Abstract
En rad olika metoder är för närvarande tillgängliga för bestämning av dissociationskonstanten mellan ett protein och samverkande små molekyler. Men de flesta av dessa kräver tillgång till specialutrustning, och ofta kräver en viss kompetens för att effektivt fastställa tillförlitliga experiment och analysera data. Differentialavsökande fluorimetri (DSF) används alltmer som en robust metod för inledande screening av proteiner för att interagera små molekyler, antingen för att identifiera fysiologiska partners eller träff upptäckt. Denna teknik har fördelen att det kräver bara en PCR maskin avsedd för kvantitativ PCR, och så lämpligt instrument finns i de flesta institutioner; ett utmärkt utbud av protokoll finns redan; och det finns starka prejudikat i litteraturen för flera användningsområden för metoden. Tidigare arbete har föreslagit flera sätt att beräkna dissociationskonstanter från DSF uppgifter, men dessa är matematiskt krävande. Här vi DEMonstrate en metod för att uppskatta dissociationskonstanter från en måttlig mängd DSF experimentella data. Dessa data kan oftast samlas in och analyseras på en enda dag. Vi visar hur olika modeller kan användas för att passa data insamlade från enkla bindningshändelser, och där samverkande bindning eller oberoende bindningsställen är närvarande. Slutligen presenterar vi ett exempel på dataanalys i ett fall där standardmodeller inte gäller. Dessa metoder illustreras med uppgifter som samlats in på kommersiellt tillgängliga styrproteiner och två proteiner från vårt forskningsprogram. Sammantaget ger vår metod ett enkelt sätt för forskare att snabbt få ökad insikt i protein-ligand interaktioner med hjälp av DSF.
Introduction
Alla proteiner binder, med varierande tillhörighet, till ett varierat utbud av andra molekyler från enkla joner till andra stora makromolekyler. I många fall proteiner binder till små molekyler parter som en del av deras normala funktion (t.ex., ett kinas som binder till ATP). Andra interaktioner kan vara relaterade till funktion, men är experimentellt användbara som verktyg (t.ex. små molekyler som stabiliserar proteiner för att förbättra kristallisa framgång, eller bidra till att upprätthålla proteiner i lösning); medan små molekyler som binder till aktiva platser och allosteriska områden av proteiner kan fungera som inhibitorer, och så modulera aktiviteten av enzymer.
Det finns ett brett spektrum av tekniker som kan användas för att bestämma affiniteten av proteiner för partnermolekyler. Isotermisk titrering kalorimetri 1 är allmänt ses som en "guldstandard", eftersom det ger rik information om reaktioner, är etiketten gratis, och har begränsade möjligheter till enrtifacts av experimentet. Trots den senaste tidens förbättringar av känsligheten i instrumentering och automatisering av försöksuppställningen, är det fortfarande relativt dyrt i form av proteinbehov, har i bästa fall en låg till medelhög genomströmning, och passar bäst till interaktioner med måttlig till hög affinitet (10 nM till 100 ^ M Kd) 2. Andra label free metoder såsom ytplasmonresonans eller tvåskikts interferometri 3 erbjuder högre genom, och har uppnått känsligheten för att upptäcka mindre molekyler så låga som 100 Da. Men hög genomströmning instrument för dessa metoder är relativt dyra, är motiverade endast om det kommer att bli en ständig genomströmning av relevanta projekt, och så kommer sannolikt att vara otillgängliga för många akademiska laboratorier.
Differentialavsökande fluorimetri (DSF eller thermofluor) beskrevs första gången 2001 4 som en metod för läkemedelsutveckling. I denna metod, är proteiner inkuberas med ett fluorescerande färgämne (initialt naftalen-sulfonsyra färgämnen användes), som förändrar sin fluorescens vid bindning till de hydrofoba regionerna av proteinerna. Den protein-dye provet upphettas sedan, och fluorescensen övervakas som värmen stiger. Den utspelas av proteinet, och exponering av hydrofoba delar av proteinet, ger upphov till ett karakteristiskt mönster av fluorescensen som funktion av temperaturen (Figur 1A). Experimentet kan utföras i små volymer i någon kommersiell kvantitativ PCR instrument, och det på ett enda experiment, kan ett stort antal prover samtidigt testas (vanligen 48, 96 eller 384 prover, beroende på modell av mätinstrumentet). Experiment kan oftast utföras i runt en timme, vilket ger möjlighet till hög genomströmning analys av proverna 5.
Ytterligare förbättringar av metodiken har sett att anta färgämnen med bättre spektrala egenskaper 6,7 8,9. Utbudet av tillämpningar av metoden har utökats, med särskilt fokus på att etablera optimala villkor för beredning och lagring av proteiner 10, samt på att identifiera potentiella bindningspartners för att underlätta kristallisation 11. Den relativt hög genomströmning av metoden, en relativt låg kostnad i protein (~ 2 ug per reaktion), och tillämpningen att studera svaga bindningsmolekyler har gjort DSF ett värdefullt verktyg för fragment baserad läkemedelsdesign, speciellt i akademiska sammanhang 12-14.
Trots den breda tillämpningen av DSF att studera protein-ligand interaktioner, har få studier beskrivs bestämning av dissociationskonstanter från dessa studier. Men dessa har tenderat att producera detaljerade ekvationer som beskriver den pågående av proteinet, med många parametrar som måste monteras på glesa uppgifter eller i vissa fall estimated 7,15-17. Dessa metoder är särskilt relevanta i krävande fall, som tätt bindande föreningar eller proteiner som uppvisar ovanliga övergångar. Men för många laboratorier, dessa detaljerade analyser är för tungrott för rutinmässig användning. Vi föreslår därför alternativa behandlingar för olika scenarier, och visa hur dessa kan användas för att passa data från olika protein-ligand interaktioner. Vår metod använder StepOne qPCR instrumentet, där skräddarsydda dataanalys programvara är tillgänglig; medan detta snabbar upp dataanalysen, kan resultat från andra instrument bearbetas med tidigare publicerade metoder 9, och samma nedströms analys kan göras.
Protocol
1 Fastställande av ett ungefärligt värde för dissociationskonstanten (dvs inom en storleksordning)
- Förbered blandningen anges i tabell 1.
- Förbered lager av liganden av intresse på den högsta tillgängliga koncentration, och sedan vid sex tio faldiga utspädningar av denna. Om en ungefärlig Kd är känd från tidigare uppgifter, siktar på att ha minst två koncentrationer över och under Kd.
- Alikvotera 18 ul av blandningen i åtta brunnar i en qPCR tallrik. Lägg 2 | il av lösningsmedel till den första brunnen. Tillsätt 2 l av varje medlem av liganden utspädningsserie (steg 1.2) till en väl var och en av de återstående sju brunnarna.
- Placera en qPCR tätning över plattan. För att uppnå en bra tätning av plattan, lägg en hand applikator (se tabeller för specifika reagenser) i mitten av plattan. Jämna ner tätningen åt sidan och upprepa sedan på den andra halvan avplattan.
- Centrifugera plattan vid 500 xg under två minuter för att avlägsna luftbubblor.
- Placera plattan i en StepOne qPCR instrument. Välj "Melt kurvan" alternativet, de ROX filter, och välja den snabba ramphastighet (detta ger en 2 min paus vid 25 ° C, följt av en ramp till 99 ° C under 40 minuter, och sedan en 2 min paus). Kör en termisk denaturering.
OBS: Script-filer för att utföra en körning finns tillgängliga online på http: // www.exeter.ac.uk/biosciences/capsular. - Vid slutet av instrument körningen, klicka på "Analyze" knappen på skärmen. Spara resultatfilen.
- Öppna Protein Thermal Shift mjukvara.
- Skapa en ny studie; på fliken egenskaper, ger detta ett namn, och på fliken Villkor, detalj ligander.
- Flytta till fliken Experiment filer och importera sparade resultat filen (XXX.eds), och ange innehållet i varje brunn (mall files finns tillgängliga från författarna).
- Flytta till fliken Analysis, och tryck på "Analyze".
OBS: Detta kommer att analysera resultaten. Det är möjligt att exportera resultaten för vidare utredning med Excel med hjälp av fliken Export. Resultaten exporteras i en flik avgränsad format. Det är bäst att öppna den exporterade filen i Excel, och omedelbart spara i Excel-format.
- Kontrollera att proteinet i närvaro av enbart lösningsmedlet ger ett resultat liknande det som visas i figur 1A. Därefter undersöka smälttemperaturer som observerats i resultaten i "replikera" rutan. Se till att detta visar en tydlig ökning av smälttemperaturen med ökande ligand-koncentration.
OBSERVERA: Helst detta kommer att ge en tydlig maximal smälttemperatur (förutsatt att proteinet helt ligand bunden), och en ungefärlig Kd där smälttemperaturen är halvvägs mellan ligand-fritt protein ochmaximalt.
2 Experimentell Set-up för att bestämma dissociationskonstanten
- Förbered blandningen anges i tabell 2 som en huvudblandning.
- Förbered lager av liganden vid femton olika koncentrationer, som kommer att spädas tio gånger i den slutliga experimentet. Helst inkluderar koncentrationer minst två tiopotenser över och under den beräknade Kd, och centrera koncentrationerna över det beräknade Kd. Fokus på sju av de punkter inom en storleksordning av den beräknade Kd, med ytterligare fyra punkter på var sida om detta; Om det finns ett val, inkludera fler punkter på värden som mättar.
OBS: Om det behövs, är det möjligt att ändra de experimentella betingelser så att liganden lagren är på dubbla den experimentella koncentration, där ligand löslighet är begränsande. - Lägg 120 pl av masterBlanda till åtta brunnarna i en U-bottnad 96-brunnsplatta, för att fungera som en reservoar för bekväm dosering av mastermixen. Använd en 8 kanals pipett att dosera 18 pl i en kolumn i en PCR-platta. Upprepa ytterligare fem kolumner, för att ge totalt 48 fyllda brunnar i en 6 x 8 mönster på plattan.
- Lägg 20 | il av liganden lager, eller lösningsmedlet, för att separera brunnar i en U-bottnad 96-brunnsplatta. Med hjälp av en 8 kanals pipett aspirera 2 pl av åtta olika ligand lager (eller vätska). Lägg dessa till en kolumn av PCR-plattan som var fylld med Master Mix i steg 2.3. Upprepa med samma åtta ligand / lösningsmedel lager för ytterligare två kolumner. Aspirera 2 l av de återstående åtta ligand eller lösningsmedel bestånd, och lägga dessa till en fjärde kolumnen i plattan. Upprepa ytterligare två kolumner. Detta kommer att ge triplikatprover för alla 16-ligand och lösningsmedels prover.
- Placera en qPCR tätning över plattan (se steg 1.4).
- Centrifugera plattan vid 500 x g undertvå min.
- Placera plattan i qPCR instrumentet. Kör en termisk denaturering med hjälp av de parametrar som anges i steg 1.6.
- Vid slutet av instrument körningen, klicka på "Analyze" knappen på skärmen. Spara resultatfilen.
- Öppna Protein Thermal Shift mjukvara. Skapa en ny studie; på fliken egenskaper, ger detta ett namn, och på fliken Villkor, detalj ligander.
- Flytta till fliken Experiment filer och importera sparade resultat filen (XXX.eds), och ange innehållet i varje brunn.
OBS: mallfiler finns tillgängliga online på http: // www.exeter.ac.uk/biosciences/capsular. - Flytta till fliken Analysis, och tryck på "Analyze".
- Välj "Replikat" fliken i menyn på vänster sida av skärmen för att visa resultatet som tre exemplar. Bedöma tillförlitligheten av de uppgifter som baseras på hur tätt de tre exemplar är. Should triplicatesna dålig reproducerbarhet granska rådata noga.
- Analysera data med användning av både den Boltzmann eller Derivat metoder att utvärdera smälttemperatur. Välj "Identiska resultat" fliken, och i "Replikera resultaten plot", växla "Tomt med" knappen mellan "Tm - Boltzmann" och "Tm - Derivat". Välj den metod som ger större reproducerbarhet för provet. Exportera resultaten för vidare utredning med Excel med hjälp av fliken Export.
OBS: För prover som visar flera övergångar, är det nästan alltid bäst att använda Derivative metoden i smältläge multipel. Resultaten exporteras i en flik avgränsad format. Det är bäst att öppna den exporterade filen i Excel, och omedelbart spara i Excel-format. - Upprepa experimentet åtminstone två gånger, inklusive en upprepning på en separat dag, för att säkerställa reproducerbarhet av resultaten. Om dataanalys (se steg 3 nedan)indikerar att värdet av Kd är betydligt annorlunda än den ursprungliga uppskattningen, ändra ligandkoncentrationer därefter (se steg 2.2) för att säkerställa ett bra utbud av värden runt Kd.
3 Dataanalys Avgöra Dissociationskonstanten enligt termisk denaturering
- Skapa en tabell i Excel av ligandkoncentrationer och smälttemperaturen.
- Öppna GraphPad Prism mjukvara, och skapa ett XY-bord. Ange data, med hjälp av X-kolumnen för ligandkoncentrationer och Y kolumnen för smältning temperaturresultat.
OBS: ett exempel som visas är Figur 1B. Ett skript med ekvationer förinstallerade, och alternativa instruktioner för användning av SPSS statistikpaket, finns tillgängliga online på http: // www.exeter.ac.uk/biosciences/capsular. - På fliken Analysis väljer du alternativet för att ändra analysparameters (Ctrl + T). För att skriva in rätt modell, välj "Ny" och "Skapa ny ekvation". Sätt i ekvationen beskrivs i tabell 3 som "Single site ligandbindning".
OBS: Ett exempel på dessa steg visas i figur 1C. När du använder skriptet med ekvationer förinstallerade, kan den aktuella ekvationen riktas väljas från listan i stället för in. Derivering av denna ekvation är anordnad i ett tillägg. - Välj "Regler för Inledande värden" rutan, och ange regler för initialvärden enligt tabell 3.
- Begränsa parametern P, som "Constant lika med" och ange den slutliga koncentrationen av protein (i samma enheter som ligand ges i).
- Välj OK för att utföra analysen.
OBS: Ett exempel på dessa steg visas i figur 1D. Det grafiska programmet ger en siffra som visar data och passar till modellen. Exempel på tessa analyser visas i de representativa data.
4. Montering Data till Kooperativa modeller
För att passa data till en kooperativ modell, välja mellan antingen en enkel kooperativa modellen, eller en modell där två separata dissociationskonstanter definieras. Det första tillvägagångssättet är att föredra i fallet med negativ kooperativitet, eller som en initial undersökning. Men det är i princip bättre i fall av positiv kooperativitet till modell två olika dissociationskonstanter 18. I detta fall kan modellering fortsätta förutsatt antingen sekventiell bindning av ligander, eller oberoende bindning av ligander.
- Följ samma inledande steg som i protokoll 3 Men vid steg 3.3, sätt en av ekvationerna i tabell 3 anges som "Simple kooperativa modellen", "sekventiell bindning av två ligander" eller "oberoende bindning av två ligander" 18.
- Markera relevanta regler för initialvärdenassocierad med var och en av dessa ekvationer i tabell 3.
- Undersök passning av modellen till data. Om uppgifterna passar dåligt, överväga en annan modell.
OBS: det är också viktigt att noga undersöka montering av smälttemperaturen till uppgifter från det protein Thermal Shift mjukvara (steg 2.9): ibland är det nödvändigt att ändra parametrarna för att få bästa resultat. En annan faktor är om utbudet av datapunkter är perfekt, och om det finns några onormala punkter: antingen en begränsad uppsättning data på vardera sidan av Kd, eller en enda avvikande punkt (speciellt vid de högsta ligandkoncentrationer), kan väsentligt påverka resultaten. - Upprepa experimentet minst två gånger (se steg 2,12) för att säkerställa reproducerbarhet.
5. Montering Data till Curves Visar binära Skiften Smälttemperatur
Ibland, i stället för ett graderat svar på liganden, proteinerna varitobserverade att anta ett binärt svar, där bundna provet klart åtskild från obundet prov. Ett exempel finns i de representativa resultat (Figur 4). I detta fall, montering av smälttemperaturerna inte kommer att ge en bra passform för Kd.
- Exportera rådata som matas ut från Protein Termisk Shift programvara. För varje temperaturpunkt, beräkna medelvärdet fluorescens för noll liganden och högsta ligandkoncentrationer. Tabellform resultaten från varje datapunkt bredvid dessa.
OBS: Det fel som skapas här är mindre än felet i de inpassade smälttemperaturer. - Öppna SPSS statistikpaketet. Kopiera temperaturerna, de två medeldatamängder och data för varje försök till ett fönster data i SPSS. På fliken variabeln ställer medelvärdet dataset utan ligand som "låg", och medelvärdet dataset för högsta ligandkoncentrationen som "hög".
- Ladda syntaxen filen tillgängligonline på på http: // www.exeter.ac.uk/biosciences/capsular . Välj "Kör → Kör alla".
- Kopiera andelen bundna resultat till en ny Excel-arbetsbok, med relevanta ligandkoncentrationer.
- Öppna Graphpad mjukvaran och skapa ett XY-bord. Ange data, med hjälp av X-kolumnen för ligandkoncentrationer och Y kolumnen för smältning temperaturresultat. På fliken analysen, välj "Ändra analysparametrar". För att skriva in rätt modell, välj "Ny" och "Skapa ny ekvation". Skriv in ekvationen i tabell 3, listad som "Analys av binära förändringar i smälttemperatur".
- Välj "Regler för initialvärden" rutan, och ange regler för initialvärden som anges i tabell 3. Tvinga parametern P, som "Constant lika med" och ange den slutliga koncentrationen av protein (i samma enheter som ligand ges i).
OBS: exempel på att fylla dessa lådor för protokollet i avsnitt 3 visas i figur 1C, D. - Om det finns en bra passform, kan resultaten förbättras genom att extrapolera till det förväntade resultatet på oändligt ligandkoncentration. Från modell av andelen bundet vid varje ligandkoncentration, undersöka värdet för det högsta värdet av ligandkoncentration. Om detta är 0,99 eller högre, är det osannolikt att förbättra resultaten ytterligare analys.
- Om proportionen är mindre än 0,99, är ett ytterligare steg krävs för att korrigera för effekterna av det obundna proteinet i det högsta provliganden koncentration. I steg 5.2, skriver andelen ligand bunden vid den högsta ligandkoncentrationen punkten (från steg 5,7) i cell R2 (en annan cell kan användas, och R2 ersättas på lämpligt sätt i ekvationen i tabell 3). Skapa en extra kolumn efter medelvärdet av de högsta resultaten ligandkoncentration. I granarnaT-cell, kopiera ekvationen listas i Tabell 3 som "Extrapolering till oändlig ligandkoncentration". Kopiera denna formel till de återstående cellerna i denna kolumn.
OBS: Denna beräkning tar bort effekten av obundet protein i den högsta ligandkoncentrationen. Skillnaden mellan liganden fritt protein och den högsta ligandkoncentration multipliceras med det reciproka värdet av den andel bundet vid den högsta ligandkoncentration för att ge den förväntade skillnaden mellan fullständigt bundna och obundna proteintillstånd vid varje temperaturpunkt. Denna skillnad läggs till eller subtraheras från det obundna tillståndet för att ge den förväntade fluorescens för fullt ligand bunden protein. - Ersätt kolonnen för maximal ligand-koncentrationen i SPSS databladet med denna nya kolonn och upprepa datapassning.
OBS: steg 5,7-5,9 kan behöva upprepas om modellen föreslår ytterligare en betydande förändring av andelen bundet vid de maximala ligand concentrati(om så är fallet, skulle det förmodligen vara perfekt att upprepa experimentet med en högre punkt ligandkoncentration ingår). - I de fall då proteinet visar en binär skift och displayer kooperativt beteende, föreslog ekvationen i steg 5,5 skulle vara substituerad med de från steg 4,1. Den "Top" och "Bottom" parametrar bör ersättas med 1 respektive 0.
- Upprepa experimentet minst två gånger (se steg 2,12) för att säkerställa reproducerbarhet.
Representative Results
En utmärkt testsubstrat för denna metod är hexokinas. Detta har fördelarna av att vara lätt kommersiellt tillgänglig och som har två substrat som finns i de flesta laboratorier, och som ger klara och reproducerbara resultat i analysen. En initial koncentration skärm (protokoll 1), med hjälp av hexokinas och glukos (figur 2A), tyder på att den sann Kd kommer att vara i intervallet 0,2-1,7 mM. Därför var en större skärm (protokoll 2) utförs med hjälp av koncentrationer som visas i tabell 4 Resultaten (Figur 2B) visar en bra passform till den enda platsen ligandbindande ekvation (protokoll avsnitt 3.3) [9], och gav ett K d av 1,2 ± 0,1 mM.
Den förmodade heptos-guanyl transferas WcbM 19,20 visar en stark termisk skift på bindning till GTP (Figur 3A). En första skärmen föreslog att Kd skulle vara i området av omkring 100 pM. Därför var en full skärm som sätts upp, med hjälp av de koncentrationer som visas i tabell 5 Montering av resultaten till ekvation 3.3 visade en rimlig passning (R 2 av 0,981; Figur 3B). .Men Finns det en uppenbar skillnad mellan data och modell, vilket tyder på att en annan ekvation behövs. Sökning av Protein Databank 21 med WcbM sekvensen visade att de närmaste homologer för vilka strukturer har bestämts bildar dimerer. Data analyserades därför med hjälp av de tre ekvationer för kooperativ, sekventiell, och oberoende bindning av två ligander (Protocol 4). Monterings statistik för en kooperativ modell gav ett värde R2 på 0,998 och standardavvikelsen för residualerna (Sy.x) av 0,215, medan både sekventiella och oberoende bindande modellerna gav ett värde R2 på 0,992 och ett Sy.x på 0.480 och 0.461 respektive. Detta antyder att modellenvilket ger den bästa passformen till data den kooperativa modellen: Här, en K ½ av 230 ± 10 nM iakttogs, med ett n-värde på 0,52 ± 0,02 (figur 3C). Detta indikerade en negativ kooperativitet till bindnings. Observera att en K ½ användes i detta fall snarare än Kd, som enheter för Kd skulle vara ganska otillfredsställande iM 0,52.
Den förmodade BNP-6-deoxi-β-D-manno -heptopyranose 2- O -acetylase, WcbI 22, visar en ganska ovanlig följd i differential scanning fluorometri. I avsaknad av ligander, det visar en tydlig och enkel denaturering (Figur 4A). Koenzym A (CoA) identifierades som en ligand av detta protein med användning av DSF, och affiniteten hos proteinet för denna partner undersöktes såsom beskrivs i protokollet. I närvaro av höga koncentrationer av CoA, en stark shift till en högre temperatur observeras, med en förändring i smälttemperatur av 15 ° C. Emellertid vid mellanliggande koncentrationer, snarare än en övergång till en monofasisk smältning vid en mellanliggande smälttemperatur, WcbI visade en bifasisk smältning, med proteinet som uppträder för att smälta vid antingen liganden fritt temperatur eller den fullständigt bundet smälttemperatur (Figur 4A) . Proportionerna av de två arter som ändrats på ett dosberoende sätt, med ökande substratkoncentrationer öka andelen som smälte vid den högre temperaturen (Figur 4B). Direkt analys av dessa uppgifter var utmanande: montering till Boltzmannekvationen gav mycket dåliga anfall, medan derivat metoder betonade att två smält händelser inträffar, men inte hjälpa till att påvisa en förändring med ökande ligandkoncentration.
En mindre vanlig metod för att analysera dessa data har därför antagit (protokoll 5). Fluorescensen derivative resultat utan ligand och på högsta ligandkoncentration togs som representerar väsentligen allt protein i den lägre smälttemperaturen, eller den högre smälttemperatur tillstånd. De återstående derivat data monterad vid varje punkt som summan av en del av var och en av dessa två stater, med den andel summeras till enhet (Figur 4C). De data som erhölls fick sedan monteras såsom tidigare för erhållande av en skenbar Kd, med användning av samma ekvationer som tidigare. Det betonas att den "höga" ligand punkten är sannolikt endast 95% ligand bunden. Uppgifterna har sedan extrapoleras till en förutsägelse av resultatet för en 100% bundet protein, och data Armatur upprepas för att ge en skenbar Kd på 58 ± 2 iM. Detta gav en utmärkt passning av de experimentella resultaten till bindnings modellen (Figur 4D).
fo: content-width = "5in" src = "/ filer / ftp_upload / 51809 / 51809fig1highres.jpg" width = "500" />
Figur 1 Exempel på experiment installation och analys. (A) Exempel på den förväntade formen av en termisk denatureprofil (tagen från uppgifter för jäst hexokinas). Den karakteristiska formen hos rådata visar en progressiv ökning i fluorescens till ett maximum, följt av ett grunt nedgång (diskuteras mer i detalj i 9). Detta åtföljs av en enda topp i den första derivatan av fluorescensen. (B) Exempel på datainmatning i Graphpad. Ligandkoncentration ges på X-axeln, och observerade smälttemperaturer på Y-axeln. (C) Exempel på ekvation definition Graphpad. (D) Exempel på korrekt sätt ställa de ursprungliga värdena för variablerna och för fastställande av proteinkoncentrationen, för att möjliggöra korrekt bestämning av dissociationskonstanten.m / filer / ftp_upload / 51809 / 51809fig1highres.jpg "target =" _blank "> Klicka här för att se en större version av denna siffra.
. Figur 2. Interaktion av hexokinas med glukos mäts genom differentiell avsökande fluorimetri (A) ett inledande experiment testar ett brett spektrum av glukoskoncentrationer antyder att Kd är sannolikt att vara i området av 0,2 -. 1,7 mM (B) En detaljerad experiment, testa 16 koncentrationer av glukos, medger bestämning av den skenbara Kd som 1.12 ± 0,05 mM. Data passar extremt bra till modellen för en enda bindande händelse (med botten (T1) och topp (T2) temperaturer montering på 35,4 ± 0,2 ° C och 49,3 ± 0,5 ° C respektive). Notera attdessa uppgifter samlades in i närvaro av 10 mM MgCl2. Dessa bilder har sammanställts med GraphPad. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 3 Samverkan mellan WcbM med GTP avslöjar en anti-kooperativ bindning. (A) ett inledande experiment att testa ett brett sortiment av GTP koncentrationer antyder att Kd kommer sannolikt att vara i området av 200 -. 500 pM (B) En detaljerad experiment testar 16 koncentrationerna av GTP, föreslår ett värde för den skenbara Kd av 120 ± 20 pM. När emellertid en logaritmisk skala används för x-axeln, finns det en betydande discrePancy mellan modell och data. (C) Analys av samma data med kooperativa modellen visar en utmärkt passform till data där en enkel kooperativa modellen används. Här var en K ½ av 230 ± 20 ^ M bestäms med kooperativitet koefficienten n = 0,52 ± 0,02 (med botten (T1) och övre (T2) temperaturer montering på 69.63 ± 0,06 ° C och 79,9 ± 0,1 ° C respektive). Som WcbM verkar vara dimer, innebär detta att enzymet är helt anticooperative i sin bindning till GTP. Dessa bilder har sammanställts med GraphPad. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 4 WcbI visar en bifasisk smältmönsteri närvaro av dess ligand koenzym A (CoA). (A) WcbI, i frånvaro av ligand (blå), visar en enkel monofasisk smältmönster. Vid höga ligandkoncentrationer (1 mM, grön linje), är ett liknande mönster observeras. Emellertid vid mellanliggande ligandkoncentrationer. (60 uM; röd linje), två distinkta smälttoppar, motsvarande ligand-fria och ligand-bunden states observeras (B) Övergången mellan de två uppsättningarna av topparna är dosberoende över hela koncentrationsintervall. (C) Modellering av bifasisk smälter som en summa av en del av ligand fria och hög ligand resultat ger en bra passform till data (streckad lila linje, jämfört med röd linje). Denna fit förbättras genom att extrapolera resultatet observeras för hög ligandkoncentration (där modellen antyder ~ 95% beläggning) till full beläggning (streckad blå linje). (D) De data som erhållits för andelen WcbI bunden till CoA sho ws en utmärkt passform för en enkel bindande modell, med ett Kd på 58 ± 2 ^ M (dessa data representerar data som samlas in på två separata dagar, med lite olika ligandkoncentrationer valts för andra dagen baserat på den första uppsättningen av resultat). Paneler. (A - C) framställdes med hjälp av Excel och panel (D) med hjälp Graphpad Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Tabell 1 Recept på initiala experiment.
| Reagens | Volym i mix (pl) |
| Protein | För slutlig koncentration av 0,11 mg / ml |
| 0,3 | |
| 0,5 M HEPES pH 7,0 | 3,7 |
| 5 M NaCl | 5,6 |
| Vatten | Till 180 ul |
Detta beskriver "master mix" av protein, detektionsreagens och buffert för en inledande scouting experiment för att ge en uppskattning av Kd, som beskrivs i protokollet avsnitt 1 Denna buffertblandning är lämplig för generiska proteiner. Där tidigare resultat föreslå andra buffertar ska användas, bör dessa användas i stället. Om proteinet lager är vid en låg koncentration (dvs. mindre än 0,3 mg / ml), kan det vara nödvändigt att reducera mängden av ytterligare buffert sattes för att kompensera för bufferten redan är närvarande i proteinprovet.
| Reagens | Volym i mix (pl) |
| Protein | För slutlig koncentration av 0,11 mg / ml |
| 5,000X SYPRO Orange | 1,78 |
| 0,5 M HEPES pH 7,0 | 22,2 |
| 5 M NaCl | 33,3 |
| Vatten | Till 180 ul |
Detta beskriver "master mix" av protein, upptäckt reagens, bUffer för en fullständig bestämning av Kd för ett proteinprov, Denna buffertblandning är lämplig för generiska proteiner som beskrivs i protokoll avsnitt 2. Där tidigare resultat föreslå andra buffertar ska användas, bör dessa användas i stället. Om proteinet lager är vid en låg koncentration (dvs. mindre än 0,3 mg / ml), kan det vara nödvändigt att reducera mängden av ytterligare buffert sattes för att kompensera för bufferten redan är närvarande i proteinprovet.
Tabell 3. Ekvationer och parametrar för dataanalys.
| Steg i försöksprotokoll | Ekvation krävs | Parametrar som krävs | Beskrivning av variabler och parametrar |
| 3,3 | </ Td> | ||
| Single site ligandbindning | Y = Botten + ((Top-Bottom) * (1 - ((PK d -X + sqrt (((P + X + Kd) ^ 2) - (4 * P * X))) / (2 * P )))) | P: proteinkoncentration. Kd: dissociationskonstant. P och Kd anges i samma enheter som användes för de ligandkoncentrationer. Överst, Nederst: smälttemperaturer vid oändlig ligandkoncentration och ingen ligandkoncentration respektive. | |
| 3,4 | Botten = * Ymin | YMin: Minsta värde på Y (lägst experimentella protein Tm, i det här fallet) | |
| Top = * YMAX YMAX: Maximalt värde på Y (högsta experimentella protein Tm) | |||
| Kd = * X vid YMID | YMID: värde på Y som motsvarar medelvärdet av Ymin och YMAX. X är den motsvarande X-värde (här den relevanta ligandkoncentration) | ||
| P = (Initialt värde, för att vara fit) | |||
| 4,1 | |||
| Enkel kooperativa modellen | Y = Botten + ((Top-Bottom) * (((X / Kd) ^ n) / (1 + ((X / Kd) ^ n)))) | n: Hsjuk koefficient. Detta beskriver kooperativitet, eller andra biokemiska egenskaper, av proteinet, och inte nödvändigtvis är en uppskattning av antalet ligand-bindningsställen i proteinet. En Hill koefficient på ena representerar ingen kooperativitet; värden lägre än ett indikerar negativ kooperativitet och värden större än ett positivt kooperativitet. | |
| Botten = * Ymin | |||
| Top = * YMAX | |||
| Kd = * X vid YMID | |||
| P = (Initialt värde, vara vältränad ) | |||
| n = (Initialt värde, för att vara fit) | |||
| Sekventiell bindning av två ligander | Y = Botten + ((Top-Bottom) * ((X ^ 2) / (Kd * K2)) / (1 + (X / Kd) + ((X ^ 2) / (Kd * K2))) ) | K2: dissociationskonstant för andra bindningshändelse. | |
| Botten = * Ymin | |||
| Top = * YMAX | |||
| DTH: 123px; "> Kd = * X på YMID | |||
| K2 = * X vid YMID | |||
| P = (Initialt värde, för att vara fit) | |||
| Oberoende bindning av två ligander | Y = Botten + ((Top-Bottom) * ((X ^ 2) / (Kd * K2)) / (1 + (2 * X / Kd) + ((X ^ 2) / (Kd * K2) ))) | ||
| Botten = * Ymin | |||
| h: 123px; "> Upp = * YMAX | |||
| Kd = * X vid YMID | |||
| K2 = * X vid YMID | |||
| P = (Initialt värde, för att vara fit) | |||
| 5,5 | |||
| Analys av binära skift i smälttemperatur | Y = 1 - ((PK d -X + sqrt (((P + X + Kd) ^ 2) - (4 * P * X))) / (2 * P)) | 23px; ">||
| Botten = * Ymin | |||
| Top = * YMAX | |||
| Kd = * X vid YMID | |||
| P = (Initialt värde, för att vara fit) | |||
| 5,8 | |||
| Extrapolering till oändlig ligandkoncentration | (C2 - ((1 $ R $ 2) * B2)) / $ R $ 2 | B2: cell som innehåller resultatet utan ligand. C2: cell som innehåller resultatet med maximal ligand. $ R $ 2: cell som innehåller den andel bunden vid maximal ligandkoncentration. |
Steg 3, 4 och 5 så skall detaljerade ekvationer i analysprogrammet, och exakt definition av startparametrar för dataanalys. Ekvationerna för varje relevant steg visas, med rätt val av parametrarna. En förklaring av innebörden av variabler och parametrar som en referens.
Tabell 4 Koncentrationer för screening av interaktion mellan hexokinas med glukos.
| Provpunkt | Ligand (Glucose) koncentration (mM) |
| 1 | 0 |
| 2 | 0,001 |
| 3 | 0,005 |
| 4 | 0,01 |
| 5 | 0,03 |
| 6 | 0,1 |
| 7 | 0,3 |
| 8 | 0,4 |
| 9 | 0,7 |
| 10 | 1,1 |
| 11 | 2,1 |
| 12 | 3,7 |
| 13 | 5,3 |
| 14 | 7 |
| 15 | 9 |
| 16 | 11 |
Hexokinas från spirande jästen Saccharomyces cerevisiae sattes till Master Mix som beskrivs i protokollet, kompletterat med 10 mM MgCl2 som magnesium är ett känt kofaktor. Den ursprungliga uppskattning av Kd var mellan 0,5 och 2 mM. Experiment sattes upp för att ge de angivna slutkoncentrationer av glukos.
Tabell 5. Koncentrationer för screening av interaktion mellan WcbM med BNP.
| Provpunkt | Ligand (GTP) koncentration (M) |
| 1 | 0 |
| 2 | 0,5 |
| 3 | 1 |
| 4 | 5 |
| 5 | 10 |
| 6 | 25 |
| 7 | 50 |
| 8 | 100 |
| 9 | 250 |
| 10 | 8px; "> 500|
| 11 | 1000 |
| 12 | 2500 |
| 13 | 5000 |
| 14 | 7500 |
| 15 | 10.000 |
| 16 | 20.000 |
WcbM från Burkholderia pseudomallei sattes till Master Mix som beskrivs i protokollet. Den ursprungliga uppskattningen av Kd var cirka 100 M. Experiment sattes upp för att ge de angivna slutkoncentrationer av GTP, som syftar till att täcka minst två tiopotenser över och under Kd.
Discussion
Differentialavsökande fluorimetri har visat sin makt som en robust och mångsidig metod för att karaktärisera proteiner och identifiera potentiella proteinligander. De väldokumenterade framgångar snabbare proteinstabilisering, läkemedelsutveckling (särskilt i mindre väl finansierade laboratorier) och kristallise 10,23-25 har gjort det till en attraktiv metod för initial screening av föreningar. Föreningar sätts till proteiner visar en tydlig dosberoende ökning av den skenbara smälttemperatur 7,9. Däremot har det förekommit några försök att använda resultaten från dessa försök att fastställa uppenbara bindningskonstanter till stöd i ranking föreningar för deras samhörighet. Här presenterar vi en metod för systematiskt bestämma en skenbar dissociationskonstant för proteiner i närvaro av en ligand.
Resultaten som presenteras här visar att DSF snabbt och kraftfullt kan ge uppskattningar av dissociationskonstanten förett protein-ligand-kombination. De observerade data kan manipuleras med kommersiellt tillgängliga verktyg för att ge en snabb bestämning av Kd, utan behovet av att göra antaganden om det sannolika värdet av parametrar. Metoden har en signifikant fördel över vissa jämförbara metoder för att vara snål i både protein och tid som krävs. Experimentet som beskrivs här kommer att förbruka 0,13 mg protein per experiment (cirka 0,4 mg för experiment upprepas i tre exemplar). Det kan jämföras med isotermisk titrering kalorimetri (ITC), där ett enda experiment med en genomsnittlig protein 40 kDa kommer att förbruka lika mycket. Den fullständiga uppsättningen experiment som krävs för detta protokoll skulle förbruka cirka 4 timmar, inklusive förberedelse, för en enda uppsättning experiment. Återigen, detta sannolikt betydligt snabbare än metoder såsom ITC eller ytplasmonresonans, som samtidigt kraftfull kräver ofta betydande optimering för att uppnå bästa uppgifter.
Våra resultat visar att det fortfarande finns ett krav på att noggrant undersöka de rådata, för att passformen på dessa uppgifter bestämma smälttemperaturen, och passningen av data smälttemperaturen för att bestämma dissociationskonstanten. Den första utmaningen är formen av de rådata som producerats i proteinet smältning. I vissa fall kan formen inte approximera den som observerats i Figur 1A. Vanliga frågor är låga skift temperatur på ligand bindande, hög bakgrundsfluorescens och ovanliga flera övergångar i temperatur. Låg temperatur skift ses på bindning flera ligander. För denna metod, är den mest kritiska parametern felet i Tm mätningen, jämfört med temperaturförändring. Datan kan vanligtvis monteras tämligen väl när standardavvikelsen för trippelmätningar inte överskrider 10% av smälttemperaturen förskjutning mellan obunden och helt bundna proteinet. Vår erfarenhet är att när en sådan temperatur skift är endast 2 ° C, kan detta vara tillräckligt för anpassning av data, om de enskilda datapunkter är mycket exakt. En andra fråga är ovanligt formade kurvor. Dessa skiljer sig ofta mellan fritt protein och ligand bundna former, som ligand bindning påverkar uppveckling lägen av proteinet. I dessa fall måste användaren överväga om uppgifterna kan användas med lämplig hänsyn till de modeller som används för att bestämma smälttemperatur och dissociationskonstanten. Ett annat vanligt problem är att tillägg av en kofaktor till proteinet (t.ex. MgCl2 i vårt exempel med hexokinas) krävs för att få de mest tillförlitliga uppgifterna. Vår erfarenhet har varit att noggrant övervägande av alla sannolika faktorer i experimentet i skedet för att ingångsvärdena är nödvändig för att uppnå bästa resultat. Dessutom kan alternativa teoretiska behandlingar avslöjar funktioner i dessa uppgifter 15,17. Slutligen är det inte ovanligt för en del proteiner att Contain inbyggt exponerade hydrofoba regioner att visa hög bakgrundsfluorescens. Det finns ett antal lösningar på dessa problem, som har varit föremål för omfattande omdömet annorstädes 6,9.
I synnerhet måste användaren överväga att använda Boltzmann eller derivatmodeller (t.ex. figur 4), och i fråga om användning av derivat, vare flera smältor ska modelleras. De två metoder för modellering av termiska utspelas skiljer sig i att Boltzmann-metoden passar de experimentella data till Boltzmannekvationen, förutsatt en regelbunden sigmoidal form för att den pågående kurvan. Däremot tar derivatet metod den första derivatan av de experimentella data vid varje punkt (undre panelen i figur 1 A), och anser smälttemperaturen att vara punkten för högsta första derivatet. Derivatet förfarandet återgår generellt en högre smälttemperatur med ca 2-3 ° C. De flesta proteiner kommer att returnera en mer konsekventresultat (dvs, är standardfel av smälttemperaturen för trippelexperimenten lägre) för en av de två metoderna. Detta är oftast intimt relaterad till den exakta formen av proteinet utspelas kurvan, och det är nödvändigt att empiriskt bestämma den bästa metoden i varje fall. Om derivat modellen används, är det också viktigt att beakta flera smälthändelser. Vissa data visar tydligt bevis för flera övergångar, och i dessa fall resultaten kommer sannolikt att vara lättare att tolka om dessa multipla smält händelser modelleras. Inom ramen för detta protokoll är det ofta så att tillsättningen av liganden kan orsaka ett protein för att övergå från att ha flera smält övergångar till en enda övergång (t.ex. genom att stabilisera det mest termiskt sköra underdomän), eller vice versa. Vi förespråkar därför att de rådata undersöks tillsammans innan man överväger vilken strategi kommer att vara bäst att använda.
Efter modelling av de enskilda smälttemperaturer, kan ytterligare frågor uppstå montera dessa till modeller som presenteras i protokollet avsnittet. Det är absolut nödvändigt att noggrant undersöka passningen till dissociationskonstanten ekvationen med hjälp av en logaritmisk skala, eftersom denna analys framhäver ofta avvikelser mellan observerade data och modellen (.ex., Figur 3). Medan de erhållna resultaten är i allmänhet robusta, vård i tolkningen ger möjlighet att utvinna bättre resultat, och den mest mening, från datan.
En särskild fråga som dessa uppgifter är den tolkning som ska placeras på proteiner som visar kooperativitet eller flera bindnings händelser i DSF. Vi har hittills endast observerats detta fenomen i proteiner som förväntas ha flera specifika bindnings händelser (t.ex. WcbM, ett protein vars bästa homolog är en multimer 26, och som fungerar som en multimer på storleksuteslutningskromatografi [uppgifter intevisad]). Det är inte alls klart att den negativa kooperativitet observerats i DSF denaturering visar att enzymet i slutändan kommer att visa negativt kooperativitet: snarare, kan detta vara ett tecken på komplex bindning som måste utforskas mer noggrant med ett bredare utbud av metoder. Detta antyder för oss emellertid att mer omfattande studier av sådana proteiner är sannolikt att identifiera intressanta effekter.
De värden som anges för dissociationskonstanten med den här metoden är i allmänhet av samma storleksordning som de som tillhandahålls av andra metoder, såsom isoterm titrering kalorimetri och ytplasmonresonans. Men de absoluta värden är ofta högre än vad som observerats med hjälp av dessa metoder. Detta är åtminstone delvis en följd av det faktum att dissociationskonstanten observeras vid smälttemperaturen av proteinet med ligand. Denna Kd är generellt högre än vid fysiologiska temperaturer. Den dissociation konstant är relaterad till temperaturen hos reaktionen genom ekvationerna:
[1]
[2]
(Där c θ är standardreferenskoncentration, Δ r G är Gibbs fria energiförändring för reaktion, R är gaskonstanten, är Δ H entalpin förändring i reaktionen, och Δ S är entropin förändring i reaktionen .)
Reaktioner med dissociationskonstanter i det mätbara intervallet för denna metod kommer i allmänhet att ha en negativ Δ r G och så effekten av en ökning i temperatur på ekvation [1] kommer att vara att öka dissociationskonstanten. Både Δ H och Δ S termer som utgör Gibbs fria energi (ekvation [2]) är temperature beroende 27, och effekten på dissociationskonstanten beror på storleken och tecknet för dessa temperaturberoenden, och kommer nödvändigtvis interaktion beroende. Följaktligen är det inte oväntat att de dissociationskonstanter bestäms med denna metod är ibland större än vad som bestäms av metoder som är verksamma vid RT. Temperaturberoende är naturligtvis också en varning för många andra metoder, som tenderar att ge dissociationskonstanten vid temperaturer lägre än den fysiologiska temperaturen.
En annan nackdel med DSF-metoden är att den är en märkt metod, till skillnad från ITC. Den fluorescerande märkning som används (SYPRO Orange) är hydrofoba, och så i vissa fall kan konkurrera med bindningen av hydrofoba ligander till proteiner. Det är därför troligt att det i vissa fall, dissociationskonstanten erhålls att vara artificiellt höjas på grund av konkurrens med märket. Emellertid för jämförelse av olika ligander, (den primära användningen avDSF), sannolikt inte är tillräckligt betydande för att påverka rangordningen av föreningar med affinitet skillnaderna.
En potentiell nackdel med denna metod är detektionsgränsen som kan uppnås. I princip bör det inte vara möjligt att noggrant mäta ett värde för Kd som är lägre än 50% av proteinkoncentrationen, och till och med värden i detta intervall kommer sannolikt att vara av tvivelaktig noggrannhet. Medan detektionsgränsen vid denna ände av intervallet kan förlängas en aning genom att reducera koncentrationerna av protein och färgämne, kommer känsligheten hos instrumentet förhindra ytterligare minskning i proteinkoncentration. På liknande sätt kommer den övre änden av känsligheten att bestämmas av lösligheten för liganden. För att erhålla ett matematiskt robust uppskattning för Kd, är det viktigaste för att erhålla data med 90% av proteinet närvarande i liganden bunden form, som kräver ligandkoncentrationer vara ungefärligly tio gånger Kd (förutsatt att inga kooperativitet). Detektionsgränsen kommer därför nödvändigtvis vara en tiondel av lösligheten för liganden i den relevanta bufferten. Detta betyder att detektionsgränser av metoden typiskt kommer att sträcka sig mellan 1 pM och mellan 1 och 100 mM, beroende på proteinet och liganden.
Sammanfattningsvis är differentialavsökande fluorimetri en mångsidig teknik som är tillämplig på ett brett spektrum av proteiner. Med användning av metoderna som presenteras här, är det möjligt att snabbt och billigt bestämma affiniteten hos ett protein för olika ligander. Detta har stor potential för tillämpning inom proteinrening och stabilisering, kunskaper om funktionen eller specificitet för enzymer från metagenomes och inom läkemedelsforskning, särskilt i små laboratorier.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| StepOne real time PCR instrument | Life Technologies | 4376357 | DSF can be performed with many other instruments. The StepOne instrument has very convenient software for data analysis. |
| Protein thermal shift software v1.0 | Life Technologies | 4466037 | |
| MicroAmp Fast optical 48-well plates | Life Technologies | 4375816 | |
| Optical sealing tape | Life Technologies | 4375323 | Bio-rad part no. 223-9444 is an alternative supplier |
| U-bottomed 96-well plates | Fisher | 11521943 | |
| SYPRO Orange | Life Technologies | S6650 | For a smaller volume supplier, use Sigma part no. S5692 |
| SPSS statistics version 20 | IBM | Other statistics packages will provide similar functionality | |
| GraphPad Prism 6.02 | GraphPad | Other statistics packages will provide similar functionality | |
| Hand applicator (PA1) | 3M | 75-3454-4264-6 | |
| Hexokinase from Saccharomyces cerevisiae | Sigma-Aldrich | H5000 | |
| Glucose | Fisher scientific | 10141520 |
References
- Freyer, M. W., Lewis, E. A. Isothermal titration calorimetry: experimental design, data analysis, and probing macromolecule/ligand binding and kinetic interactions. Methods Cell Biol. 84, 79-113 (2008).
- Ladbury, J. E. Calorimetry as a tool for understanding biomolecular interactions and an aid to drug design. Biochem Soc Trans. 38, 888-893 (2010).
- Abdiche, Y., Malashock, D., Pinkerton, A., Pons, J. Determining kinetics and affinities of protein interactions using a parallel real-time label-free biosensor, the Octet. Anal Biochem. 377, 209-217 (2008).
- Pantoliano, M. W., et al. High-density miniaturized thermal shift assays as a general strategy for drug discovery. J Biomol Screen. 6, 429-440 (2001).
- Senisterra, G., Chau, I., Vedadi, M. Thermal denaturation assays in chemical biology. Assay Drug Dev Technol. 10, 128-136 (2012).
- Ericsson, U. B., Hallberg, B. M., Detitta, G. T., Dekker, N., Nordlund, P. Thermofluor-based high-throughput stability optimization of proteins for structural studies. Anal Biochem. 357, 289-298 (2006).
- Lo, M. C., et al. Evaluation of fluorescence-based thermal shift assays for hit identification in drug discovery. Anal Biochem. 332, 153-159 (2004).
- Nettleship, J. E., Brown, J., Groves, M. R., Geerlof, A. Methods for protein characterization by mass spectrometry, thermal shift (ThermoFluor) assay, and multiangle or static light scattering. Methods Mol Biol. 426, 299-318 (2008).
- Niesen, F. H., Berglund, H., Vedadi, M. The use of differential scanning fluorimetry to detect ligand interactions that promote protein stability. Nat Protoc. 2, 2212-2221 (2007).
- Geders, T. W., Gustafson, K., Finzel, B. C. Use of differential scanning fluorimetry to optimize the purification and crystallization of PLP-dependent enzymes. Acta Crystallogr Sect F Struct Biol Cryst Commun. 68, 596-600 (2012).
- Vedadi, M., et al. Chemical screening methods to identify ligands that promote protein stability, protein crystallization, and structure determination. Proc Natl Acad Sci USA. 103, 15835-15840 (2006).
- Davis, B. J., Erlanson, D. A. Learning from our mistakes: the 'unknown knowns' in fragment screening. Bioorg Med Chem Lett. 23, 2844-2852 (2013).
- Larsson, A., Jansson, A., Aberg, A., Nordlund, P. Efficiency of hit generation and structural characterization in fragment-based ligand discovery. Curr Opin Chem Biol. 15, 482-488 (2011).
- Scott, D. E., et al. Using a fragment-based approach to target protein-protein interactions. Chembiochem. 14, 332-342 (2013).
- Cimmperman, P., et al. A quantitative model of thermal stabilization and destabilization of proteins by ligands. Biophys. J. 95, 3222-3231 (2008).
- Matulis, D., Kranz, J. K., Salemme, F. R., Todd, M. J. Thermodynamic stability of carbonic anhydrase: measurements of binding affinity and stoichiometry using ThermoFluor. Biochemistry. 44, 5258-5266 (2005).
- Zubriene, A., et al. Measurement of nanomolar dissociation constants by titration calorimetry and thermal shift assay - radicicol binding to Hsp90 and ethoxzolamide binding to CAII. Int J Mol Sci. 10, 2662-2680 (2009).
- Weiss, J. N. The Hill equation revisited: uses and misuses. FASEB J. 11, 835-841 (1997).
- Cuccui, J., et al. Characterization of the Burkholderia pseudomallei K96243 capsular polysaccharide I coding region. Infect Immun. 80, 1209-1221 (2012).
- DeShazer, D., Waag, D. M., Fritz, D. L., Woods, D. E. Identification of a Burkholderia mallei polysaccharide gene cluster by subtractive hybridization and demonstration that the encoded capsule is an essential virulence determinant. Microb Pathog. 30, 253-269 (2001).
- Berman, H., Henrick, K., Nakamura, H. Announcing the worldwide Protein Data Bank. Nat Struct Biol. 10, 980 (2003).
- Vivoli, M., Ayres, E., Beaumont, E., Isupov, M., Harmer, N. Structural insights into WcbI, a novel polysaccharide biosynthesis enzyme. IUCr Journal. 1 (1), 28-38 (2014).
- Sorrell, F. J., Greenwood, G. K., Birchall, K., Chen, B. Development of a differential scanning fluorimetry based high throughput screening assay for the discovery of affinity binders against an anthrax protein. J Pharm Biomed Anal. 52, 802-808 (2010).
- Uniewicz, K. A., et al. Differential scanning fluorimetry measurement of protein stability changes upon binding to glycosaminoglycans: a screening test for binding specificity. Anal Chem. 82, 3796-3802 (2010).
- Wan, K. F., et al. Differential scanning fluorimetry as secondary screening platform for small molecule inhibitors of Bcl-XL. Cell Cycle. 8, 3943-3952 (2009).
- Koropatkin, N. M., Holden, H. M. Molecular structure of alpha-D-glucose-1-phosphate cytidylyltransferase from Salmonella typhi. J Biol Chem. 279, 44023-44029 (2004).
- Paleskava, A., Konevega, A. L., Rodnina, M. V. Thermodynamics of the GTP-GDP-operated conformational switch of selenocysteine-specific translation factor SelB. J Biol Chem. 287, 27906-27912 (2012).
