Abstract
En bred vifte af metoder er i øjeblikket tilgængelige til bestemmelse af dissociationskonstanten mellem et protein og interagere små molekyler. Men de fleste af disse kræver adgang til specialudstyr, og ofte kræver en vis grad af ekspertise til effektivt at etablere pålidelige eksperimenter og analysere data. Differential scanning fluorimetri (DSF) bliver i stigende grad brugt som en robust metode til indledende screening af proteiner til at interagere små molekyler, enten til at identificere fysiologiske partnere eller til hit opdagelse. Denne teknik har den fordel, at det kun kræver en PCR-maskine egnet til kvantitativ PCR, og så passende instrumentering er tilgængelig i de fleste institutioner; et fremragende udvalg af protokoller er allerede tilgængelige; og der er stærke fortilfælde i litteraturen for flere anvendelser af metoden. Tidligere arbejde har foreslået flere midler til beregning af dissociationskonstanter fra DSF data, men disse er matematisk krævende. Her vi Demonstrate en fremgangsmåde til estimering af dissociationskonstanter fra en moderat mængde af DSF eksperimentelle data. Disse data kan typisk indsamles og analyseres inden for en enkelt dag. Vi viser, hvordan forskellige modeller kan anvendes til at passe data indsamlet fra simple bindende begivenheder, og hvor kooperative bindende eller uafhængige bindende sites er til stede. Endelig præsenterer vi et eksempel på dataanalyse i en sag, hvor standardmodeller ikke gælder. Disse metoder er illustreret med data indsamlet på kommercielt tilgængelige kontrol proteiner og to proteiner fra vores forskningsprogram. Samlet set vores metode giver en enkel måde for forskerne til hurtigt at opnå yderligere indsigt i protein-ligand interaktioner ved hjælp af DSF.
Introduction
Alle proteiner binde med varierende affiniteter til en bred vifte af andre molekyler fra simple ioner til andre store makromolekyler. I mange tilfælde proteiner binder til små molekyler partnere som en del af deres normale funktion (fx en kinase binding til ATP). Andre interaktioner kan være relateret til funktion, men er eksperimentelt nyttige som værktøjer (fx små molekyler, der stabiliserer proteiner til at forbedre krystallisering succes, eller medvirke til at bevare proteiner i opløsning); mens små molekyler, der binder til aktive sites og allosteriske steder af proteiner kan virke som inhibitorer, og så modulere aktiviteten af enzymer.
Der er en bred vifte af teknikker, der kan anvendes til at bestemme affiniteten af proteiner til partner molekyler. Isotermisk titrering kalorimetri 1 er bredt betragtet som en "gold standard", da det giver rig information om bivirkninger, er et mærke gratis, og har begrænset mulighederne for enrtifacts af eksperimentet. , Trods de seneste forbedringer i følsomheden af instrumentering og automatisering af eksperimentelle set-up, er det dog stadig relativt dyrt i form af krav til protein, har i bedste fald en lav-til-medium gennemløb, og er bedst egnet til interaktioner med moderat til høje affinitet (10 nm til 100 um Kd) 2. Andre label gratis metoder såsom overfladeplasmonresonans eller dobbeltlag interferometri 3 tilbud højere gennemløb, og har opnået den følsomhed til at detektere mindre molekyler så lave som 100 Da. Men høje gennemløb instrumenter til disse metoder er forholdsvis dyre, er kun berettiget, hvor der vil være en løbende gennemløb af relevante projekter, og så vil sandsynligvis være utilgængelige for mange akademiske laboratorier.
Differentialscanningskalorimetri fluorimetri (DSF eller thermofluor) blev første gang beskrevet i 2001 4 som en metode til lægemiddelforskning. I denne method, proteiner inkuberet med et fluorescerende farvestof (oprindeligt naphthalen-sulfonsyre farvestoffer blev anvendt), som ændrer sin fluorescens efter binding til hydrofobe regioner i proteiner. Protein-farvestof prøve opvarmes derefter, og fluorescensen overvåget som varmen stiger. Udfoldelse af proteinet, og eksponering af hydrofobe dele af proteinet, giver anledning til et karakteristisk mønster i fluorescens som en funktion af temperatur (Figur 1A). Forsøget kan udføres i små mængder, i nogen form for kommerciel kvantitativ PCR instrument, og så i et enkelt forsøg, kan et stort antal prøver samtidigt testes (normalt 48, 96 eller 384 prøver, afhængigt af model af instrumentet). Eksperimenter kan normalt udføres i omkring en time, hvilket giver mulighed for high throughput analyse af prøverne 5.
Yderligere forbedringer af den metode har set vedtagelsen af farvestoffer med bedre spektrale egenskaber 6,7 8,9. Rækken af anvendelser af metoden er blevet udvidet med særlig fokus på etablering af optimale betingelser for tilberedning og opbevaring af proteiner 10, og på at identificere potentielle bindingspartnere at hjælpe krystallisering 11. Den relativt høje gennemløb af metoden, relativt lave omkostninger i protein (~ 2 ug pr reaktion), og anvendeligheden til at studere svage bindende molekyler har gjort DSF et værdifuldt værktøj til fragment lægemiddelforskning design, især i en akademisk sammenhæng 12-14.
Trods den brede anvendelse af DSF til at studere protein-ligand-interaktioner, har kun få undersøgelser beskrevet bestemmelse af dissociationskonstanter fra disse undersøgelser. Imidlertid har disse tendens til at fremlægge detaljerede ligninger, der beskriver udfoldelsen af proteinet, med mange parametre, der skal monteres på sparsomme data eller i nogle tilfælde estimated 7,15-17. Disse metoder er af særlig relevans i udfordrende tilfælde, såsom stramt bindende forbindelser eller proteiner, der udviser usædvanlige overgange. Men for mange laboratorier, disse detaljerede analyser er for besværlige til rutinemæssig brug. Vi foreslår derfor alternative behandlinger for forskellige scenarier, og dokumentere, hvordan disse kan bruges til at passe data fra forskellige protein-ligand interaktioner. Vores metode anvender StepOne qPCR instrument, som skræddersyede dataanalyse software er tilgængelig; mens dette fremskynder dataanalyse, kan resultaterne fra andre instrumenter behandles med tidligere offentliggjorte metoder 9, og det samme nedstrøms analyse kan udføres.
Protocol
1. Fastsættelse af en tilnærmet værdi for dissociationskonstanten (dvs. inden for en størrelsesorden)
- Forbered blandingen beskrevet i tabel 1.
- Forbered lagre af liganden af interesse på den højest mulige koncentration, og derefter ved seks ti folds fortyndinger af dette. Når en omtrentlig Kd er kendt fra tidligere data, har til formål at have mindst to koncentrationer over og under Kd.
- Afmål 18 ul af blandingen til otte brønde i en qPCR plade. Tilsæt 2 pi opløsningsmiddel til den første brønd. Tilsæt 2 ul af hvert medlem af ligand fortyndingsrække (trin 1.2) til et godt hver af de resterende syv brønde.
- Placer en qPCR segl over pladen. For at opnå en god forsegling af pladen at anbringe en hånd applikator (se tabel specifikke reagenser) i midten af pladen. Glat ned forseglingen til den ene side, og derefter gentage på den anden halvdel afpladen.
- Centrifugeres pladen ved 500 x g i to minutter for at fjerne luftbobler.
- Pladen anbringes i en StepOne qPCR instrument. Vælg "Melt kurve" indstilling, ROX filtre og vælge den hurtige rampe hastighed (dette giver en 2 minutters pause ved 25 ° C efterfulgt af en rampe til 99 ° C i løbet af 40 minutter, og derefter en 2 min pause). Kør en termisk denaturering.
BEMÆRK: Script-filer til at udføre en kørsel er tilgængelige online på http: // www.exeter.ac.uk/biosciences/capsular. - Ved afslutningen af instrumentet køre, skal du klikke på knappen "Analyser" på skærmen. Gem resultatet fil.
- Åbn protein termisk ændring-software.
- Opret en ny undersøgelse; under fanebladet Egenskaber, giver dette et navn, og i fanen Betingelser, detaljeret ligander.
- Flyt til fanen Eksperiment filer, og importere den gemte resultater fil (XXX.eds) og angive indholdet af hver brønd (skabelon files er tilgængelige fra forfatterne).
- Flyt til fanen Analysis, og tryk på knappen "Analyze".
BEMÆRK: Dette vil analysere resultaterne. Det er muligt at eksportere resultaterne til yderligere undersøgelse med Excel under fanen Eksporter. Resultaterne eksporteres i et faneblad afgrænset format. Det er bedst at åbne den eksporterede fil i Excel, og straks gemme i Excel-format.
- Kontroller, at proteinet i nærvær af opløsningsmiddel alene giver et resultat svarende til det vist i figur 1A. Dernæst undersøger smeltetemperaturerne observeret i resultaterne i "kopiere" rude. Sikre, at dette viser en klar stigning i smeltetemperatur med stigende ligandkoncentration.
BEMÆRK: Ideelt set vil dette give en klar maksimal smeltetemperatur (forudsat at proteinet er fuldt ligandbundne), og en omtrentlig Kd hvor smeltepunktet er halvvejs mellem ligand-fri protein ogmaksimum.
2. forsøgsopstilling til bestemmelse af dissociationskonstanten
- Forbered blandingen beskrevet i tabel 2 som en master mix.
- Forbered lagre af liganden på femten forskellige koncentrationer, som vil blive fortyndet ti gange i det sidste eksperiment. Ideelt set omfatter koncentrationer mindst to størrelsesordener over og under den estimerede Kd, og centrere koncentrationerne på den estimerede Kd. Fokus på syv af de punkter inden for en størrelsesorden af de anslåede Kd, med yderligere fire punkter på hver side af dette; hvis der er et valg, indeholde flere point på værdier, der er mætte.
BEMÆRK: Hvis det er nødvendigt, er det muligt at ændre de eksperimentelle betingelser, således at liganden bestandene på det dobbelte af den eksperimentelle koncentration, hvor ligand opløselighed er begrænsende. - Tilføj 120 ul af masterblandes til otte brønde i en U-bundede 96 brønds plade, til at fungere som et reservoir for bekvem dosering af master mix. Brug en 8-kanals pipette til at dispensere 18 pi i en kolonne i et PCR-plade. Gentag med yderligere fem søjler, for at give i alt 48 fyldte brønde i en 6 x 8 mønster på pladen.
- Tilsæt 20 pi ligand lagre, eller opløsningsmidlet, til separate brønde i en U-bundede 96 brønds plade. Ved hjælp af en 8-kanals pipette aspirat 2 pi otte forskellige ligand bestande (eller opløsningsmiddel). Tilføj disse til én kolonne af PCR-plade, der var fyldt med master-mix i trin 2.3. Gentag med de samme otte ligand / opløsningsmiddel bestande for yderligere to kolonner. Aspirer 2 pi af de resterende otte ligand eller opløsningsmidler aktier og tilføje disse til en fjerde kolonne i pladen. Gentag dette for yderligere to kolonner. Dette vil give tredobbelte prøver for alle 16 ligand og prøver opløsningsmidler.
- Placer en qPCR segl over pladen (se trin 1.4).
- Centrifugeres pladen ved 500 x g ito min.
- Pladen anbringes i qPCR instrumentet. Kør en termisk denaturering ved hjælp af de parametre, der er specificeret i trin 1.6.
- Ved afslutningen af instrumentet køre, skal du klikke på knappen "Analyser" på skærmen. Gem resultatet fil.
- Åbn protein termisk ændring-software. Opret en ny undersøgelse; under fanebladet Egenskaber, giver dette et navn, og i fanen Betingelser, detaljeret ligander.
- Flyt til fanen Eksperiment filer, og importere den gemte resultater fil (XXX.eds) og angive indholdet af hver brønd.
BEMÆRK: skabelonfiler er tilgængelige online på http: // www.exeter.ac.uk/biosciences/capsular. - Flyt til fanen Analysis, og tryk på knappen "Analyze".
- Vælg "Replikater" fanen fra menuen i venstre side af skærmen for at vise resultaterne som tre eksemplarer. Vurdere pålideligheden af de data, baseret på, hvor stramt den tredobbelte er. Should de tredobbelte ringe reproducerbarhed, undersøge de rå data nøje.
- Analysere data ved hjælp af både Boltzmann eller Afledte metoder til vurdering af smeltetemperatur. Vælg "Gentagne resultater" fanen, og i "Gentagne resultater plot", slå "Plot ved:" knappen mellem "Tm - Boltzmann" og "Tm - derivat". Vælg den metode, der giver større reproducerbarhed for prøven. Eksportere resultaterne til yderligere undersøgelse med Excel under fanen Eksporter.
BEMÆRK: For prøver, der viser flere overgange, er det næsten altid bedst at bruge Afledt metode i multipel smelte tilstand. Resultaterne eksporteres i et faneblad afgrænset format. Det er bedst at åbne den eksporterede fil i Excel, og straks gemme i Excel-format. - Gentag forsøget mindst to gange, herunder en gentagelse på en separat dag, for at sikre reproducerbarhed af resultaterne. Skulle dataanalyse (se trin 3 nedenfor)indikerer, at værdien af Kd er væsentligt anderledes end den oprindelige skøn, ændre ligandkoncentrationer tilsvarende (se trin 2.2) for at sikre en god vifte af værdier omkring Kd.
3. Dataanalyse til Bestem Dissociationskonstanten under varmedenaturering
- Opret en tabel i Excel for ligandkoncentrationer og smeltetemperaturen.
- Åbn GraphPad Prism software og skabe en XY-bord. Indtast data, ved hjælp af X-kolonne for ligandkoncentrationer og Y kolonnen for smeltetemperatur resultater.
BEMÆRK: Et eksempel er vist, er figur 1B. Et script med ligninger forudindlæste og alternative instruktioner til brug af SPSS statistisk pakke, er tilgængelige online på http: // www.exeter.ac.uk/biosciences/capsular. - På fanen Analyse, skal du vælge at ændre analyseparameterens (Ctrl + T). For at indtaste den korrekte model, vælg "Ny" og "Opret ny ligning". Indsæt ligning beskrevet i tabel 3 som "Enkelt sted ligandbinding".
BEMÆRK: Et eksempel på disse trin er vist i figur 1C. Når du bruger scriptet med ligninger forudindlæst, kan den relevante ligning rettes vælges fra listen i stedet indtastet. Afledning af denne ligning er fastsat i et tillæg. - Vælg "Regler for startværdier", og indtast regler for oprindelige værdier, som beskrevet i tabel 3.
- Begræns parameter P, som "Konstant lig med" og indtaste den endelige koncentration af protein (i samme enhed som liganden er givet i).
- Vælg OK for at foretage analysen.
BEMÆRK: Et eksempel på disse trin er vist i figur 1D. Den graftegning software producerer en figur, der viser de data og pasformen til modellen. Eksempler på tisse analyser er vist i de repræsentative data.
4. tilpasningsdata kooperative modeller
Til at passe data til en kooperativ model, vælge mellem enten en simpel kooperativ model eller en model, hvor to separate dissociationskonstanter er defineret. Den første metode er at foretrække i tilfælde af negativ kooperativitet eller som en indledende undersøgelse. I princippet er det imidlertid bedre i tilfælde af positiv kooperativitet at modellere to forskellige dissociationskonstanter 18. I dette tilfælde kan modellering fortsætte antager enten sekventiel binding af ligander eller en uafhængig binding af ligander.
- Følg samme indledende trin som i protokol 3. Men på trin 3.3, skal du indsætte en af ligningerne i tabel 3 anført som "Simple kooperativ model", "Sekventiel binding af to ligander" eller "uafhængig binding af to ligander" 18.
- Vælg de relevante regler for oprindelige værdierforbundet med hver af disse ligninger i tabel 3.
- Undersøg fit af modellen til data. Bør de data passer dårligt, overveje en anden model.
BEMÆRK: Det er også vigtigt nøje at undersøge montering af smeltepunktet til dataene ved Protein Termisk Shift software (trin 2.9): nogle gange er det nødvendigt at ændre de parametre, der her for at få de bedste resultater. En anden overvejelse er, om den række af datapunkter er ideel, og om der er nogen unormale punkter: enten et begrænset sæt af data på hver side af Kd, eller en enkelt unormal punkt (især på de højeste ligandkoncentrationer), kan have stor indflydelse resultaterne. - Gentag forsøget mindst to gange (se trin 2.12) for at sikre reproducerbarhed.
5. Montering af data til kurver, som viser Binary Forskydninger i smeltetemperatur
Lejlighedsvis, snarere end en gradueret reaktion på liganden, proteiner væretobserveret til at vedtage en binær respons, hvor bundet prøve er klart adskilt fra ubundet prøve. Et eksempel er tilvejebragt i de repræsentative resultater (figur 4). I dette tilfælde vil monteringen af de smeltetemperaturer ikke en god pasform til Kd.
- Eksportere de rå data output fra protein termisk ændring-software. For hver temperatur punkt beregne den gennemsnitlige fluorescens for nul ligand og højeste ligandkoncentrationer. Tabulate resultaterne fra hvert datapunkt siden disse.
BEMÆRK: Fejlen oprettet her er mindre end fejlen i de påmonterede smeltetemperaturer. - Åbn SPSS statistisk pakke. Kopier temperaturer, de to middelværdier datasæt, og data for hvert forsøg til en data vindue i SPSS. I fanebladet Variable, indstilles den gennemsnitlige datasæt for ingen ligand som "lavt", og den gennemsnitlige datasæt for den højeste ligandkoncentration som "høj".
- Download syntaks fil tilgængeligonline på på http: // www.exeter.ac.uk/biosciences/capsular . Vælg "Kør → Kør alle".
- Kopier andelen bundet resultater til et nyt Excel-projektmappe, med de relevante ligandkoncentrationer.
- Åbn Graphpad software og skabe en XY-bord. Indtast data, ved hjælp af X-kolonne for ligandkoncentrationer og Y kolonnen for smeltetemperatur resultater. På fanen analyse, skal du vælge "ændre analyseparametre". For at indtaste den korrekte model, vælg "Ny" og "Opret ny ligning". Indtast ligningen givet i tabel 3, opført som "Analyse af binære forskydninger i smeltetemperatur".
- Vælg "Regler for startværdier", og indtast regler for oprindelige værdier, der er beskrevet i tabel 3. Begræns parameter P, som "lig Konstant til" og indtast den endelige koncentration af protein (i samme enhed som ligand er givet i).
BEMÆRK: eksempler på at fuldføre disse bokse til protokollen i afsnit 3 er vist i figur 1C, D. - Hvis der er en god pasform, kan resultatet blive forbedret ved at ekstrapolere til det forventede resultat ved uendelig ligandkoncentration. Fra model af andelen bundet ved hver ligandkoncentration undersøge værdien for den største værdi af ligand koncentration. Hvis dette er 0,99 eller større, er det usandsynligt at forbedre resultaterne yderligere analyse.
- Hvis andelen er mindre end 0,99, er et yderligere trin nødvendigt for at korrigere for virkningerne af det ubundne protein i højeste ligandkoncentrationen prøve. I trin 5.2, skriv den andel af liganden bundet på det højeste ligandkoncentration punkt (fra trin 5.7) i celle R2 (en anden celle kan anvendes, og R2 udskiftes med passende i ligningen i tabel 3). Opret en ekstra kolonne efter gennemsnittet af de højeste ligandkoncentrationen resultater. I de granerT-celle, kopiere ligningen anført i tabel 3 som "Ekstrapolering uendelig ligandkoncentration". Kopier denne formel til de resterende celler i denne kolonne.
BEMÆRK: Denne beregning fjerner effekten af ubundet protein i højeste ligandkoncentrationen. Forskellen mellem liganden frit protein og den højeste ligandkoncentration multipliceres med den reciprokke værdi af den del bundet ved den højeste ligand koncentration for at tilvejebringe den forventede forskel mellem fuldt bundne og ubundne protein tilstande ved hver temperatur punkt. Denne forskel tilføjes eller subtraheres fra den ubundne tilstand for at give den forventede fluorescens til fuldt ligand bundet protein. - Udskift kolonnen for maksimal koncentration ligand i SPSS dataarket med denne nye kolonne, og gentag data montering.
BEMÆRK: trin 5,7-5,9 skal muligvis gentages, hvis modellen tyder på en yderligere markant ændring i andelen bundet ved de maksimale ligand Concentrati(hvis dette er tilfældet, ville det sandsynligvis være ideelt at gentage forsøget med en højere ligandkoncentration punkt inkluderet). - I tilfælde, hvor proteinet viser en binær skift og viser kooperativ adfærd ligningen foreslået i trin 5.5 skal være substitueret med dem fra trin 4.1. "Top" og "bund" parametre bør erstattes af 1 og 0 henholdsvis.
- Gentag forsøget mindst to gange (se trin 2.12) for at sikre reproducerbarhed.
Representative Results
En fremragende test substrat for denne metode er hexokinase. Dette har den fordel at være let kommercielt tilgængelige, og som har to substrater, som findes i de fleste laboratorier og som giver klare, reproducerbare resultater i assayet. En indledende koncentration skærm (protokol 1), ved hjælp af hexokinase og glucose (figur 2A), tyder på, at den sandsynlige Kd vil være i intervallet fra 0,2 til 1,7 mM. Derfor blev en større skærm (protokol 2) udføres ved hjælp af de viste koncentrationer i tabel 4. Resultaterne (figur 2B) viser en god pasform til den enkelt sted ligandbinding ligning (protokol afsnit 3.3) [9], og gav en K d på 1,2 ± 0,1 mM.
Det formodede heptose-guanyl transferase WcbM 19,20 viser en stærk termisk skift på binding til GTP (figur 3A). En indledende skærm foreslået, at Kd vil være i området omkring 100 pM. Derfor er en fuld skærm blev oprettet ved hjælp af de viste koncentrationer i tabel 5 Montering af resultaterne til at ligning 3.3 viste en rimelig fit (R2 af 0,981, figur 3B). .Imidlertid, Er der en tydelig forskel mellem de data og den model, tyder på, at der er behov for en anden ligning. Søgning af proteinet Databank 21 med WcbM sekvens viste, at de nærmeste homologer for hvilke strukturer er blevet bestemt danne dimerer. Dataene blev derfor analyseret ved hjælp af de tre ligninger for kooperativ, sekventiel, og uafhængig binding af to ligander (Protokol 4). Monteringsvejledningen statistik for et kooperativ model gav en R 2-værdi på 0,998 og standardafvigelsen af restprodukter (Sy.x) af 0,215, mens både sekventielle og uafhængige bindende modeller gav en R 2-værdi på 0,992 og en Sy.x af 0.480 og 0,461 henholdsvis. Dette antyder, at modellengiver den bedste pasform til data blev den kooperative model: her en K ½ af 230 ± 10 pM blev observeret med en n-værdi på 0,52 ± 0,02 (figur 3C). Dette indikerede en negativ kooperativitet til binding. Bemærk, at en K ½ blev anvendt i dette tilfælde snarere end Kd, da enhederne til Kd ville være temmelig utilfredsstillende uM 0,52.
Den formodede BNP-6-deoxy-β-D-Manno -heptopyranose 2-O -acetylase, WcbI 22, viser en temmelig usædvanlig resultat i differential scanning fluorimetri. I mangel af ligander, det viser et klart og enkelt denaturering (figur 4A). Coenzym A (CoA) blev identificeret som en ligand af dette protein ved hjælp af DSF, og affiniteten af proteinet til denne partner blev undersøgt som beskrevet i protokollen. Ved tilstedeværelse af høje koncentrationer af CoA en stærk shift til en højere temperatur er observeret med en ændring i smeltetemperatur på 15 ° C. Men ved mellemliggende koncentrationer, snarere end et skift til en monofasisk smelter ved et mellemliggende smeltepunkt, WcbI viste en bifasisk smeltning, med proteinet synes at smelte ved enten ligand-fri temperatur eller fuldstændig bundet smeltetemperatur (figur 4A) . Andelene af de to arter ændret på en dosisafhængig måde, med stigende substratkoncentrationer øge andelen, der smeltede ved den højere temperatur (figur 4B). Direkte analyse af disse data var udfordrende: montering på Boltzmann ligning gav meget dårlige anfald, mens afledte metoder fremhævet, at to smeltende hændelser blev forekommende, men ikke hjælpe med at påvise en ændring med stigende ligandkoncentration.
En mindre konventionelle tilgang til at analysere disse data blev derfor vedtaget (Protokol 5). Fluorescensen derivative resultater uden ligand og på højeste ligandkoncentration blev taget som repræsenterer i det væsentlige alt protein i lavere smeltetemperatur eller højere smeltetemperatur tilstand. De resterende afledte data blev monteret ved hvert punkt som summen af en del af hver af disse to stater, idet andelen summeres til enhed (figur 4C). De opnåede data blev derefter monteret som før til opnåelse af en tilsyneladende Kd, under anvendelse af de samme ligninger som før. Det fremhæves, at den "store" ligand punkt er sandsynligvis kun 95% ligandbundne. Dataene blev derefter ekstrapoleret til en forudsigelse af resultatet for en 100% bundet protein, og datafitting gentaget for at give en tilsyneladende Kd på 58 ± 2 um. Dette gav en god pasform af de eksperimentelle resultater til den bindende model (figur 4D).
FO: indhold-width = "5in" src = "/ filer / ftp_upload / 51809 / 51809fig1highres.jpg" width = "500" />
Figur 1. Eksempler på eksperiment opsætning og analyse. (A) Eksempel på den forventede form af en termisk denaturering profil (taget fra data for gær hexokinase). Den karakteristiske form af de rå data viser en gradvis stigning i fluorescens til et maksimum efterfulgt af et lavvandet fald (diskuteret mere detaljeret i 9). Dette er ledsaget af en enkelt top i den første afledede af fluorescensen. (B) Eksempel på indtastning af data i Graphpad. Ligandkoncentration gives på X-aksen, og observerede smeltetemperaturer på Y-aksen. (C) Eksempel på ligning definitionen i Graphpad. (D) Eksempler på korrekt indstilling af oprindelige værdier i variabler, og fastsættelse af proteinkoncentrationen, at muliggøre korrekt bestemmelse af dissociationskonstanten.m / filer / ftp_upload / 51809 / 51809fig1highres.jpg "target =" _blank "> Klik her for at se en større version af dette tal.
. Figur 2. Interaktion af hexokinase med glucose målt ved differentiel scanning fluorimetri (A) Et indledende forsøg teste en bred vifte af glucosekoncentrationer tyder på, at Kd er tilbøjelige til at være i intervallet 0,2 -. 1,7 mM (B) En detaljeret eksperiment, prøvning 16 koncentrationer af glucose, tillader bestemmelse af den tilsyneladende Kd som 1,12 ± 0,05 mM. Dataene passer særdeles godt til den model for en enkelt bindende begivenhed (med bunden (T1) og top (T2) temperaturer montering på 35,4 ± 0,2 ° C og 49,3 ± 0,5 ° C henholdsvis). Bemærk, atDisse data blev indsamlet i nærværelse af 10 mM MgCl2. Disse billeder blev fremstillet ved anvendelse af GraphPad. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 3. Interaktion af WcbM med GTP afslører en anti-kooperativ binding. (A) Et indledende forsøg teste en bred vifte af GTP koncentrationer tyder på, at Kd er tilbøjelige til at være i størrelsesordenen 200 -. 500 uM (B) En detaljeret eksperiment, test 16 koncentrationer af GTP, foreslår en værdi for den tilsyneladende Kd på 120 ± 20 pM. Men når en logaritmisk skala anvendes til x-aksen, er der en betydelig discrePancy mellem modellen og data. (C) Analyse af de samme data med en kooperativ model viser en god pasform til data, hvor en simpel kooperativ model anvendes. Her blev en K ½ på 230 ± 20 pM bestemmes med kooperativitet koefficient n = 0,52 ± 0,02 (med bunden (T1) og toppen (T2) temperaturer montering på 69,63 ± 0,06 ° C og 79,9 ± 0,1 ° C henholdsvis). Som WcbM synes at være dimer, indebærer dette, at enzymet er perfekt anticooperative i sin binding til GTP. Disse billeder blev fremstillet ved anvendelse af GraphPad. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 4. WcbI viser en bifasisk smeltepunkt mønsteri nærvær af dets ligand coenzym A (CoA). (A) WcbI, i fravær af ligand (blå), viser en simpel monofasisk smeltepunkt mønster. Ved høje ligandkoncentrationer (1 mm, grøn linje), ses et lignende mønster. Men ved mellemliggende ligandkoncentrationer. (60 uM, red line), to særskilte smeltetoppe, svarende til ligand-fri og ligand-bundne tilstande observeret (B) at overgangen mellem de to sæt af toppe er dosisafhængig over hele koncentrationsområde. (C) Modellering af bifasisk smeltning som en sum af en del af ligand frie og høje ligand resultater giver en god pasform til data (stiplet lilla linje sammenlignet med rød linje). Denne pasform er forbedret ved at ekstrapolere resultatet observeret for høj koncentration ligand (hvor modellen antyder ~ 95% belægning) til fuld belægning (stiplet blå linie). (D) De opnåede data for andelen af WcbI bundet til CoA sho ws en god pasform til en simpel bindende model, med en Kd på 58 ± 2 um (Disse data repræsenterer data, der indsamles på to separate dage, med lidt forskellige ligandkoncentrationer valgt til den anden dag er baseret på det første sæt af resultater). Paneler. (A - C) blev fremstillet ved anvendelse af Excel og panel (d) brug Graphpad Klik her for at se en større version af dette tal.
Tabel 1. Opskrift på indledende forsøg.
| Reagens | Volumen i mix (pl) |
| Protein | Til endelig koncentration på 0,11 mg / ml |
| 0,3 | |
| 0,5 M HEPES, pH 7,0 | 3.7 |
| 5 M NaCI | 5.6 |
| Vand | Til 180 pi |
Dette beskriver den "master mix" af protein, detektionsreagens og buffer for en indledende scouting eksperiment for at give et skøn over Kd, som beskrevet i protokol sektion 1. Denne buffer blanding er passende for generiske proteiner. Hvis tidligere resultater tyder bør anvendes andre buffere, skal disse erstattes. Hvis proteinet bestanden er i en lav koncentration (dvs. mindre end 0,3 mg / ml), kan det være nødvendigt at reducere mængden af yderligere puffer tilsættes for at kompensere for puffer allerede er til stede i proteinet prøven.
| Reagens | Volumen i mix (pl) |
| Protein | Til endelig koncentration på 0,11 mg / ml |
| 5,000x SYPRO Orange | 1.78 |
| 0,5 M HEPES, pH 7,0 | 22.2 |
| 5 M NaCI | 33.3 |
| Vand | Til 180 pi |
Dette beskriver den "master mix" af protein, afsløring reagens og Buffer for en fuldstændig bestemmelse af Kd for et protein prøve som beskrevet i protokol afsnit 2. Denne buffer blanding er egnet til generiske proteiner. Hvis tidligere resultater tyder bør anvendes andre buffere, skal disse erstattes. Hvis proteinet bestanden er i en lav koncentration (dvs. mindre end 0,3 mg / ml), kan det være nødvendigt at reducere mængden af yderligere puffer tilsættes for at kompensere for puffer allerede er til stede i proteinet prøven.
Tabel 3. Ligninger og parametre for dataanalyse.
| Skridt i forsøgsprotokol | Ligning kræves | Nødvendige parametre | Beskrivelse af variabler og parametre |
| 3.3 | </ Td> | ||
| Enkelt sted ligandbinding | Y = bund + ((top-bund) * (1 - ((PK d -X + sqrt (((P + X + Kd) ^ 2) - (4 * P * X))) / (2 * P )))) | P proteinkoncentration. Kd: dissociationskonstant. P og Kd er givet i de samme enheder, som blev anvendt til ligandkoncentrationer. Top, Bund: smeltetemperaturer på uendelig ligandkoncentration og ingen ligandkoncentrationen hhv. | |
| 3.4 | Bund = * ymin | YMin: Mindste værdi af y (lavest eksperimentel protein Tm, i dette tilfælde) | |
| Top = * ymax YMax: Maksimal værdi af y (højest eksperimentel protein Tm) | |||
| Kd = * X på ymid | Ymid: værdien af Y, der svarer til gennemsnittet af Ymin og Ymax. X er den tilsvarende X-værdi (her er det relevante ligandkoncentration) | ||
| P = (Initial værdi, at være egnet) | |||
| 4.1 | |||
| Simpel kooperativ model | Y = bund + ((top-bund) * (((X / Kd) ^ n) / (1 + ((X / Kd) ^ n)))) | n: Hsyg koefficient. Dette beskriver kooperativitet eller andre biokemiske egenskaber af proteinet, og er ikke nødvendigvis et estimat af antallet af ligand binding sites i proteinet. En Hill koefficienten repræsenterer ingen kooperativitet; værdier under ét indikerer negativ kooperativitet, og værdier større end én positiv kooperativitet. | |
| Bund = * ymin | |||
| Top = * ymax | |||
| Kd = * X på ymid | |||
| P = (Initial værdi, at være egnet ) | |||
| n = (Initial værdi, at være egnet) | |||
| Sekventiel binding af to ligander | Y = bund + ((top-bund) * ((X ^ 2) / (Kd * K2)) / (1 + (X / Kd) + ((X ^ 2) / (Kd * K2))) ) | K2: dissociationskonstant for anden bindende begivenhed. | |
| Bund = * ymin | |||
| Top = * ymax | |||
| DTH: 123px; "> K d = * X på ymid | |||
| K2 = * X på ymid | |||
| P = (Initial værdi, at være egnet) | |||
| Uafhængig binding af to ligander | Y = Bund + ((Top-bund) * ((x ^ 2) / (K d * 2 r)) / (1 + (2 * X / K d) + ((x ^ 2) / (K d * K2) ))) | ||
| Bund = * ymin | |||
| t: 123px; "> Top = * ymax | |||
| Kd = * X på ymid | |||
| K2 = * X på ymid | |||
| P = (Initial værdi, at være egnet) | |||
| 5.5 | |||
| Analyse af binære forskydninger i smeltetemperatur | Y = 1 - ((PK d -X + sqrt (((P + X + Kd) ^ 2) - (4 * P * X))) / (2 * P)) | 23px; ">||
| Bund = * ymin | |||
| Top = * ymax | |||
| Kd = * X på ymid | |||
| P = (Initial værdi, at være egnet) | |||
| 5.8 | |||
| Ekstrapolation til uendelig ligandkoncentration | (C2 - ((1-$ R $ 2) * B2)) / $ R $ 2 | B2: celle indeholdende resultat uden ligand. C2: celle indeholdende resultatet med maksimal ligand. $ R $ 2: celle, der indeholder den andel bundet ved maksimal ligandkoncentration. |
Trin 3, 4 og 5 kræver tilsætning af detaljerede ligninger i analysen software og præcis definition af start parametre for dataanalyse. Ligningerne for hver relevant trin er vist, med de korrekte valg af parametre. Er givet en forklaring af betydningen af variabler og parametre for reference.
Tabel 4. Koncentrationer til screening for interaktion af hexokinase med glucose.
| Prøve punkt | Ligand (glucose) koncentration (mM) |
| 1 | 0 |
| 2 | 0.001 |
| 3 | 0.005 |
| 4 | 0.01 |
| 5 | 0.03 |
| 6 | 0.1 |
| 7 | 0,3 |
| 8 | 0.4 |
| 9 | 0.7 |
| 10 | 1.1 |
| 11 | 2.1 |
| 12 | 3.7 |
| 13 | 5.3 |
| 14 | 7 |
| 15 | 9 |
| 16 | 11 |
Hexokinase fra den spirende gæren Saccharomyces cerevisiae blev tilføjet til master mix som beskrevet i protokollen, suppleret med 10 mM MgCl2 som magnesium er et kendt cofaktor. Det oprindelige estimat af Kd var mellem 0,5 og 2 mm. Eksperimenter blev sat op til at give de angivne slutkoncentrationer af glukose.
Tabel 5. Koncentrationer for screening af interaktion mellem WcbM med BNP.
| Prøve punkt | Ligand (GTP) koncentration (uM) |
| 1 | 0 |
| 2 | 0,5 |
| 3 | 1 |
| 4 | 5 |
| 5 | 10 |
| 6 | 25 |
| 7 | 50 |
| 8 | 100 |
| 9 | 250 |
| 10 | 8px; "> 500|
| 11 | 1.000 |
| 12 | 2.500 |
| 13 | 5.000 |
| 14 | 7.500 |
| 15 | 10.000 |
| 16 | 20.000 |
WcbM fra Burkholderia pseudomallei blev tilføjet til master mix som beskrevet i protokollen. Det oprindelige estimat af Kd var omkring 100 um. Eksperimenter blev sat op til at give de angivne endelige koncentrationer af GTP, der sigter mod at dække mindst to størrelsesordener over og under Kd.
Discussion
Differential scanning fluorimetri har vist sin magt som en robust og alsidig metode til karakterisering proteiner, og identificere potentielle proteinligander. De veldokumenterede succeser i fremskynde protein stabilisering, drug discovery (især i mindre godt finansierede laboratorier) og krystallisering 10,23-25 har gjort det til en attraktiv metode til indledende screening af forbindelser. Forbindelser, der tilsættes proteiner viser en klar dosisafhængig stigning i den tilsyneladende smeltetemperatur 7,9. Imidlertid har der været få forsøg på at bruge resultaterne fra disse forsøg til at bestemme tilsyneladende bindingskonstanter at hjælpe i ranking forbindelser for deres affinitet. Her præsenteres en fremgangsmåde til systematisk at bestemme en tilsyneladende dissociationskonstant for proteiner i nærværelse af en ligand.
Resultaterne præsenteret her viser, at DSF hurtigt og håndfast kan give skøn over dissociationskonstanten foret protein-ligand-kombination. De observerede data kan manipuleres med kommercielt tilgængelige værktøjer til at give en hurtig bestemmelse af Kd, uden at det er nødvendigt at gøre antagelser om sandsynlige værdi af parametre. Fremgangsmåden har en betydelig fordel i forhold til nogle sammenlignelige metoder for at være påholdende i både protein og tid, der kræves. Den her beskrevne eksperiment vil forbruge 0,13 mg protein pr eksperiment (ca. 0,4 mg til eksperimenter gentages i tre eksemplarer). Det sammenligner positivt med isoterm titrering kalorimetri (ITC), hvor et enkelt forsøg med en gennemsnitlig 40 kDa-protein vil forbruge et tilsvarende beløb. Det komplette sæt af eksperimenter, der kræves for denne protokol ville forbruge omkring 4 timer, herunder forberedelse til et enkelt sæt eksperimenter. Igen, dette sandsynligvis være betydeligt hurtigere end metoder såsom ITC eller overfladeplasmonresonans, som samtidig kraftfuld ofte kræver en betydelig optimering for at opnå de bedste data.
Vores resultater viser, at der stadig er et krav til nøje at undersøge de rå data, at pasformen af disse oplysninger bestemme smeltetemperaturen, og pasningen af smeltetemperatur data til at bestemme dissociationskonstanten. En første udfordring er formen på de rå data, der produceres i proteinet smeltning. I nogle tilfælde kan formen ikke tilnærme den, der observeres i figur 1A. Almindelige problemer omfatter lav temperatur skift på ligandbinding høj baggrund fluorescens, og usædvanlige flere overgange i temperaturen. Lave temperaturændringer ses på binding af et antal ligander. Til denne metode er den mest kritiske parameter er fejl i målingen T m, i forhold til temperatur skift. De data kan normalt monteres rimeligt godt, når standardafvigelsen af tredobbelte målinger ikke overstiger 10% af smeltepunktet skift mellem ubundet og fuldt bundet protein. Vores erfaring er, at når en sådan tempfra litteraturen skift er kun 2 ° C, kan dette være tilstrækkeligt til at tilpasse dataene, hvis de enkelte datapunkter er meget præcis. Et andet spørgsmål er usædvanligt formede kurver. Disse adskiller sig ofte mellem fri protein og ligand bundne former, som ligandbindingsstedet påvirker udfolder former for proteinet. I disse tilfælde skal brugeren undersøge, om de data kan anvendes med passende hensyntagen til de modeller, der skal anvendes til bestemmelse af smeltepunkt og dissociationskonstanten. Et andet fælles problem er, at tilsætning af en co-faktor til proteinet (f.eks MgCl2 i vores eksempel med hexokinase) kræves for at opnå de mest pålidelige data. Vores erfaring har været, at en omhyggelig gennemgang af alle de mulige faktorer i forsøget på stadiet for at tage de første målinger er afgørende for at opnå de bedste resultater. Derudover kan alternative teoretiske behandlinger afsløre funktioner i disse data 15,17. Endelig er det ikke ualmindeligt, at nogle proteiner at Contain nativt udsat hydrofobe regioner viser høj baggrundsfluorescens. Der er en række løsninger på disse problemer, som er blevet grundigt gennemgået andetsteds 6,9.
Især skal brugeren overveje om du vil bruge Boltzmann eller afledte modeller (fx figur 4), og i tilfælde af brug af derivater, hvorvidt flere smelter skal modelleres. De to metoder til modellering af termiske udfoldningskurve adskiller sig at Boltzmann metode passer de eksperimentelle data til Boltzmann-ligningen, under forudsætning af en regelmæssig-formet form til udfoldningskurve. I modsætning hertil derivat metode tager den første afledede af de eksperimentelle data for hvert punkt (nederste panel i figur 1A) og mener, at smeltetemperatur til det punkt af højeste første afledede. Derivatet metode generelt returnerer en højere smeltetemperatur ved omkring 2 - 3 ° C. De fleste proteiner vil returnere en mere ensartetresultat (dvs. det, at standardfejlen af smeltepunktet for tredobbelte eksperimenter er lavere) for én af de to metoder. Dette er normalt tæt forbundet med den præcise form af proteinet udfoldningskurve, og det er nødvendigt empirisk at bestemme den bedste metode i hvert tilfælde. Når der anvendes den afledte model, er det også vigtigt at overveje flere smeltende begivenheder. Visse data viser tydeligt bevis for flere overgange, og i disse tilfælde er resultaterne sandsynligvis være lettere at fortolke, om disse mange smeltende begivenheder modelleres. I forbindelse med denne protokol, er det ofte tilfældet, at tilsætningen af ligand kan forårsage et protein til at skifte fra at have flere smeltende overgange til en enkelt overgang (fx ved at stabilisere den mest termisk skrøbelige underdomæne), eller omvendt. Vi går derfor ind for, at de rå data undersøges sammen før overvejer hvilken metode vil være bedst at bruge.
Efter modelling af de enkelte smeltepunkter kan yderligere spørgsmål opstår i montering disse til de modeller, der præsenteres i protokollen afsnit. Det er bydende nødvendigt at nøje at undersøge passer til dissociationskonstanten ligning ved hjælp af en logaritmisk skala, da denne analyse fremhæver ofte uoverensstemmelser mellem de observerede data og modellen (e .eks., Figur 3). Mens resultaterne er generelt robuste, pleje fortolkning giver mulighed for at udtrække bedre resultater, og den mest betydning, fra dataene.
En særlig spørgsmål, som disse data er den fortolkning, som skal placeres på proteiner, der viser kooperativitet, eller flere bindende begivenheder i DSF. Vi har til dato kun observeret dette fænomen i proteiner, der forventes at have flere specifikke bindende hændelser (f.eks WcbM, et protein, hvis bedste homolog er en multimer 26, og som fungerer som en multimer på gelpermeationskromatografi [Data ikkevist]). Det er slet ikke klart, at den negative kooperativitet observeret i DSF denaturering indikerer, at enzymet i sidste ende vil vise negativ kooperativitet: snarere, kan dette være en indikation af komplekse binding, der skal undersøges mere grundigt med en bredere vifte af metoder. Dette antyder for os imidlertid, at mere omfattende undersøgelser af sådanne proteiner er tilbøjelige til at identificere interessante effekter.
Angivet for dissociationskonstanten ved hjælp af denne metode værdier er generelt af samme størrelsesorden som dem, der leveres af andre metoder, såsom isotermiske titrering kalorimetri og overfladeplasmonresonans. Men de absolutte værdier er ofte højere end observeret ved hjælp af disse metoder. Dette er i det mindste delvist er en følge af, at dissociationskonstanten observeres smeltetemperaturen af proteinet med liganden. Denne K d er generelt højere end ved fysiologiske temperaturer. Den dissociation konstant er relateret til temperaturen af reaktionen ved ligningerne:
[1]
[2]
(Hvor c θ er standard reference koncentration, Δ r G er Gibbs frie energi forandring af reaktionen, R er den molære gas konstant, Δ H er enthalpiændringen i reaktionen, og Δ S er entropiændring i reaktionen .)
Reaktioner med dissociationskonstanter i måleområdet af denne metode vil generelt have en negativ Δ R g, og så effekten af en stigning i temperaturen på ligning [1], vil være at øge dissociationskonstanten. Både Δ H og Δ S vilkår, der udgør Gibbs fri energi (ligning [2]) er temperature afhængig 27, og effekten på dissociationskonstanten vil afhænge af størrelsen og fortegnet på disse temperatur afhængigheder, og det vil nødvendigvis være interaktion afhængige. Følgelig er det ikke uventet, at de dissociationskonstanter bestemt ved denne metode er ofte større end de bestemmes ved fremgangsmåder, der opererer ved stuetemperatur. Temperaturafhængighed er naturligvis også en advarsel for mange andre metoder, som er tilbøjelige til at give dissociationskonstanten ved temperaturer lavere end den fysiologiske temperatur.
En anden advarsel af DSF metode er, at det er et mærket metode, i modsætning til ITC. Den fluorescerende mærkning, der anvendes (SYPRO Orange) er hydrofobt, og det i nogle tilfælde kan konkurrere med bindingen af hydrofobe ligander til proteiner. Derfor er det sandsynligt, at i nogle tilfælde, dissociationskonstant opnået vil blive kunstigt hævet som følge af konkurrence med mærket. Men til sammenligning af forskellige ligander (den primære anvendelse afDSF), er det usandsynligt, at være tilstrækkelig væsentlig til at påvirke placeringen af forbindelser med affinitet forskellene.
En potentiel ulempe ved denne metode er detektionsgrænsen, der kan opnås. I princippet burde det ikke være muligt at måle en værdi for Kd, der er lavere end 50% af proteinkoncentrationen, og endda værdier i dette område forventes at være af tvivlsom nøjagtighed. Selv detektionsgrænsen i denne ende af intervallet kan forlænges en smule ved at reducere koncentrationen af protein og farvestof, vil følsomheden af instrumentet forhindre yderligere reduktion i proteinkoncentration. Ligeledes vil den øvre ende af følsomheden bestemmes af opløseligheden af liganden. For at opnå en matematisk robust estimat for Kd, er det yderst vigtigt at opnå data med 90% af det tilstedeværende protein i ligand-bundet form, hvilket kræver ligandkoncentrationer at være omtrentligely ti gange Kd (forudsat ingen kooperativitet). Detektionsgrænsen vil derfor nødvendigvis være en tiendedel af opløseligheden af liganden i den relevante puffer. Dette betyder, at detektionsgrænserne for fremgangsmåden typisk vil ligge mellem 1 pM og mellem 1 og 100 mM, afhængigt af proteinet og liganden.
Sammenfattende differentiel scanning fluorimetri er en alsidig teknik anvendes på en lang række proteiner. Ved hjælp af de metoder, der præsenteres her, er det muligt hurtigt og billigt at bestemme affiniteten af et protein til forskellige ligander. Det har et stort potentiale for anvendelse i proteinoprensning og stabilisering, belyse den funktion eller specificitet af enzymer fra metagenomes, og inden for lægemiddelforskning, især i små laboratorier.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| StepOne real time PCR instrument | Life Technologies | 4376357 | DSF can be performed with many other instruments. The StepOne instrument has very convenient software for data analysis. |
| Protein thermal shift software v1.0 | Life Technologies | 4466037 | |
| MicroAmp Fast optical 48-well plates | Life Technologies | 4375816 | |
| Optical sealing tape | Life Technologies | 4375323 | Bio-rad part no. 223-9444 is an alternative supplier |
| U-bottomed 96-well plates | Fisher | 11521943 | |
| SYPRO Orange | Life Technologies | S6650 | For a smaller volume supplier, use Sigma part no. S5692 |
| SPSS statistics version 20 | IBM | Other statistics packages will provide similar functionality | |
| GraphPad Prism 6.02 | GraphPad | Other statistics packages will provide similar functionality | |
| Hand applicator (PA1) | 3M | 75-3454-4264-6 | |
| Hexokinase from Saccharomyces cerevisiae | Sigma-Aldrich | H5000 | |
| Glucose | Fisher scientific | 10141520 |
References
- Freyer, M. W., Lewis, E. A. Isothermal titration calorimetry: experimental design, data analysis, and probing macromolecule/ligand binding and kinetic interactions. Methods Cell Biol. 84, 79-113 (2008).
- Ladbury, J. E. Calorimetry as a tool for understanding biomolecular interactions and an aid to drug design. Biochem Soc Trans. 38, 888-893 (2010).
- Abdiche, Y., Malashock, D., Pinkerton, A., Pons, J. Determining kinetics and affinities of protein interactions using a parallel real-time label-free biosensor, the Octet. Anal Biochem. 377, 209-217 (2008).
- Pantoliano, M. W., et al. High-density miniaturized thermal shift assays as a general strategy for drug discovery. J Biomol Screen. 6, 429-440 (2001).
- Senisterra, G., Chau, I., Vedadi, M. Thermal denaturation assays in chemical biology. Assay Drug Dev Technol. 10, 128-136 (2012).
- Ericsson, U. B., Hallberg, B. M., Detitta, G. T., Dekker, N., Nordlund, P. Thermofluor-based high-throughput stability optimization of proteins for structural studies. Anal Biochem. 357, 289-298 (2006).
- Lo, M. C., et al. Evaluation of fluorescence-based thermal shift assays for hit identification in drug discovery. Anal Biochem. 332, 153-159 (2004).
- Nettleship, J. E., Brown, J., Groves, M. R., Geerlof, A. Methods for protein characterization by mass spectrometry, thermal shift (ThermoFluor) assay, and multiangle or static light scattering. Methods Mol Biol. 426, 299-318 (2008).
- Niesen, F. H., Berglund, H., Vedadi, M. The use of differential scanning fluorimetry to detect ligand interactions that promote protein stability. Nat Protoc. 2, 2212-2221 (2007).
- Geders, T. W., Gustafson, K., Finzel, B. C. Use of differential scanning fluorimetry to optimize the purification and crystallization of PLP-dependent enzymes. Acta Crystallogr Sect F Struct Biol Cryst Commun. 68, 596-600 (2012).
- Vedadi, M., et al. Chemical screening methods to identify ligands that promote protein stability, protein crystallization, and structure determination. Proc Natl Acad Sci USA. 103, 15835-15840 (2006).
- Davis, B. J., Erlanson, D. A. Learning from our mistakes: the 'unknown knowns' in fragment screening. Bioorg Med Chem Lett. 23, 2844-2852 (2013).
- Larsson, A., Jansson, A., Aberg, A., Nordlund, P. Efficiency of hit generation and structural characterization in fragment-based ligand discovery. Curr Opin Chem Biol. 15, 482-488 (2011).
- Scott, D. E., et al. Using a fragment-based approach to target protein-protein interactions. Chembiochem. 14, 332-342 (2013).
- Cimmperman, P., et al. A quantitative model of thermal stabilization and destabilization of proteins by ligands. Biophys. J. 95, 3222-3231 (2008).
- Matulis, D., Kranz, J. K., Salemme, F. R., Todd, M. J. Thermodynamic stability of carbonic anhydrase: measurements of binding affinity and stoichiometry using ThermoFluor. Biochemistry. 44, 5258-5266 (2005).
- Zubriene, A., et al. Measurement of nanomolar dissociation constants by titration calorimetry and thermal shift assay - radicicol binding to Hsp90 and ethoxzolamide binding to CAII. Int J Mol Sci. 10, 2662-2680 (2009).
- Weiss, J. N. The Hill equation revisited: uses and misuses. FASEB J. 11, 835-841 (1997).
- Cuccui, J., et al. Characterization of the Burkholderia pseudomallei K96243 capsular polysaccharide I coding region. Infect Immun. 80, 1209-1221 (2012).
- DeShazer, D., Waag, D. M., Fritz, D. L., Woods, D. E. Identification of a Burkholderia mallei polysaccharide gene cluster by subtractive hybridization and demonstration that the encoded capsule is an essential virulence determinant. Microb Pathog. 30, 253-269 (2001).
- Berman, H., Henrick, K., Nakamura, H. Announcing the worldwide Protein Data Bank. Nat Struct Biol. 10, 980 (2003).
- Vivoli, M., Ayres, E., Beaumont, E., Isupov, M., Harmer, N. Structural insights into WcbI, a novel polysaccharide biosynthesis enzyme. IUCr Journal. 1 (1), 28-38 (2014).
- Sorrell, F. J., Greenwood, G. K., Birchall, K., Chen, B. Development of a differential scanning fluorimetry based high throughput screening assay for the discovery of affinity binders against an anthrax protein. J Pharm Biomed Anal. 52, 802-808 (2010).
- Uniewicz, K. A., et al. Differential scanning fluorimetry measurement of protein stability changes upon binding to glycosaminoglycans: a screening test for binding specificity. Anal Chem. 82, 3796-3802 (2010).
- Wan, K. F., et al. Differential scanning fluorimetry as secondary screening platform for small molecule inhibitors of Bcl-XL. Cell Cycle. 8, 3943-3952 (2009).
- Koropatkin, N. M., Holden, H. M. Molecular structure of alpha-D-glucose-1-phosphate cytidylyltransferase from Salmonella typhi. J Biol Chem. 279, 44023-44029 (2004).
- Paleskava, A., Konevega, A. L., Rodnina, M. V. Thermodynamics of the GTP-GDP-operated conformational switch of selenocysteine-specific translation factor SelB. J Biol Chem. 287, 27906-27912 (2012).
