten aan het filter. Dit helpt ook gelijkmatig verdelen explantaten zodat axonen van verschillende explantaten niet overlappen.
OPMERKING: De in de vorige stappen beschreven explant zaaien procedure verhoogt het totale percentage van de explant bevestiging aan de ondergrond (tot 75%). Het belangrijkst, het pipetteren gemakkelijk voorkomt explantaten drijven op het medium oppervlak in plaats van naar de bodem zinken van het inzetstuk. - Voor biochemische analyses, zaad DRGs van een embryo (ongeveer 30) per filter. Voor morfologische analyse, gebruikt u de helft of een derde van de DRG's uit een embryo (10-15). Deze beslissing moet worden genomen voor het verzamelen van de DRG's in buizen, zodat alle DRG's van een buis worden gezaaid in een goed (of het nu 30, 15 of 10 DRG).
- Handhaaf kweken in een cel incubator bij 37 ° C, veranderende informatie om de 2-3 dagen. Om media te veranderen, zuig het bovenste compartiment eerste, gevolgd door de onderste compartiment. Voeg verse media in standaard volumes beginnen met het onderste compartiment.
OPMERKING: Om te voorkomen dat cellen / axonen van drogen, niet de media op hetzelfde moment te veranderen in meer dan 3 inserts. DRG's gekweekt op filters in aanwezigheid van NGF zal lange axons uitstrekken, die tot 2 mm na 2 dagen in kweek.
4. Trofische Factor ontwenningskuur
NGF terugtrekking induceert axonaledegeneratie met axonale fragmentatie (bepaald door fase-contrast-en β-III-tubuline IF), dat voor het eerst verschijnt rond 12 uur na intrekking. Volledige fragmentatie wordt bereikt door 36 uur. Hoe lang de degeneratie wordt overgelaten aan rijd worden gekozen door de eindgebruiker volgens proefopzet.
- Na de 2 dagen axonale verlenging fase verandert media onder en van boven compartimenten media die NGF mist en bevat anti-NGF antilichamen (1 pg / ml) om alle overblijvende (of endogeen) NGF sekwestreren.
- Terug platen celincubator (37 ° C) omNGF-geïnduceerde degeneratie terugtrekking men gedurende de gewenste tijd.
- Ga verder met eiwitextractie (stap 6) voor onderzoek door western blot of rechtstreeks onderzoekt de filters door IF (stap 7).
5. Axonale doorsnijding te induceren Wallerian Degeneratie
Deze procedure laat de axonen aan de onderzijde van het filter los van het cellichaam, maar anders intact. Daarna deze axons snel initiëren Wallerian degeneratie. Axonale fragmentatie (bewezen door fase-contrast-of β-III-tubuline IF) voor het eerst verschijnt op 3 uur na het doorsnijden; van 9 uur, axonen zijn volledig gefragmenteerd en worden losgekoppeld van het filter. Hoe lang de degeneratie wordt overgelaten aan rijd worden gekozen door de eindgebruiker volgens proefopzet.
- Schraap de bovenzijde van het filter, die gekweekt DRG explantaten met een cel schraper. Zorgen voor volledige verwijdering van top materiaal door het bewegen schraper in X-, Y-en cirkelvormigerichtingen.
- Gooi het materiaal uit de top compartiment met de drijvende explantaten die zijn geschraapt van het filter en vervang 1 ml voorverwarmde compleet DRG media met NGF (10 ng / ml).
- Terug plaat incubator (37 ° C) cel om Wallerian degeneratie doorgaan gedurende de tijd door de eindgebruiker gekozen.
- Ga verder met eiwitextractie (stap 6) voor onderzoek door western blot of rechtstreeks onderzoekt de filters door IF (stap 7).
6. Eiwitextractie van Axonal Monsters
- Vul verzamelbuizen (1,5 ml) met 75 pl Laemmli monsterbuffer. Houd buizen op ijs terwijl het oogsten axonen van de gehele set van filters.
- Was het filter met DRG explantaten in PBS en schraap de bovenzijde van het filter. Verwijder het inzetstuk van de plaat, het reinigen van de bovenzijde van het filter met een katoen-tip applicator en zuig eventuele extra PBS uit de boven-en onderkant.
- Plaats insert onderstebovenneer op de bank en snijd de filter uit de insert met een scherp scalpel. Houd het filter met een pincet, bottom up. Wordt gesneden uit de omtrek naar het midden van het filter met een schaar.
- Plaats filter op de top van de collectie buis, en met een pincet, op het midden van het filter door de buis. Terwijl je dit doet, moet een trechter vormen. Druk de trechtervormige filter om de bodem van de buis zodanig dat het wordt bedekt Laemmli monsterbuffer.
- Volledige eiwitextractie door koken de buizen gedurende 4 minuten. Verwijder het filter met een tang te plaatsen ondersteboven in de bovenkant van de buis en het uitvoeren van een kort centrifugeren (2000 g gedurende 15 sec). Gooi de gedroogde filters.
- Los 10 ul van de axonale eiwitpreparaat in een SDS-PAGE gevolgd door Western blot met de eiwitten van belang te detecteren.
Opmerking: Als referentie, een axonale bereiding van 20 explantaten gekweekt gedurende 2 dagen en gelyseerd in 100 ui RIPA lysis buffer een eiwitconcentratie van 4-6 hebbenug / ul.
7. Immunofluorescentie Onderzoek van axonen op Filters
De volgende stappen zijn algemene manipulaties uitvoeren IF vlekken op filterelementen, geïllustreerd door de detectie van β-III tubuline. Fixatief dient incubatietijden, concentraties en andere gegevens worden geoptimaliseerd voor andere antigeen-antilichaam paren.
- Gebruik maken van eerder gebruikte 6-well platen, grondig gereinigd, voor de volgende wast en incubatie van de inserts.
- Kort wassen inserts in PBS. Fix ze in vers bereide 4% paraformaldehyde in PBS gedurende 10 minuten bij kamertemperatuur op shaker.
- Na fixatie schrapen en reinig de bovenzijde van het inzetstuk aan de axons die uitsluitend gegroeid op het onderoppervlak van het filter verzamelen. Door met de standaard incubaties voor IF.
- Incubeer inserts in blokkerende oplossing (TBS, 0,05% Tween 20, 5% magere melk), met standaardvolumes, gedurende 1 uur bij kamertemperatuur onder zacht schudden.
- Overdracht inzetstukken primair antilichaam verdund in blokkerende buffer (anti-β-III-tubuline, 1:5000), met standaardvolumes. Incubeer O / N (= 18 uur) bij 4 ° C onder zacht schudden.
- Was het eerste antilichaam tweemaal in PBS (2 x 10 min bij kamertemperatuur).
- Overdracht inzetstukken fluorescent geconjugeerde secundaire antilichamen verdund in blokkerende buffer (geit anti-muis, 1:2000), met standaardvolumes. Incubeer afgedekt tegen licht gedurende 2 uur bij kamertemperatuur onder zacht schudden.
- Was het secundaire antilichaam 3x in PBS (3 x 10 min bij kamertemperatuur).
- Na IF is voltooid, nemen plaatst out, pour weg PBS uit de laatste wassen en reinigen van de bovenzijde van het filter met een katoen-tip applicator. Zuig vloeistof van boven-en onderkant.
- Plaats plaatst ondersteboven op de bank, en snijd de filter uit de insert met een scherp scalpel.
- Houd het filter met een pincet, nadeel op, en leg op microscopie glijbaan. Overlay met een dekglaasje en TL-compatibele mounting media. Laten drogen flat in koude kamer, bedekt tegen licht. Onderzoeken en vastleggen van beelden met behulp van een fluorescentiemicroscoop.
OPMERKING: Indien opgeslagen bij 4 ° C en beschermd tegen licht, kunnen deze preparaten weken met minimaal verlies van fluorescentie bewaard. - OPTIONEEL: Als alternatief, als kan worden uitgevoerd op de filters die zijn verwijderd uit de insert. Daarvoor schrapen en reinigen van de bovenzijde van de filters direct na fixatie.
- Neem filters uit de inzetstukken met een scherp scalpel en plaats filters axonen-up op de bodem van een zes-well plaat.
- Daarna incubaties voeren voor IF zoals aangegeven in 7,4-7,8 en 7.11. Het voordeel van dit alternatief is dat het bespaart reagentia, aangezien, bijvoorbeeld, kan incubatie volumes dalen tot 500 pi (vergelijking met 3 ml gebruikt wanneer filters direct gekleurd op de inzetstukken zie 7,1-7,11).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Ruggenmergganglion explantaten van E13.5 muizen groeien uitgebreid over filters gecoat sequentieel met poly-D-lysine, laminine en collageen (Figuur 1B, links), die tot 2 mm binnen 2 dagen in cultuur. Dit substraat combinatie levert vooral uitbundige groei; andere combinaties opleveren axonen die aanzienlijk korter zijn (Figuur 1B, rechts). Bovendien DRG gehandhaafd op filters verder gaat en meer dan DRG axons gekweekt op plastic figuur 1C.
Filters met poriën van 1 micrometer diameter, die in dit protocol, cellichamen houden aan de bovenzijde van het filter, terwijl neurieten groeien door de poriën en strekken zich aan het bodemoppervlak. Dit blijkt door epifluorescentie microscopie filters gekleurd voor kernen (DAPI) en β-III tubuline figuur 1D. In intacte filters is het mogelijk om celkernen observeren, zowel neuronen en niet-neuronale cellen, geconcentreerd in het midden explantaat en sommige bestralen van. Wanneer de bovenzijde van het filter geschraapt, kernen weg en slechts axons kunnen worden gedetecteerd op de filters onderzijde.
Figuur 1E toont een voorbeeld van een filter bodem die oorspronkelijk aanhoudende groei van ongeveer 17 explantaten. In dit voorbeeld werd de bovenzijde schoongemaakt voor fixatie en bijgevolg de immunofluorescente representeert pure axonen aan de onderzijde van het filter. Eiwitextractie van axonale preparaten (onderzijde van het filter) zijn verstoken van nucleaire eiwitten figuur 1F, waaruit blijkt dat het preparaat vrij van cellichamen. Ook bij het werken met RNA-extractie is het mogelijk om de zuiverheid van de axonale preparaat door vergelijking van de aanwezigheid van differentieel gelokaliseerd mRNA (dwz γ-actine) tussen hele cellysaten en axonale preparaten bevestigen (zoals getoond door anderen 5
Ontwikkelingsstoornissen snoeien van sensorische neuronen kunnen worden gemodelleerd in filters onderworpen aan trofische factor ontbering. Na 2-3 dagen van axon verlenging in aanwezigheid van NGF wordt het medium aangepast tot een gebrek NGF en met anti-NGF antilichaam dat alle resterende NGF Figuur 2A zal sekwestreren. Op de gewenste tijdstippen worden filters verwerkt voor biochemie of immunocytochemie.
Figuur 2B toont typische voorbeelden van onderzijden van filters gekleurd voor β-III tubuline voor en na ontbering. Na 12 uur van ontbering is er weinig axonale fragmentatie, hoewel sommige axonen beginnen om kralen te tonen. Echter, uitgebreide axonale degeneratie bereikt na 36 van ontbering.
Wallerian degeneratie geïnduceerd door axon doorsnijding van sensorische neuronen gemakkelijk gemodelleerd explantaten gekweekt op filters door schrapen de bovenzijde van het filter, met achterlating van de distale portion van axons die groeiden op de onderkant van het filter Figuur 3A. Figuur 3B toont typische voorbeelden van onderzijden van filters gekleurd voor β-III tubuline voor en na in-filter axotomy. Op 3 uur na axotomie, is er weinig fragmentatie, hoewel sommige axonen beginnen beading tonen. Met 7,5 uur worden de meeste axonen gefragmenteerd of helemaal verdwenen. Voorbehandeling van explantaten met nicotinamide adenine dinucleotide (NAD +, 5 mM, 30 min. voorbehandeling) beschermt tegen Wallerian degeneratie induceerde filters, zoals in andere in vitro en in vivo modellen 19.
Figuur 1. Inserts Filter produceren grote hoeveelheden pure axonale preparaten. A) Een schema van een inzetstuk (a), van een inzetstuk in een goed (b) eneindvorm met DRG-explantaten (c). B) De opeenvolgende bekleding van filters met poly-D-lysine, laminine en collageen resulteert in explantaten die steeds meer axons worden vergeleken met die gekweekt met poly-D-lysine alleen of poly-D -lysine en collageen. De beelden werden geproduceerd door het betegelen van overlappende, lage vergroting foto's met behulp van beeldbewerkingssoftware. C) Onder dezelfde ondergrond bekledingsomstandigheden, DRG explantaten gehandhaafd op filters tonen aanzienlijk uitbundiger axonale groei dan explantaten gekweekt op plastic. D) De axonale voorbereiding verkregen door schrapen de bovenzijde van het filter zonder celkernen. E) Voorbeeld van axonen die ontstaan uit ongeveer 17 explantaten gekweekt en aan de onderzijde van een 24 mm filter. Zoveel als 30 explantaten kan gemakkelijk groeien in deze preparaten, waarbij voldoende materiaal axonale gemeenschappelijke biochemische benaderingen. F) Immunoblots van lysaten coll ected van filterbovendelen versus bottoms aantonen dat histon H3, een nucleaire marker, wordt beperkt tot de filter toppen. Het totale eiwitgehalte werd genormaliseerd over de verschillende monsters. Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.
Figuur 2. De studie van axonale degeneratie geïnduceerd door trofische factor terugtrekking in filterelementen. A) Schema waarin een typisch NGF-ontbering experiment. DRG explantaten worden uitgebreid axonen in aanwezigheid van NGF en degenereren bij NGF ontbering. B) Representatieve beelden met verschillende vergrotingen (5X en 20X doelstellingen) van axonale preparaten van explantaten gehandhaafd NGF of NGF onthouden voor 12 of 36 uur."Https://www.jove.com/files/ftp_upload/51795/51795fig2highres.jpg" target = "_blank"> Klik hier voor een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.
Figuur 3. De studie van Wallerian axonaledegeneratie opgewekt door axonale doorsnijding in filterelementen. A) Schema waarin een typisch axotomy experiment. Axon versnijden wordt bereikt door schrapen de bovenzijde van het filter, waardoor afgesneden axonen (zonder cellichamen) aan de onderzijde. B) Representatieve beelden van axonale preparaten uit intacte explantaten of na 3 of 7,5 uur na doorsnijding in aanwezigheid of afwezigheid van 5 mM van NAD +. Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Belangrijke parameters rekening te houden bij de aanpassing van deze techniek zijn de neuronale populatie die wordt onderzocht, het substraat poriegrootte van het filter oppervlak. Al deze parameters zullen invloed hebben op de specificiteit, kwaliteit en kwantiteit van de neuriet voorbereiding verkregen, en moet zorgvuldig worden overwogen door de eindgebruiker. In de voorbeelden in dit protocol, het gebruik van DRG neuronen heeft het voordeel uitstrekkende slechts axons, waardoor een zuivere (specifieke) axonale voorbereiding.
Axonale groei van embryonale DRG zeer snel in vergelijking met neuronen van het centrale zenuwstelsel, waardoor axonale monsters bereid na 2 dagen in kweek. De poriegrootte van 1 urn heeft bewezen voldoende klein om te voorkomen cellichamen migreren naar het bodemoppervlak terwijl efficiënte doorgang van groeiende axonen. In vergelijking met kleinere maten beschikbaar (dwz 0,4 micrometer) geen selectiviteit opleggen voor dunne axonen.Voor de studie van DRG explantaten, de 24 mm filterelement (voor gebruik in 6-wells platen) produceert voldoende hoeveelheden axonale eiwitmonster meeste technieken zoals immunoprecipitatie, die vaak vereist een grote hoeveelheid eiwit ingang. Echter, kleinere afmetingen (dwz filterelementen voor 12-well platen) zijn geschikt voor sommige toepassingen, vooral bij gebruik van gedissocieerde cellen en / of immunocytochemie.
Hoewel het filterelement efficiënt isoleert neurites uit cellichamen voor het onderzoek, is het belangrijk op te merken dat beide compartimenten delen dezelfde cultuur media, het beperken van de experimentele manipulaties om whole-cell behandelingen. Andere isolatie benaderingen, met inbegrip gecompartimenteerd Campenot kamers of microfluïdische kamers, zorgen voor een gedifferentieerde behandeling van de verschillende compartimenten. De experimentator moet bepalen welke van deze cel-compartiment isolatietechnieken het meest geschikt is voor hun eigen specifieke experimentele opzet.
Natuurlijk kan de isolatie mogelijkheden van filterelementen voordelige voorbij axonale degeneratie zijn. Bijvoorbeeld kan de biochemie regenereren groeikegels gemakkelijkbestudeerd door het afschrapen van de onderkant van filters met volwassen DRG explantaten. Binnen enkele uren wordt axotomized DRG neuronen groeikegels regenereren in de onderzijde van de filters, zoals beschreven in dit protocol, kan vervolgens worden geïsoleerd voor het zuiveren van regenererende groeikegel eiwitten. Bovendien kan de axonale monsters die volgens deze methode worden geanalyseerd door western blotting dan biochemische methoden. Zo kunnen axonen in RIPA of CHAPS lysis buffers worden gelyseerd een eiwitmonster dat verder kan worden onderworpen aan immunoprecipitatie of pulldown experimenten 9 verkrijgen. Alternatief kan axonale monsters worden verwerkt voor RNA-extractie zoals eerder beschreven 5.
Het voordeel van het kweeksysteem weergegeven is niet beperkt tot sensorische neuronen. Zo zal corticale neuronen dendrieten en axonen die synapsen zal vormen aan de onderzijde van het filter 7 te verlengen. Zo kan pure neuriet monsters (verrijkt met synapsen) worden isolated uit cellichamen voor gedetailleerde biochemische analyses van processen die uitsluitend plaatsvinden in synapsen. Het gebruik van deze techniek is eenvoudig en staan geen kritische stappen. Echter, axonale lengte morfologie is zeer gevoelig voor de kwaliteit van de bekleding van de filters. Daarom moet ervoor worden gezorgd dat fris en homogene coating oplossingen gebruiken voor de aangegeven hoeveelheden tijd om robuuste en consistente axonale monsters. Het wijdverbreide gebruik van deze techniek zal helpen vooraf onze kennis van de fysiologie van axonen, onder normale omstandigheden en bij de ziekte.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| CD-1 mouse, E13 timed pregnancy | Charles River | In house timed pregnancies can be done by mating mice and checking for vaginal plugs (Day E0) | |
| Falcon cell culture inserts | Corning | 353102 | 1 µm pore size, fits 6-well receiving plate |
| Falcon cell culture companion plates | Corning | 353502 | Receiving plates for inserts |
| Poly-D-lysine | Sigma-Aldrich | P6407 | Used at 1 mg/ml in water. Can re-use once. |
| Laminin | Sigma-Aldrich | L2020 | Used at 10 µg/ml in water. Take 100x stock from -80 °C and thaw O/N at 4 °C |
| PureCol bovine collagen solution | Advanced Biomatrix | 5005-B | |
| Leibovitz's L-15 Medium | Invitrogen | 11415-064 | Can be replaced by DMEM |
| Neurobasal medium | Invitrogen | 21103-049 | |
| B-27 serum-free supplement | Invitrogen | 17504-044 | |
| 5-Fluoro-2′-deoxyuridine (FDU) | Sigma-Aldrich | F0503 | |
| NGF (2.5S, beta subunit) | Cedarlane | CLMCNET-001 | |
| Anti-NGF antibody | Prepared in-house | As described in: Acheson, A. et al. Detection of brain-derived neurotrophic factor-like activity in fibroblasts and Schwann cells: inhibition by antibodies to NGF. Neuron. 7, 265-75, (1991). | |
| Alomone Labs | AN-240 | Commercial option | |
| Anti-tubulin antibody | Millipore | MAB5564 | |
| Alexa Fluor 488 goat anti-mouse antibody | Invitrogen | A-11029 | |
| DRG culture medium | |||
| Neurobasal Medium 2% B27 Neurobasal Supplement 2 mM l-Glutamine 1% Penicillin-streptomysin 10 µM FDU 15 ng/ml NGF (bottom compartment only) |
|||
| 1x Laemmli sample buffer | |||
| 2% SDS 50 mM DTT 60 mM Tris (pH 6.8) 5% Glycerol 0.01% (w/v) Bromophenol blue |
|||
References
- Conde, C., Caceres, A. Microtubule assembly, organization and dynamics in axons and dendrites. Nat. Rev. Neurosci. 10, 319-332 (2009).
- Rasband, M. N. The axon initial segment and the maintenance of neuronal polarity. Nat. Rev. Neurosci. 11, 552-562 (2010).
- Lingor, P., Koch, J. C., Tonges, L., Bahr, M. Axonal degeneration as a therapeutic target in the CNS. Cell Tissue Res. 349, 289-311 (2012).
- Torre, E. R., Steward, O. Demonstration of local protein synthesis within dendrites using a new cell culture system that permits the isolation of living axons and dendrites from their cell bodies. J. Neurosci. 12, 762-772 (1992).
- Zheng, J. Q., et al. A functional role for intra-axonal protein synthesis during axonal regeneration from adult sensory neurons. J. Neurosci. 21, 9291-9303 (2001).
- Willis, D., et al. Differential transport and local translation of cytoskeletal, injury-response, and neurodegeneration protein mRNAs in axons. J. Neurosci. 25, 778-791 (2005).
- Poon, M. M., Choi, S. H., Jamieson, C. A., Geschwind, D. H., Martin, K. C. Identification of process-localized mRNAs from cultured rodent hippocampal neurons. J. Neurosci. 26, 13390-13399 (2006).
- Schoenmann, Z., et al. Axonal degeneration is regulated by the apoptotic machinery or a NAD+-sensitive pathway in insects and mammals. J. Neurosci. 30, 6375-6386 (2010).
- Unsain, N., Higgins, J. M., Parker, K. N., Johnstone, A. D., Barker, P. A. XIAP regulates caspase activity in degenerating axons. Cell Rep. 4, 751-763 (2013).
- Ure, D. R., Campenot, R. B. Retrograde transport and steady-state distribution of 125I-nerve growth factor in rat sympathetic neurons in compartmented cultures. J. Neurosci. 17, 1282-1290 (1997).
- Taylor, A. M., et al. Axonal mRNA in uninjured and regenerating cortical mammalian axons. J. Neurosci. 29, 4697-4707 (2009).
- Minis, A., et al. Subcellular transcriptomics-Dissection of the mRNA composition in the axonal compartment of sensory neurons. Dev. Neurobiol. , (2013).
- Niekerk, E. A., et al. Sumoylation in axons triggers retrograde transport of the RNA-binding protein La. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 104, 12913-12918 (2007).
- Huang, E. J., Reichardt, L. F. Neurotrophins: roles in neuronal development and function. Annu. Rev. Neurosci. 24, 677-736 (2001).
- Vargas, M. E., Barres, B. A. Why is Wallerian degeneration in the CNS so slow. Annu. Rev. Neurosci. 30, 153-179 (2007).
- Waller, A. Experiments on the Section of the Glossopharyngeal and Hypoglossal Nerves of the Frog, and Observations of the Alterations Produced Thereby in the Structure of Their Primitive Fibres. Philosophical Transactions of the Royal Society of London. 140, 423-429 Forthcoming.
- Albuquerque, C., Joseph, D. J., Choudhury, P., MacDermott, A. B. Dissection, Plating, and Maintenance of Dorsal Root Ganglion Neurons for Monoculture and for Coculture with Dorsal Horn Neurons. Cold Spring Harbor Protocols. , (2009).
- Leach, M. K., et al. The culture of primary motor and sensory neurons in defined media on electrospun poly-L-lactide nanofiber scaffolds. J Vis Exp. (48), (2011).
- Sasaki, Y., Araki, T., Milbrandt, J. Stimulation of nicotinamide adenine dinucleotide biosynthetic pathways delays axonal degeneration after axotomy. J. Neurosci. 26, 8484-8491 (2006).
