Abstract
विधियों की एक विस्तृत रेंज वर्तमान में एक प्रोटीन के बीच निरंतर हदबंदी निर्धारित करने और छोटे अणुओं बातचीत के लिए उपलब्ध हैं. हालांकि, इनमें से ज्यादातर विशेषज्ञ उपकरणों के लिए उपयोग की आवश्यकता होती है, और अक्सर प्रभावी रूप से विश्वसनीय प्रयोगों की स्थापना और डेटा का विश्लेषण करने के लिए विशेषज्ञता का एक डिग्री की आवश्यकता होती है. अंतर स्कैनिंग fluorimetry (DSF) तेजी से, या तो शारीरिक भागीदारों की पहचान के लिए या हिट खोज के लिए छोटे अणुओं बातचीत के लिए प्रोटीन की प्रारंभिक जांच के लिए एक मजबूत विधि के रूप में इस्तेमाल किया जा रहा है. इस तकनीक को यह मात्रात्मक पीसीआर के लिए उपयुक्त है, और इंस्ट्रूमेंटेशन अधिकांश संस्थानों में उपलब्ध है ताकि उपयुक्त केवल एक पीसीआर मशीन की आवश्यकता है कि फायदा है; प्रोटोकॉल की एक उत्कृष्ट श्रेणी में पहले से ही उपलब्ध हैं; और विधि के कई उपयोगों के लिए साहित्य में मजबूत उदाहरण ले सकते हैं. पिछले काम DSF डेटा से पृथक्करण स्थिरांक की गणना के कई साधन का प्रस्ताव किया है, लेकिन इन गणितीय मांग कर रहे हैं. यहाँ, हम demonstrate DSF प्रयोगात्मक डेटा के एक उदार राशि से पृथक्करण स्थिरांक आकलन करने के लिए एक विधि. ये आंकड़े आम तौर पर एकत्र की है और एक ही दिन के भीतर विश्लेषण किया जा सकता है. हम साधारण बाध्यकारी घटनाओं से एकत्र आंकड़ों फिट करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है कि कैसे विभिन्न मॉडलों का प्रदर्शन, और सहकारी बंधन या बाध्यकारी स्वतंत्र साइटों उपस्थित जहां हैं. अंत में, हम मानक मॉडल लागू नहीं है जहां एक मामले में डेटा विश्लेषण का एक उदाहरण प्रस्तुत करते हैं. इन विधियों व्यावसायिक रूप से उपलब्ध नियंत्रण प्रोटीन पर एकत्र डेटा, और हमारे अनुसंधान कार्यक्रम से दो प्रोटीन के साथ सचित्र हैं. कुल मिलाकर, हमारे विधि शोधकर्ताओं तेजी DSF का उपयोग प्रोटीन ligand बातचीत में और अधिक जानकारी हासिल करने के लिए एक सरल तरीका प्रदान करता है.
Introduction
सभी प्रोटीन अन्य बड़े अणुओं को सरल आयनों से अन्य अणुओं की एक विविध रेंज के लिए, अलग समानताएं साथ, बाध्य होगा. कई मामलों में, प्रोटीन (जैसे, एक kinase एटीपी के लिए बाध्य) अपने सामान्य समारोह के हिस्से के रूप में छोटे अणु भागीदारों के लिए बाध्य. अन्य बातचीत समारोह से संबंधित नहीं हो सकता है, लेकिन उपकरण (क्रिस्टलीकरण सफलता में सुधार, या समाधान में प्रोटीन को बनाए रखने में सहायता के लिए प्रोटीन को स्थिर कि जैसे, छोटे अणुओं) के रूप में प्रयोगात्मक उपयोगी हो सकता है; अवरोधकों के रूप में कार्य है, और इसलिए एंजाइम की गतिविधि को व्यवस्थित कर सकते हैं सक्रिय साइटों और प्रोटीन की allosteric साइटों के लिए बाध्य है कि छोटे अणुओं whilst.
साथी अणुओं के लिए प्रोटीन की आत्मीयता का निर्धारण किया जा सकता है कि तकनीक की एक विस्तृत श्रृंखला है. इज़ोटेर्माल अनुमापन उष्मामिति 1 यह प्रतिक्रियाओं पर अमीर जानकारी प्रदान करता है के रूप में व्यापक रूप से लेबल मुक्त है,, एक "सोने के मानक 'के रूप में देखा जाता है, और एक के लिए अवसर सीमित हैप्रयोग के rtifacts. हालांकि, उपकरण और प्रयोगात्मक सेट अप के स्वचालन की संवेदनशीलता में हाल ही में सुधार के बावजूद, यह अभी भी प्रोटीन आवश्यकताओं के संदर्भ में अपेक्षाकृत महंगा पर सबसे अच्छा एक कम से मध्यम throughput गया है, और के लिए उदार के साथ बातचीत करने के लिए सबसे उपयुक्त है उच्च समानताएं (100 माइक्रोन कश्मीर विकास के लिए 10 एनएम) 2. ऐसी सतह plasmon अनुनाद या bilayer इंटरफेरोमेट्री 3 प्रस्ताव उच्च throughputs, और संवेदनशीलता हासिल किया है के रूप में अन्य लेबल मुक्त तरीकों 100 दा जितनी कम छोटे अणुओं का पता लगाने के लिए. हालांकि, इन तरीकों के लिए उच्च throughput उपकरणों अपेक्षाकृत महंगे हैं, प्रासंगिक परियोजनाओं की एक निरंतर throughput वहाँ होगा ही जहां जायज, और इतने सारे शैक्षणिक प्रयोगशालाओं के लिए दुर्गम होने की संभावना है.
अंतर स्कैनिंग fluorimetry (DSF, या thermofluor) पहली दवाओं की खोज के लिए एक विधि के रूप में 2001 4 में वर्णित किया गया था. इस metho मेंडी, प्रोटीन एक फ्लोरोसेंट डाई के साथ incubated हैं (शुरू नेफ़थलीन-सल्फोनिक रंगों का इस्तेमाल किया गया था), प्रोटीन की हाइड्रोफोबिक क्षेत्रों के लिए बाध्य पर अपने प्रतिदीप्ति जो बदल. प्रोटीन डाई नमूना फिर गरम किया जाता है, और गर्मी के रूप में उगता प्रतिदीप्ति नजर रखी. प्रोटीन का खुलासा, और प्रोटीन की हाइड्रोफोबिक भागों के जोखिम, तापमान (चित्रा 1 ए) के एक समारोह के रूप में प्रतिदीप्ति में एक विशेषता पैटर्न को जन्म देता है. प्रयोग किसी भी व्यावसायिक मात्रात्मक पीसीआर साधन में छोटी मात्रा में किया जा सकता है, और इसलिए एक ही प्रयोग में, नमूनों की एक बड़ी संख्या में एक साथ (साधन मॉडल के आधार पर आमतौर पर 48, 96 या 384 नमूने,) का परीक्षण किया जा सकता है. प्रयोगों आमतौर पर नमूने 5 के उच्च throughput विश्लेषण करने की संभावना प्रदान करने, एक घंटा के आसपास में प्रदर्शन किया जा सकता है.
कार्यप्रणाली को और अधिक सुधार बेहतर वर्णक्रमीय गुण 6,7 साथ रंगों की गोद देखा है 8,9 के लिए प्रोटोकॉल का सुझाव दिया. विधि के आवेदनों की श्रृंखला तैयार करने और प्रोटीन 10 के भंडारण के लिए इष्टतम स्थितियों की स्थापना पर और क्रिस्टलीकरण 11 सहायता करने के लिए संभावित बाध्यकारी भागीदारों की पहचान पर एक विशेष ध्यान के साथ बढ़ा दिया गया है. विधि के अपेक्षाकृत उच्च throughput, प्रोटीन में अपेक्षाकृत कम लागत (~ 2 प्रतिक्रिया प्रति ग्राम), और कमजोर बंधन अणुओं का अध्ययन करने के लिए प्रयोज्यता विशेष रूप से एक अकादमिक संदर्भ 12-14 में, DSF टुकड़ा आधारित दवा डिजाइन के लिए एक महत्वपूर्ण उपकरण बना दिया है.
प्रोटीन ligand बातचीत का अध्ययन करने के लिए DSF की व्यापक आवेदन के बावजूद, कुछ अध्ययनों से इन अध्ययनों से पृथक्करण स्थिरांक के दृढ़ संकल्प का वर्णन किया है. हालांकि, इन विरल डेटा को या कुछ मामलों ई में लगाया जाना चाहिए कि कई मापदंडों के साथ, प्रोटीन का खुलासा का वर्णन विस्तृत समीकरणों का उत्पादन करने की प्रवृत्ति है7,15-17 stimated. इन विधियों ऐसे असामान्य बदलाव प्रदर्शित कसकर बाध्यकारी यौगिकों, या प्रोटीन के रूप में, चुनौतीपूर्ण मामलों में विशेष रूप से प्रासंगिक हैं. हालांकि, कई प्रयोगशालाओं के लिए, इन विस्तृत विश्लेषण के नियमित प्रयोग के लिए भी बोझिल हैं. इसलिए हम विभिन्न परिदृश्यों के लिए वैकल्पिक उपचार का प्रस्ताव है, और इन विभिन्न प्रोटीन ligand बातचीत से उत्पन्न डेटा फिट करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है कि कैसे प्रदर्शित करता है. हमारे विधि bespoke डेटा विश्लेषण सॉफ्टवेयर उपलब्ध है जिसके लिए StepOne qPCR साधन का उपयोग करता है; इस डेटा के विश्लेषण को गति, जबकि अन्य उपकरणों से परिणाम पहले प्रकाशित तरीकों 9 का उपयोग संसाधित किया जा सकता है, और एक ही बहाव विश्लेषण किया जा सकता है.
Protocol
(परिमाण के एक आदेश के भीतर यानी,) हदबंदी लगातार के लिए एक अनुमानित मूल्य के 1 निर्धारण
- तालिका 1 में विस्तृत मिश्रण तैयार करें.
- उच्चतम उपलब्ध एकाग्रता पर ब्याज की ligand के शेयरों को तैयार है, और इस बात का तो कम छह से दस गुना dilutions. एक अनुमानित कश्मीर डी से पहले डेटा से जाना जाता है, जहां कम से कम दो सांद्रता ऊपर और कश्मीर डी नीचे है करना है.
- विभाज्य एक qPCR थाली में आठ कुओं में मिश्रण के 18 μl. पहले अच्छी तरह से करने के लिए विलायक के 2 μl जोड़ें. शेष सात कुओं की अच्छी तरह से हर एक के लिए ligand कमजोर पड़ने श्रृंखला (1.2 चरण) के प्रत्येक सदस्य के 2 μl जोड़ें.
- थाली पर एक qPCR मुहर रखें. थाली का एक अच्छा सील को प्राप्त करने के लिए, थाली के बीच में (विशिष्ट अभिकर्मकों की टेबल देखें) एक हाथ अपप्लिकेर जगह है. एक तरफ मुहर नीचे चिकनी, और उसके बाद के दूसरे आधे पर दोहरानेथाली.
- हवाई बुलबुले को दूर करने के लिए दो मिनट के लिए 500 XG पर थाली अपकेंद्रित्र.
- एक StepOne qPCR साधन में थाली रखें. (यह 40 मिनट से अधिक 99 डिग्री सेल्सियस के लिए एक रैंप द्वारा पीछा 25 डिग्री सेल्सियस पर एक 2 मिनट ठहराव,, और उसके बाद एक 2 मिनट ठहराव प्रदान करता है) "पिघल वक्र" विकल्प, Rox फिल्टर का चयन करें, और तेजी से रैंप गति का चयन करें. एक थर्मल विकृतीकरण चलाएँ.
नोट: एक रन के प्रदर्शन के लिए स्क्रिप्ट फ़ाइलें http पर ऑनलाइन उपलब्ध हैं: // www.exeter.ac.uk/biosciences/capsular. - साधन रन के समापन पर, स्क्रीन पर "विश्लेषण" बटन पर क्लिक करें. परिणाम फ़ाइल सहेजें.
- प्रोटीन थर्मल शिफ्ट सॉफ्टवेयर खोलें.
- एक नए अध्ययन में बनाएं; गुण टैब में, यह एक नाम देना, और कानून टैब में, विस्तार ligands.
- प्रयोग फ़ाइलें टैब में ले जाएँ, और बचाया परिणाम फ़ाइल (XXX.eds) आयात, और प्रत्येक अच्छी तरह से (टेम्पलेट fil की सामग्री सेटते) लेखकों से उपलब्ध हैं.
- विश्लेषण टैब में ले जाएँ, और "विश्लेषण" बटन दबाएँ.
नोट: इस परिणाम का विश्लेषण करेगा. यह एक्सेल निर्यात टैब का उपयोग कर के साथ आगे की जांच पड़ताल के लिए परिणाम निर्यात करने के लिए संभव है. परिणाम एक टैब चित्रित प्रारूप में निर्यात कर रहे हैं. यह Excel में निर्यात की गई फ़ाइल को खोलने, और तुरंत एक्सेल प्रारूप में बचाने के लिए सबसे अच्छा है.
- अकेले विलायक की उपस्थिति में प्रोटीन चित्रा 1 ए में दिखाया गया है कि इसी तरह के एक परिणाम देता है कि जाँच करें. अगला, "दोहराने" फलक में परिणामों में मनाया पिघलने तापमान की जांच. इस बढ़ती ligand एकाग्रता के साथ पिघलने के तापमान में एक स्पष्ट वृद्धि से पता चलता है कि यह सुनिश्चित करें.
नोट: पिघलने तापमान ligand मुक्त प्रोटीन और बीच आधा रास्ता है जहां आदर्श रूप में, यह (प्रोटीन पूरी तरह ligand बाध्य है यह सोचते हैं कि) एक स्पष्ट अधिकतम तापमान के पिघलने, और एक अनुमानित कश्मीर घ प्रदान करेगाअधिकतम.
हदबंदी लगातार निर्धारण के लिए 2 प्रयोगात्मक सेट अप
- एक मास्टर मिश्रण के रूप में तालिका 2 में विस्तृत मिश्रण तैयार करें.
- अंतिम प्रयोग में दस गुना पतला हो जाएगा जो पंद्रह विभिन्न सांद्रता में ligand के शेयरों तैयार करें. आदर्श रूप में, सांद्रता अनुमान कश्मीर घ ऊपर और नीचे परिमाण के कम से कम दो आदेशों में शामिल हैं, और अनुमान कश्मीर डी पर सांद्रता केंद्र. इस के दोनों तरफ एक और चार अंकों के साथ, अनुमान कश्मीर घ के परिमाण के एक आदेश के भीतर अंक की सात पर ध्यान दें; वहाँ एक विकल्प है, तो saturating कर रहे हैं कि मूल्यों पर अधिक अंक शामिल हैं.
नोट: आवश्यक, यह ligand शेयरों ligand घुलनशीलता सीमित है जहां डबल प्रयोगात्मक एकाग्रता, पर कर रहे हैं कि प्रयोगात्मक शर्तों के ऐसे परिवर्तन करने के लिए संभव है. - गुरु के 120 μl जोड़ेंमास्टर मिश्रण के सुविधाजनक वितरण के लिए एक जलाशय के रूप में कार्य करने के लिए, एक यू तली 96 अच्छी तरह से थाली में आठ कुओं मिश्रण. एक पीसीआर थाली में से एक स्तंभ में 18 μl बांटना एक 8 चैनल पिपेट का उपयोग करें. थाली पर एक 6 x 8 पैटर्न में 48 भरे कुओं की कुल देने के लिए, एक आगे पांच स्तंभों के लिए दोहराएँ.
- एक यू तली 96 अच्छी तरह से थाली में कुओं अलग करने के लिए, 20 ligand शेयरों की μl, या विलायक जोड़ें. एक 8 चैनल पिपेट, महाप्राण आठ अलग ligand स्टॉक्स (या विलायक) के 2 μl का उपयोग करना. कदम 2.3 में मास्टर मिश्रण से भर गया है कि पीसीआर थाली में से एक स्तंभ के लिए इन जोड़ें. आगे के दो स्तंभों के लिए एक ही आठ ligand / विलायक शेयरों के साथ दोहराएँ. महाप्राण 2 शेष आठ ligand या विलायक शेयरों की μl, और थाली में एक चौथे स्तंभ के लिए इन जोड़ें. आगे के दो स्तंभों के लिए इस दोहराएँ. यह सब 16 ligand और विलायक नमूने के लिए तीन प्रतियों के नमूने दे देंगे.
- थाली पर एक qPCR मुहर प्लेस (1.4 कदम देखें).
- के लिए 500 XG पर थाली अपकेंद्रित्रदो मिनट.
- QPCR साधन में थाली रखें. कदम 1.6 में निर्धारित मानकों का उपयोग कर एक थर्मल विकृतीकरण चलाएँ.
- साधन रन के समापन पर, स्क्रीन पर "विश्लेषण" बटन पर क्लिक करें. परिणाम फ़ाइल सहेजें.
- प्रोटीन थर्मल शिफ्ट सॉफ्टवेयर खोलें. एक नए अध्ययन में बनाएं; गुण टैब में, यह एक नाम देना, और कानून टैब में, विस्तार ligands.
- प्रयोग फ़ाइलें टैब में ले जाएँ, और बचाया परिणाम फ़ाइल (XXX.eds) आयात, और अच्छी तरह से प्रत्येक की सामग्री निर्धारित किया है.
नोट: टेम्पलेट फ़ाइलों http पर ऑनलाइन उपलब्ध हैं: // www.exeter.ac.uk/biosciences/capsular. - विश्लेषण टैब में ले जाएँ, और "विश्लेषण" बटन दबाएँ.
- Triplicates के रूप में परिणाम दिखाने के लिए स्क्रीन के बाएं हाथ की ओर मेनू से "replicates" टैब चुनें. Triplicates हैं कैसे तंग पर आधारित आंकड़ों की विश्वसनीयता का आकलन करें. Shoultriplicates गरीब reproducibility दिखाने डी, बारीकी से कच्चे डेटा की जांच.
- तापमान के पिघलने का आकलन करने के लिए बोल्ट्जमान या डेरिवेटिव्स तरीकों दोनों का उपयोग कर डेटा का विश्लेषण. "परिणामों को दोहराने" टैब का चयन करें, और "से प्लॉट:" टॉगल, "परिणाम साजिश को दोहराने" में बीच बटन "टीएम - बोल्ट्जमान 'और' TM - डेरिवेटिव्स". नमूने के लिए अधिक से अधिक reproducibility देता है कि विधि का चयन करें. एक्सेल निर्यात टैब का उपयोग कर के साथ आगे की जांच पड़ताल के लिए परिणामों को निर्यात.
नोट: कई बदलाव चलता है कि नमूने के लिए, यह कई पिघल मोड में डेरिवेटिव्स विधि का उपयोग करने के लिए लगभग हमेशा सबसे अच्छा है. परिणाम एक टैब चित्रित प्रारूप में निर्यात कर रहे हैं. यह Excel में निर्यात की गई फ़ाइल को खोलने, और तुरंत एक्सेल प्रारूप में बचाने के लिए सबसे अच्छा है. - परिणामों के reproducibility सुनिश्चित करने के लिए, एक अलग दिन पर एक दोहराने सहित कम से कम दो बार प्रयोग दोहराएँ. डेटा विश्लेषण (नीचे चरण 3 देखें) चाहिएकश्मीर डी के मूल्य मूल अनुमान के काफी अलग है कि संकेत मिलता है, कश्मीर डी के आसपास मूल्यों की एक अच्छी रेंज सुनिश्चित करने के लिए (2.2 कदम देखें) तदनुसार ligand सांद्रता में परिवर्तन.
3 डेटा विश्लेषण थर्मल विकृतीकरण के तहत लगातार हदबंदी निर्धारण करने के लिए
- Ligand सांद्रता के एक्सेल में एक मेज और पिघलने तापमान बनाएँ.
- GraphPad चश्मे सॉफ्टवेयर खोलें, और एक XY टेबल बनाए. Ligand सांद्रता और तापमान परिणाम पिघलने के लिए वाई स्तंभ के लिए एक्स स्तंभ का उपयोग, डेटा दर्ज करें.
नोट: दिखाया गया एक उदाहरण चित्रा 1 बी है. Preloaded समीकरणों, और SPSS सांख्यिकीय पैकेज का उपयोग कर के लिए वैकल्पिक निर्देश के साथ एक स्क्रिप्ट, http पर ऑनलाइन उपलब्ध हैं: // www.exeter.ac.uk/biosciences/capsular. - विश्लेषण टैब में, विश्लेषण पैरामीटर को बदलने के लिए विकल्प का चयन करेंएस (Ctrl + T). , सही मॉडल दर्ज "नया" का चयन करें, और "नया समीकरण बनाने के लिए". "एक साइट ligand बंधन 'के रूप में 3 तालिका में विस्तृत समीकरण डालें.
नोट: इन चरणों का एक उदाहरण चित्रा 1C में दिखाया गया है. समीकरणों preloaded साथ स्क्रिप्ट का उपयोग करते समय, प्रासंगिक समीकरण सूची के बजाय दर्ज किया गया है चुना निर्देशित किया जा सकता है. इस समीकरण की व्युत्पत्ति एक परिशिष्ट में प्रदान की जाती है. - बॉक्स "प्रारंभिक मान के लिए नियम" का चयन करें, और तालिका 3 में विस्तृत रूप में प्रारंभिक मूल्यों के लिए नियमों को दर्ज करें.
- (Ligand में दिया जाता है के रूप में एक ही इकाइयों में) और प्रोटीन की अंतिम एकाग्रता में प्रवेश करने के लिए "लगातार बराबर" के रूप में, पैरामीटर पी विवश.
- विश्लेषण करने के लिए चयन ठीक है.
नोट: इन चरणों का एक उदाहरण चित्रा -1 में दिखाया गया है. रेखांकन सॉफ्टवेयर डेटा और मॉडल के लिए फिट दिखा एक आंकड़ा तैयार करता है. टी के उदाहरणhese विश्लेषण प्रतिनिधि डेटा में दिखाए जाते हैं.
सहकारी मॉडल को 4 फिटिंग डाटा
एक साधारण सहकारी मॉडल, या दो अलग हदबंदी स्थिरांक परिभाषित कर रहे हैं, जहां एक मॉडल या तो बीच चयन, एक सहकारी मॉडल के लिए डेटा फिट. पहला दृष्टिकोण नकारात्मक cooperativity के मामले में प्राथमिकता दी, या एक प्रारंभिक जांच के रूप में है. हालांकि, सिद्धांत रूप में यह दो अलग हदबंदी 18 स्थिरांक मॉडल के लिए सकारात्मक cooperativity के मामलों में बेहतर है. इस मामले में, मॉडलिंग ligands की अनुक्रमिक बंधन, या ligands के बंधन स्वतंत्र या तो मानते हुए आगे बढ़ सकते हैं.
- , "सरल सहकारी मॉडल 'के रूप में सूचीबद्ध तालिका 3 में समीकरणों की एक डालने, कदम 3.3 में, हालांकि प्रोटोकॉल 3 में" के रूप में दो ligands की अनुक्रमिक बाध्यकारी "एक ही प्रारंभिक चरणों का पालन करें, या 18" स्वतंत्र दो ligands के बंधन ".
- प्रारंभिक मूल्यों के लिए प्रासंगिक नियमों का चयन करेंतालिका 3 में इन समीकरणों में से प्रत्येक के साथ जुड़े.
- आंकड़ों के मॉडल के फिट की जाँच करें. डेटा खराब फिट होना चाहिए, एक और मॉडल पर विचार करें.
नोट: यह भी ध्यान से प्रोटीन थर्मल शिफ्ट सॉफ्टवेयर (कदम 2.9) द्वारा आंकड़ों के पिघलने के तापमान की फिटिंग की जांच करने के लिए महत्वपूर्ण है: कभी कभी यह सबसे अच्छा परिणाम प्राप्त करने के लिए यहां मानकों में परिवर्तन करने के लिए आवश्यक है. कश्मीर डी के दोनों ओर पर डेटा की एक सीमित सेट, या (विशेष रूप से उच्चतम ligand सांद्रता में) एक ही विषम बिंदु, या तो काफी प्रभावित कर सकते हैं: एक और विचार डेटा अंक की रेंज आदर्श है, और किसी भी विषम अंक हैं कि क्या है परिणाम है. - Reproducibility सुनिश्चित करने के लिए कम से कम दो बार (कदम 2.12 देखें) प्रयोग दोहराने.
पिघलने के तापमान में द्विआधारी परिवर्तन दिखा रहा है घटता 5 फिटिंग डाटा
कभी कभी, बल्कि ligand के लिए एक वर्गीकृत प्रतिक्रिया से, प्रोटीन किया गया हैबाध्य नमूना स्पष्ट रूप से अपार नमूना से अलग किया जाता है जहां एक द्विआधारी प्रतिक्रिया, अपनाने के लिए मनाया. एक उदाहरण प्रतिनिधि परिणाम (चित्रा 4) में प्रदान की जाती है. इस मामले में, पिघलने तापमान की फिटिंग कश्मीर डी के लिए एक अच्छी फिट प्रदान नहीं करता है.
- प्रोटीन थर्मल शिफ्ट सॉफ्टवेयर से कच्चे डेटा उत्पादन निर्यात करें. प्रत्येक तापमान बिंदु के लिए, शून्य ligand के लिए मतलब प्रतिदीप्ति, और उच्चतम ligand सांद्रता की गणना. इन के बगल में प्रत्येक डेटा बिंदु से परिणाम सारणीबद्ध.
नोट: यहां बनाया त्रुटि सज्जित पिघलने तापमान में त्रुटि की तुलना में कम है. - SPSS सांख्यिकीय पैकेज खोलें. SPSS में एक डेटा खिड़की करने के लिए एक प्रयोग के लिए तापमान, दो मतलब डेटासेट, और डेटा कॉपी. चर टैब में, "कम" के रूप में कोई ligand के लिए मतलब डाटासेट, और "उच्च" के रूप में उच्चतम ligand एकाग्रता के लिए मतलब डाटासेट सेट.
- उपलब्ध वाक्यविन्यास फाइल डाउनलोडऑनलाइन पर नि पर: // www.exeter.ac.uk/biosciences/capsular . "भागो → भागो सभी" चुनें.
- प्रासंगिक ligand सांद्रता के साथ, एक नई Excel कार्यपुस्तिका के अनुपात बाध्य परिणामों की प्रतिलिपि.
- GraphPad सॉफ्टवेयर खोलें, और एक XY टेबल बनाए. Ligand सांद्रता और तापमान परिणाम पिघलने के लिए वाई स्तंभ के लिए एक्स स्तंभ का उपयोग, डेटा दर्ज करें. विश्लेषण टैब में, "परिवर्तन विश्लेषण पैरामीटर" का चयन करें. , सही मॉडल दर्ज "नया" का चयन करें, और "नया समीकरण बनाने के लिए". "पिघलने तापमान में द्विआधारी बदलाव का विश्लेषण" के रूप में सूचीबद्ध तालिका 3 में दी समीकरण, लिखें.
- "प्रारंभिक मान के लिए नियम" बॉक्स का चयन करें, और तालिका 3 में विस्तृत प्रारंभिक मूल्यों के लिए नियमों को दर्ज करें. "के लिए लगातार बराबर" के रूप में, पैरामीटर पी विवश और लिगा के रूप में एक ही इकाइयों में (प्रोटीन की अंतिम एकाग्रता दर्जND) में दी गई है.
नोट: खंड 3 में प्रोटोकॉल के लिए इन बक्सों को पूरा करने के उदाहरण चित्रा 1C, डी में दिखाया जाता है. - एक अच्छी फिट है, तो परिणाम अनंत ligand एकाग्रता में अपेक्षित परिणाम के लिए extrapolating द्वारा सुधार किया जा सकता है. प्रत्येक ligand एकाग्रता पर बाध्य अनुपात की मॉडल से, ligand एकाग्रता के उच्चतम मूल्य के लिए मूल्य की जांच. इस 0.99 या अधिक है, तो आगे के विश्लेषण के परिणामों में सुधार की संभावना नहीं है.
- अनुपात 0.99 से कम है, तो एक अतिरिक्त कदम उच्चतम ligand एकाग्रता नमूने में अपार प्रोटीन के प्रभाव के लिए सही करने के लिए आवश्यक है. कदम 5.2, (एक अलग सेल में इस्तेमाल किया जा सकता है, और आर 2 तालिका 3 में समीकरण में उचित जगह) सेल R2 में (कदम 5.7 से) उच्चतम ligand एकाग्रता बिंदु पर बाध्य ligand के अनुपात में लिखें. उच्चतम ligand एकाग्रता परिणाम का मतलब के बाद एक अतिरिक्त स्तंभ बनाएँ. एफआइआर मेंटी सेल, "ligand एकाग्रता को अनंत एक्सट्रपलेशन" के रूप में 3 तालिका में सूचीबद्ध समीकरण की नकल. इस कॉलम में शेष कोशिकाओं को इस फार्मूले की नकल करें.
नोट: इस गणना उच्चतम ligand एकाग्रता में अपार प्रोटीन के प्रभाव को हटा. ligand मुक्त प्रोटीन और उच्चतम ligand एकाग्रता के बीच अंतर प्रत्येक तापमान बिंदु पर पूरी तरह से बाध्य और अपार प्रोटीन राज्यों के बीच होने की उम्मीद है अंतर प्रदान करने के लिए उच्चतम ligand एकाग्रता पर बाध्य अनुपात की पारस्परिक से गुणा किया जाता है. इस अंतर को जोड़ा या पूरी तरह ligand बाध्य प्रोटीन के लिए उम्मीद की प्रतिदीप्ति देने के लिए अपार राज्य से घटाया जाता है. - इस नए स्तंभ के साथ SPSS datasheet में अधिकतम ligand एकाग्रता के लिए स्तंभ बदलें, और डेटा फिटिंग दोहराएँ.
नोट: - मॉडल अधिकतम ligand concentrati पर बाध्य अनुपात में एक और महत्वपूर्ण परिवर्तन का सुझाव है कि अगर 5.9 दोहराया जा करना पड़ सकता है 5.7 कदम(यदि यह मामला है, यह शायद शामिल एक उच्च ligand एकाग्रता बिंदु के साथ प्रयोग को दोहराने के लिए आदर्श होगा) पर. - प्रोटीन एक द्विआधारी पारी और प्रदर्शित सहकारी व्यवहार से पता चलता है जहां मामलों में, समीकरण कदम 4.1 से उन लोगों के साथ प्रतिस्थापित किया जाना चाहिए कदम 5.5 में सुझाव दिया. "ऊपर" और "नीचे" मापदंडों क्रमशः 1 और 0 से प्रतिस्थापित किया जाना चाहिए.
- Reproducibility सुनिश्चित करने के लिए कम से कम दो बार (कदम 2.12 देखें) प्रयोग दोहराने.
Representative Results
इस विधि के लिए एक उत्कृष्ट परीक्षण सब्सट्रेट hexokinase है. यह आसानी से व्यावसायिक रूप से उपलब्ध किया जा रहा है, और सबसे प्रयोगशालाओं में पाया, और जो परख में स्पष्ट, प्रतिलिपि प्रस्तुत करने योग्य परिणाम प्रदान कर रहे हैं कि दो substrates होने के फायदे हैं. एक प्रारंभिक एकाग्रता स्क्रीन (प्रोटोकॉल 1), hexokinase और ग्लूकोज (2A चित्रा) का उपयोग करते हुए, संभावना कश्मीर डी 0.2 1.7 मिमी रेंज में होगा कि पता चलता है. इसलिए, एक बड़ी स्क्रीन (प्रोटोकॉल 2) तालिका 4 परिणाम (चित्रा 2B) में दिखाया गया सांद्रता का उपयोग, प्रदर्शन किया गया था एकल साइट ligand बाध्यकारी समीकरण के लिए एक अच्छी फिट दिखाने (प्रोटोकॉल खंड 3.3) [9], और दिया एक कश्मीर 1.2 ± 0.1 मिमी की डी.
ख्यात heptose-guanyl ट्रांस्फ़्रेज़ WcbM 19,20 जीटीपी (चित्रा 3) के लिए बाध्य पर एक मजबूत थर्मल पारी से पता चलता है. एक प्रारंभिक स्क्रीन सुझाव दिया कि कश्मीरडी करीब 100 माइक्रोन की रेंज में होगा. . इसलिए, एक पूर्ण स्क्रीन 3.3 समीकरण के परिणामों की फिटिंग 5 तालिका में दिखाया सांद्रता का उपयोग कर, की स्थापना एक उचित फिट (0.981 के आर 2; 3B चित्रा) से पता चला था .However, डेटा और के बीच एक स्पष्ट अंतर नहीं है मॉडल, एक अलग समीकरण की जरूरत है कि सुझाव. WcbM अनुक्रम के साथ प्रोटीन डाटाबैंक 21 की खोज की जा रही संरचनाओं फार्म dimers निर्धारित किया गया है जिसके लिए निकटतम homologues दिखाया. डेटा इसलिए, सहकारी अनुक्रमिक, और दो ligands (प्रोटोकॉल 4) के बंधन स्वतंत्र के लिए तीन समीकरणों का उपयोग कर विश्लेषण किया गया. अनुक्रमिक और स्वतंत्र बाध्यकारी मॉडल दोनों 0.992 के एक अनुसंधान 2 मूल्य और 0.480 और 0.461 के Sy.x दिया जबकि एक सहकारी मॉडल के लिए फिटिंग के आँकड़े, एक आर 2 .998 के मूल्य और 0.215 से बच (Sy.x) का मानक विचलन दिया क्रमशः. इस मॉडल को पता चलता है किसहकारी मॉडल डेटा के लिए सबसे अच्छा फिट था दे: यहाँ, 230 ± 10 माइक्रोन से एक कश्मीर साढ़े मनाया गया, 0.52 ± 0.02 (चित्रा -3 सी) के एक एन मूल्य के साथ. इस बाइंडिंग के लिए एक नकारात्मक cooperativity संकेत दिया. कश्मीर डी के लिए इकाइयों बल्कि असंतोषजनक माइक्रोन 0.52 होगा के रूप में एक कश्मीर साढ़े, बल्कि कश्मीर d से इस मामले में इस्तेमाल किया गया था कि ध्यान दें.
ख्यात सकल घरेलू उत्पाद 6 डिओक्सी-β-डी Manno -heptopyranose 2 -acetylase हे, WcbI 22, अंतर स्कैनिंग fluorimetry में एक नहीं बल्कि असामान्य परिणाम से पता चलता है. किसी भी ligands के अभाव में, यह एक स्पष्ट और सरल विकृतीकरण (चित्रा -4 ए) से पता चलता है. प्रोटोकॉल में वर्णित के रूप में coenzyme एक (सीओए) DSF का उपयोग कर इस प्रोटीन की एक ligand, और इस साथी के लिए प्रोटीन की समानता के रूप में पहचान की थी जांच की गई. सीओए की उच्च सांद्रता, एक मजबूत है की उपस्थिति मेंएक उच्च तापमान को hift 15 डिग्री सेल्सियस तापमान के पिघलने में एक परिवर्तन के साथ मनाया जाता है. हालांकि, मध्यवर्ती सांद्रता में, बल्कि एक मध्यवर्ती पिघलने के तापमान पर एक monophasic पिघलने के लिए एक बदलाव से, WcbI प्रोटीन ligand मुक्त तापमान, या पूरी तरह से बाध्य पिघलने तापमान (चित्रा -4 ए) या तो पिघल प्रदर्शित होने के साथ, एक Biphasic पिघलने से पता चला . उच्च तापमान (चित्रा 4 बी) में पिघल कि अनुपात में वृद्धि सब्सट्रेट सांद्रता में वृद्धि के साथ, एक खुराक निर्भर तरीके में बदल दो प्रजातियों का अनुपात. इन आंकड़ों का प्रत्यक्ष विश्लेषण चुनौतीपूर्ण था: व्युत्पन्न तरीकों दो पिघलने की घटनाओं से होने वाली थे, लेकिन बढ़ती ligand एकाग्रता के साथ एक परिवर्तन का प्रदर्शन करने में सहायता नहीं था कि प्रकाश डाला whilst बोल्ट्जमान समीकरण को ढाले, बहुत गरीब फिट बैठता दिया.
इन आंकड़ों का विश्लेषण करने के लिए एक कम पारंपरिक दृष्टिकोण इसलिए (प्रोटोकॉल 5) को अपनाया गया था. प्रतिदीप्ति डीligand के बिना और उच्चतम ligand एकाग्रता में erivative परिणाम अनिवार्य रूप से कम पिघलने के तापमान में सभी प्रोटीन, या उच्च तापमान के पिघलने राज्य का प्रतिनिधित्व के रूप में लिया गया. शेष व्युत्पन्न डेटा एकता (चित्रा 4C) को अभिव्यक्त अनुपात के साथ, इन दो राज्यों में से प्रत्येक के अनुपात की राशि के रूप में प्रत्येक बिंदु पर लगाया गया था. प्राप्त आंकड़ों तो पहले की तरह ही समीकरण का उपयोग कर, एक स्पष्ट कश्मीर डी प्राप्त करने के लिए पहले की तरह फिट थे. यह "उच्च" ligand बिंदु केवल 95% ligand बाध्य होने की संभावना है कि प्रकाश डाला. डेटा तो एक 100% बाध्य प्रोटीन के लिए परिणाम की भविष्यवाणी करने के लिए extrapolated थे, और डेटा 58 ± 2 माइक्रोन का एक स्पष्ट कश्मीर डी देने के लिए दोहराया फिटिंग. इस बाइंडिंग मॉडल (चित्रा 4D) को प्रयोगात्मक परिणामों के एक उत्कृष्ट फिट प्रदान की.
के लिए: सामग्री चौड़ाई = "5in" src = "/ फ़ाइलें / ftp_upload / 51809 / 51809fig1highres.jpg" चौड़ाई = "500" />
प्रयोग सेट अप और विश्लेषण के 1 उदाहरण चित्रा. (ए) एक थर्मल विकृतीकरण प्रोफाइल की उम्मीद है और आकार का उदाहरण (खमीर hexokinase के लिए डेटा से ली गई है). कच्चे डेटा की विशेषता आकार एक उथले गिरावट के बाद एक अधिकतम करने के लिए प्रतिदीप्ति में एक प्रगतिशील वृद्धि, (9 में अधिक विस्तार से चर्चा की) से पता चलता है. इस प्रतिदीप्ति के पहले व्युत्पन्न में एक भी पीक के साथ है. GraphPad में डाटा एंट्री का (बी) उदाहरण. Ligand एकाग्रता एक्स अक्ष पर दिया, और वाई अक्ष पर पिघलने तापमान में मनाया जाता है. GraphPad में समीकरण परिभाषा (सी) उदाहरण. (डी) उदाहरण सही ढंग से, और प्रोटीन एकाग्रता फिक्सिंग के चर की प्रारंभिक मूल्यों की स्थापना की, हदबंदी निरंतर की सही दृढ़ संकल्प कर सकें.एम / फ़ाइलें / ftp_upload / 51809 / 51809fig1highres.jpg "लक्ष्य =" _blank "> इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें.
. अंतर स्कैनिंग fluorimetry द्वारा मापा ग्लूकोज के साथ hexokinase चित्रा 2 इंटरेक्शन (ए) ग्लूकोज सांद्रता की एक विस्तृत श्रृंखला के परीक्षण के एक प्रारंभिक प्रयोग कश्मीर डी 0.2 की रेंज में होने की संभावना है पता चलता है कि -. 1.7 मिमी (बी) एक विस्तृत प्रयोग, ग्लूकोज की 16 सांद्रता परीक्षण, 1.12 ± 0.05 मिमी के रूप में स्पष्ट कश्मीर डी के निर्धारण की अनुमति देता है. डेटा (35.4 ± 0.2 डिग्री सेल्सियस और 49.3 ± 0.5 डिग्री सेल्सियस क्रमशः के लिए फिटिंग के नीचे (T1) और शीर्ष (टी 2) तापमान के साथ) एक ही बाध्यकारी घटना के लिए मॉडल के लिए बहुत अच्छी तरह से फिट बैठता है. ध्यान दें किइन आंकड़ों में 10 मिमी 2 MgCl की उपस्थिति में एकत्र किए गए थे. इन छवियों GraphPad का उपयोग कर तैयार किया गया. इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें.
जीटीपी साथ WcbM की चित्रा 3 इंटरेक्शन एक विरोधी सहकारी बंधन का पता चलता है. (ए) जीटीपी सांद्रता की एक विस्तृत श्रृंखला के परीक्षण के एक प्रारंभिक प्रयोग कश्मीर डी 200 की रेंज में होने की संभावना है पता चलता है कि -. 500 माइक्रोन जीटीपी के 16 सांद्रता परीक्षण (बी) एक विस्तृत प्रयोग, स्पष्ट करने के लिए एक मूल्य का सुझाव 120 ± 20 माइक्रोन से कश्मीर डी. हालांकि, एक लघुगणकीय पैमाने एक्स अक्ष के लिए प्रयोग किया जाता है, जब एक महत्वपूर्ण discre हैमॉडल और डेटा के बीच pancy. एक सहकारी मॉडल के साथ एक ही डेटा (सी) विश्लेषण एक सरल सहकारी मॉडल का उपयोग किया जाता है, जहां डेटा के लिए एक उत्कृष्ट फिट दिखाता है. इधर, एक कश्मीर 230 ± 20 माइक्रोन से साढ़े (क्रमशः 69.63 ± 0.06 डिग्री सेल्सियस और 79.9 ± 0.1 डिग्री सेल्सियस तक फिटिंग के नीचे (T1) और शीर्ष (टी 2) तापमान के साथ) cooperativity गुणांक n = 0.52 ± 0.02 के साथ, निर्धारित किया गया था. WcbM dimeric प्रतीत होता है, इस एंजाइम अपने जीटीपी के लिए बाध्य करने में पूरी तरह से anticooperative है कि निकलता है. इन छवियों GraphPad का उपयोग कर तैयार किया गया. इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें.
चित्रा 4 WcbI एक Biphasic पिघलने पैटर्न से पता चलता हैइसके ligand coenzyme एक (सीओए) की उपस्थिति में. (ए) WcbI, ligand (नीला) के अभाव में, एक सरल monophasic पिघलने पैटर्न से पता चलता है. उच्च ligand सांद्रता (1 मिमी, ग्रीन लाइन) में, एक समान पैटर्न मनाया जाता है. हालांकि, मध्यवर्ती ligand सांद्रता में. (60 माइक्रोन, लाल रेखा), दो अलग पिघलने चोटियों, ligand मुक्त और ligand बाध्य राज्यों को इसी मनाया जाता है (बी) चोटियों के दो सेट के बीच संक्रमण खुराक पर निर्भर पूरा भर है सांद्रता की सीमा होती है. ligand स्वतंत्र और उच्च ligand परिणाम के अनुपात के रूप में की राशि Biphasic पिघलने की (सी) मॉडलिंग (लाल रेखा के साथ तुलना में धराशायी बैंगनी लाइन) एक डेटा के लिए अच्छा फिट देता है. इस फिट पूर्ण अधिभोग (धराशायी नीली रेखा) से (मॉडल से पता चलता है जहां ~ 95% अधिभोग) उच्च ligand एकाग्रता के लिए मनाया परिणाम extrapolating से सुधार हुआ है. (डी) कोए थानेदार के लिए बाध्य WcbI के अनुपात के लिए प्राप्त डेटा WS 58 ± 2 माइक्रोन से एक कश्मीर डी के साथ एक सरल बंधन मॉडल, के लिए एक उत्कृष्ट फिट (इन आंकड़ों परिणामों के पहले सेट के आधार पर दूसरे दिन के लिए चुना थोड़ा अलग ligand सांद्रता के साथ, दो अलग अलग दिनों पर एकत्र आंकड़ों का प्रतिनिधित्व करते हैं). पैनलों. - GraphPad का उपयोग (ए सी) एक्सेल का उपयोग कर तैयार है, और पैनल (डी) थे इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें.
प्रारंभिक प्रयोगों के लिए तालिका 1 नुस्खा.
| अभिकर्मक | मिश्रण में वॉल्यूम (μl) |
| प्रोटीन | 0.11 मिलीग्राम / एमएल के अंतिम एकाग्रता |
| 0.3 | |
| 0.5 एम HEPES पीएच 7.0 | 3.7 |
| 5 एम NaCl | 5.6 |
| जल | 180 μl के लिए |
इस प्रोटोकॉल खंड 1 इस बफर मिश्रण सामान्य प्रोटीन के लिए उपयुक्त है के रूप में वर्णित, कश्मीर डी के एक अनुमान प्रदान करने के लिए एक प्रारंभिक स्काउटिंग प्रयोग के लिए प्रोटीन का पता लगाने अभिकर्मक और बफर के "मास्टर मिश्रण" का वर्णन है. पिछले परिणाम अन्य बफ़र्स इस्तेमाल किया जाना चाहिए सुझाव है कि कहां, इन प्रतिस्थापित किया जाना चाहिए. प्रोटीन शेयर एक कम एकाग्रता (यानी, कम से कम 0.3 मिलीग्राम / एमएल) पर है, तो उसे अतिरिक्त बफर की मात्रा को कम करने के लिए आवश्यक हो सकता है प्रोटीन के नमूने में पहले से ही मौजूद बफर के लिए क्षतिपूर्ति की गयी.
| अभिकर्मक | मिश्रण में वॉल्यूम (μl) |
| प्रोटीन | 0.11 मिलीग्राम / एमएल के अंतिम एकाग्रता |
| 5,000X SYPRO ऑरेंज | 1.78 |
| 0.5 एम HEPES पीएच 7.0 | 22.2 |
| 5 एम NaCl | 33.3 |
| जल | 180 μl के लिए |
इस प्रोटीन का पता लगाने अभिकर्मक, और बी का "मास्टर मिश्रण" का वर्णनuffer एक प्रोटीन नमूना के लिए कश्मीर डी के एक पूर्ण निर्धारण के लिए, प्रोटोकॉल खंड 2 में वर्णित के रूप में इस बफर मिश्रण सामान्य प्रोटीन के लिए उपयुक्त है. पिछले परिणाम अन्य बफ़र्स इस्तेमाल किया जाना चाहिए सुझाव है कि कहां, इन प्रतिस्थापित किया जाना चाहिए. प्रोटीन शेयर एक कम एकाग्रता (यानी, कम से कम 0.3 मिलीग्राम / एमएल) पर है, तो उसे अतिरिक्त बफर की मात्रा को कम करने के लिए आवश्यक हो सकता है प्रोटीन के नमूने में पहले से ही मौजूद बफर के लिए क्षतिपूर्ति की गयी.
3 तालिका समीकरण और डेटा विश्लेषण के लिए मानकों.
| प्रयोगात्मक प्रोटोकॉल में कदम | समीकरण आवश्यक | पैरामीटरों की जरूरत | चर और मापदंडों का विवरण |
| 3.3 | </ TD> | ||
| बाध्यकारी एक साइट ligand | वाई = निचला + ((ऊपर से नीचे) * (1 - ((पी डी एक्स + sqrt (((पी एक्स + K घ) ^ 2) - (4 * पी * एक्स))) / (2 * पी )))) | पी: प्रोटीन एकाग्रता. केडी: निरंतर हदबंदी. पी और केडी ligand सांद्रता के लिए इस्तेमाल किया गया है कि एक ही इकाइयों में दिया जाता है. ऊपर, नीचे: अनंत ligand एकाग्रता और क्रमशः कोई ligand एकाग्रता में पिघलने तापमान. | |
| 3.4 | नीचे = * YMIN | YMIN: (इस मामले में सबसे कम प्रयोगात्मक प्रोटीन टीएम), वाई का न्यूनतम मूल्य | |
| शीर्ष = * YMAX YMAX: वाई के अधिकतम मूल्य (उच्चतम प्रयोगात्मक प्रोटीन टीएम) | |||
| कश्मीर डी = * एक्स YMID पर | YMID: YMIN और YMAX का मतलब से मेल खाती है कि वाई के लिए मूल्य. एक्स (यहाँ, प्रासंगिक ligand एकाग्रता) इसी एक्स मूल्य है | ||
| पी = (प्रारंभिक मूल्य, फिट होने के लिए) | |||
| 4.1 | |||
| सरल सहकारी मॉडल | वाई = निचला + ((ऊपर से नीचे) * (((एक्स / केडी) ^ एन) / (1 + ((एक्स / केडी) ^ एन)))) | N: एचबीमार गुणांक. इस प्रोटीन की cooperativity, या अन्य जैव रासायनिक गुणों का वर्णन है, और जरूरी प्रोटीन में ligand बाध्यकारी साइटों की संख्या का अनुमान नहीं है. एक से एक पहाड़ी गुणांक कोई cooperativity का प्रतिनिधित्व करता है; एक से कम मूल्यों नकारात्मक cooperativity संकेत मिलता है, और एक से अधिक सकारात्मक cooperativity मूल्यों. | |
| नीचे = * YMIN | |||
| शीर्ष = * YMAX | |||
| कश्मीर डी = * एक्स YMID पर | |||
| पी = (प्रारंभिक मूल्य, फिट होने के लिए ) | |||
| n = (प्रारंभिक मूल्य, फिट होने के लिए) | |||
| दो ligands के बंधन अनुक्रमिक | वाई = निचला + ((ऊपर से नीचे) * ((एक्स ^ 2) / (कश्मीर डी * K2)) / (1 + (एक्स / कश्मीर घ) ((एक्स ^ 2) / (कश्मीर डी * K2))) ) | K2: दूसरे बाध्यकारी घटना के लिए निरंतर हदबंदी. | |
| नीचे = * YMIN | |||
| शीर्ष = * YMAX | |||
| डीटीएच: 123px "> कश्मीर डी = * एक्स YMID पर | |||
| YMID पर K2 = * एक्स | |||
| पी = (प्रारंभिक मूल्य, फिट होने के लिए) | |||
| स्वतंत्र दो ligands के बंधन | वाई = निचला + ((ऊपर से नीचे) * ((एक्स ^ 2) / (कश्मीर डी * K2)) / (1 + (2 * एक्स / कश्मीर घ) ((एक्स ^ 2) / (कश्मीर डी * K2) ))) | ||
| नीचे = * YMIN | |||
| H: 123px "> शीर्ष = * YMAX | |||
| कश्मीर डी = * एक्स YMID पर | |||
| YMID पर K2 = * एक्स | |||
| पी = (प्रारंभिक मूल्य, फिट होने के लिए) | |||
| 5.5 | |||
| पिघलने के तापमान में द्विआधारी बदलाव का विश्लेषण | वाई = 1 - ((पी डी एक्स + sqrt (((पी एक्स + K घ) ^ 2) - (4 * पी * एक्स))) / (2 * पी)) | 23px; ">||
| नीचे = * YMIN | |||
| शीर्ष = * YMAX | |||
| कश्मीर डी = * एक्स YMID पर | |||
| पी = (प्रारंभिक मूल्य, फिट होने के लिए) | |||
| 5.8 | |||
| अनंत ligand एकाग्रता के लिए एक्सट्रपलेशन | (सी 2 - ((1 $ आर $ 2) * बी 2)) / $ आर $ 2 | बी 2: कोई ligand के साथ परिणाम युक्त सेल. सी 2: अधिकतम ligand के साथ परिणाम युक्त सेल. $ आर $ 2: अधिकतम ligand एकाग्रता पर बाध्य अनुपात युक्त सेल. |
4, 3 चरणों और 5 विश्लेषण सॉफ्टवेयर में विस्तृत समीकरणों के अलावा, और डेटा विश्लेषण के लिए पैरामीटर शुरू करने की सटीक परिभाषा की आवश्यकता होती है. प्रत्येक प्रासंगिक कदम के लिए समीकरण मापदंडों का सही चयन के साथ दिखाया जाता है. चर और मापदंडों के अर्थ की एक व्याख्या संदर्भ के लिए प्रदान की जाती है.
टेबल ग्लूकोज के साथ hexokinase की बातचीत की जांच के लिए 4 सांद्रता.
| नमूना बिंदु | Ligand (glucosई) एकाग्रता (मिमी) |
| 1 | 0 |
| 2 | 0.001 |
| 3 | 0,005 |
| 4 | 0.01 |
| 5 | 0.03 |
| 6 | 0.1 |
| 7 | 0.3 |
| 8 | 0.4 |
| 9 | 0.7 |
| 10 | 1.1 |
| 11 | 2.1 |
| 12 | 3.7 |
| 13 | 5.3 |
| 14 | 7 |
| 15 | 9 |
| 16 | 11 |
प्रोटोकॉल में वर्णित के रूप में मैग्नीशियम एक ज्ञात cofactor के रूप में नवोदित खमीर से Hexokinase 10 मिमी 2 MgCl के साथ पूरक, मास्टर मिश्रण करने के लिए जोड़ा गया था. कश्मीर डी के प्रारंभिक अनुमान 0.5 और 2 मिमी के बीच था. प्रयोगों ग्लूकोज का संकेत अंतिम सांद्रता प्रदान करने के लिए स्थापित किया गया था.
टेबल सकल घरेलू उत्पाद के साथ WcbM की बातचीत की जांच के लिए 5 सांद्रता.
| नमूना बिंदु | Ligand (जीटीपी) एकाग्रता (माइक्रोन) |
| 1 | 0 |
| 2 | 0.5 |
| 3 | 1 |
| 4 | 5 |
| 5 | 10 |
| 6 | 25 |
| 7 | 50 |
| 8 | 100 |
| 9 | 250 |
| 10 | 8px "> 500|
| 11 | 1000 |
| 12 | 2500 |
| 13 | 5000 |
| 14 | 7500 |
| 15 | 10,000 |
| 16 | 20,000 |
प्रोटोकॉल में वर्णित के रूप में Burkholderia pseudomallei से WcbM मास्टर मिश्रण करने के लिए जोड़ा गया था. कश्मीर डी के प्रारंभिक अनुमान करीब 100 माइक्रोन था. प्रयोगों से ऊपर और कश्मीर डी नीचे परिमाण के कम से कम दो आदेशों को कवर करने के लिए लक्ष्य, जीटीपी का संकेत दिया अंतिम सांद्रता प्रदान करने के लिए स्थापित किया गया था.
Discussion
अंतर स्कैनिंग fluorimetry प्रोटीन निस्र्पक, और संभावित प्रोटीन ligands पहचान करने के लिए एक मजबूत और बहुमुखी विधि के रूप में अपनी शक्ति का प्रदर्शन किया है. (विशेष रूप से कम अच्छी तरह से वित्तपोषित प्रयोगशालाओं में) प्रोटीन स्थिरीकरण, दवाओं की खोज में तेजी लाने और क्रिस्टलीकरण 10,23-25 में अच्छी तरह से प्रलेखित सफलताओं यह यौगिकों की प्रारंभिक जांच के लिए एक आकर्षक विधि बना दिया है. प्रोटीन के लिए जोड़ा यौगिकों स्पष्ट पिघलने तापमान 7,9 में एक स्पष्ट खुराक निर्भर वृद्धि दिखा. हालांकि, उनकी आत्मीयता के लिए यौगिकों रैंकिंग में सहायता करने के लिए स्पष्ट बाध्यकारी स्थिरांक निर्धारित करने के लिए इन प्रयोगों से परिणाम का उपयोग करने के लिए कुछ प्रयास किए गए हैं. यहाँ, हम व्यवस्थित एक ligand की उपस्थिति में प्रोटीन के लिए एक स्पष्ट हदबंदी निरंतर निर्धारित करने के लिए एक विधि प्रस्तुत करते हैं.
यहाँ प्रस्तुत परिणामों DSF तेजी और मजबूती के लिए हदबंदी निरंतर का अनुमान प्रदान कर सकते हैं कि का प्रदर्शनएक प्रोटीन ligand संयोजन. मनाया डेटा मापदंडों की संभावना मूल्य के बारे में धारणा बना आवश्यकता के बिना कश्मीर डी की एक तेजी से दृढ़ संकल्प प्रदान करने के लिए व्यावसायिक रूप से उपलब्ध उपकरणों के साथ छेड़छाड़ कर सकते हैं. विधि आवश्यक प्रोटीन और समय दोनों में किफ़ायती होने के कुछ तुलनीय तरीकों पर एक महत्वपूर्ण लाभ है. यहाँ वर्णित प्रयोग प्रयोग प्रति (तीन प्रतियों में दोहराया प्रयोगों के लिए लगभग 0.4 मिलीग्राम) प्रोटीन की 0.13 मिलीग्राम भस्म हो जाएगा. यह एक औसत 40 केडीए प्रोटीन के साथ एक ही प्रयोग एक समान राशि की खपत होगी, जहां इज़ोटेर्माल अनुमापन उष्मामिति (आईटीसी), के साथ कृपापूर्वक तुलना. इस प्रोटोकॉल के लिए आवश्यक प्रयोगों का पूरा सेट प्रयोगों का एक सेट के लिए, तैयारी सहित लगभग 4 घंटा, भस्म हो जाएगा. फिर, इस तरह के शक्तिशाली whilst अक्सर सबसे अच्छा डेटा प्राप्त करने के लिए काफी अधिक उपयोग की आवश्यकता होती है जो आईटीसी या सतह plasmon अनुनाद, जैसे तरीकों की तुलना में काफी तेज होने की संभावना है.
हमारे परिणाम को ध्यान से कच्चे डेटा की जांच के लिए एक आवश्यकता बनी हुई है दिखाना है कि, इन आंकड़ों के फिट पिघलने के तापमान को निर्धारित करने के लिए, और पिघलने तापमान डेटा के फिट हदबंदी निरंतर निर्धारित करने के लिए. एक पहली चुनौती प्रोटीन पिघलने में उत्पादित कच्चे डेटा के आकार है. कुछ मामलों में, आकार चित्रा 1 ए में मनाया कि करने के लिए लगभग नहीं हो सकता है. आम मुद्दों बंधन ligand पर कम तापमान परिवर्तन, उच्च पृष्ठभूमि प्रतिदीप्ति, और तापमान में असामान्य कई बदलाव शामिल हैं. कम तापमान बदलाव ligands के एक नंबर बंधन पर देखा जाता है. इस विधि के लिए, सबसे महत्वपूर्ण पैरामीटर तापमान पारी की तुलना में, टी एम माप में त्रुटि है. तीन प्रतियों माप के मानक विचलन अबाध और पूरी तरह से बाध्य प्रोटीन के बीच तापमान के पिघलने पारी के 10% से अधिक नहीं है जब डेटा आमतौर पर काफी अच्छी तरह से लगाया जा सकता है. हमारा अनुभव है कि जहां इस तरह के अस्थायी हैerature पारियों व्यक्तिगत डेटा अंक बेहद सटीक हैं अगर केवल 2 डिग्री सेल्सियस, यह डेटा फिटिंग के लिए पर्याप्त हो सकता है. एक दूसरा मुद्दा असामान्य रूप से घटता आकार का है. बाध्यकारी ligand प्रोटीन के तरीके खुलासा प्रभावित करता है ये अक्सर, मुक्त प्रोटीन और ligand बाध्य रूपों के बीच मतभेद है. इन मामलों में, उपयोगकर्ता डेटा पिघलने तापमान और पृथक्करण निरंतर का निर्धारण करने के लिए प्रयोग की जाने वाली मॉडल का उचित ध्यान के साथ इस्तेमाल किया जा सकता है कि क्या विचार करना चाहिए. एक अन्य आम मुद्दा प्रोटीन के लिए एक cofactor के अलावा (जैसे, hexokinase साथ हमारे उदाहरण में 2 MgCl) सबसे विश्वसनीय आंकड़े प्राप्त करने के लिए आवश्यक है. हमारा अनुभव प्रारंभिक रीडिंग लेने के लिए सबसे अच्छा परिणाम प्राप्त करने के लिए आवश्यक है के स्तर पर प्रयोग में सभी संभावना कारकों की है कि सावधानी से विचार किया गया है. इसके अलावा, वैकल्पिक सैद्धांतिक उपचार इन आंकड़ों 15,17 की सुविधाओं प्रकट कर सकते हैं. अंत में, यह है कि सी कुछ प्रोटीन के लिए असामान्य नहीं हैontain natively उच्च पृष्ठभूमि प्रतिदीप्ति दिखाने के लिए हाइड्रोफोबिक क्षेत्रों अवगत कराया. बड़े पैमाने पर कहीं 6,9 समीक्षा की गई है जो इन समस्याओं के समाधान के एक नंबर रहे हैं.
विशेष रूप से, उपयोगकर्ता (जैसे, चित्रा 4), और डेरिवेटिव के उपयोग के मामले में, कई पिघला देता मॉडलिंग की जाना चाहिए कि क्या बोल्ट्जमान या व्युत्पन्न मॉडल का उपयोग करने के लिए है कि क्या विचार करना चाहिए. खुलासा थर्मल मॉडलिंग के दो तरीके बोल्ट्जमान विधि खुलासा वक्र करने के लिए एक नियमित sigmoidal आकार संभालने, बोल्ट्जमान समीकरण को प्रयोगात्मक डेटा फिट बैठता है में मतभेद है. इसके विपरीत, व्युत्पन्न विधि प्रत्येक बिंदु (चित्रा 1 ए में कम पैनल) में प्रयोगात्मक डेटा के पहले व्युत्पन्न लेता है, और उच्चतम पहले व्युत्पन्न की बात हो पिघलने तापमान समझता है. 3 डिग्री सेल्सियस - व्युत्पन्न विधि आम तौर पर लगभग 2 द्वारा एक उच्च तापमान के पिघलने देता है. सबसे अधिक प्रोटीन अधिक सुसंगत वापस आ जाएगीदो तरीकों में से एक के लिए परिणाम (यानी, तीन प्रतियों प्रयोगों के लिए तापमान के पिघलने की मानक त्रुटि कम है). यह आमतौर पर अच्छी वक्र खुलासा प्रोटीन का सटीक आकार से संबंधित है, और यह अनुभव से प्रत्येक मामले में सबसे अच्छा तरीका निर्धारित करने के लिए आवश्यक है. व्युत्पन्न मॉडल का उपयोग किया जाता है, यह कई पिघलने की घटनाओं पर विचार करने के लिए भी महत्वपूर्ण है. कुछ डेटा स्पष्ट रूप से कई बदलाव के लिए सबूत दिखाने के लिए, और इन मामलों में परिणाम इन कई पिघलने घटनाओं मॉडलिंग कर रहे हैं अगर व्याख्या करने के लिए आसान हो जाने की संभावना है. इस प्रोटोकॉल के संदर्भ में, यह ligand के अलावा एक प्रोटीन ठीक इसके विपरीत (सबसे thermally कमजोर उपडोमेन स्थिर से, उदाहरण के लिए) एक ही संक्रमण के लिए कई पिघलने संक्रमण होने से पाली, या करने के लिए पैदा कर सकता है कि अक्सर मामला है. इसलिए हम कच्चे डेटा का उपयोग करने के लिए सबसे अच्छा होगा जो दृष्टिकोण पर विचार करने से पहले एक साथ जांच कर रहे हैं कि वकालत करेंगे.
एम के बादव्यक्तिगत पिघलने तापमान के odelling, आगे मुद्दों प्रोटोकॉल अनुभाग में प्रस्तुत मॉडलों के लिए इन फिटिंग में पैदा कर सकते हैं. यह इस विश्लेषण अक्सर मनाया डेटा और मॉडल के बीच विसंगतियों पर प्रकाश डाला गया के रूप में ध्यान से, एक लघुगणकीय पैमाने का उपयोग हदबंदी निरंतर समीकरण फिट करने के लिए जांच करने के लिए आवश्यक है (ई .g., चित्रा 3). प्राप्त परिणामों को आम तौर पर मजबूत कर रहे हैं, whilst व्याख्या में देखभाल डेटा से बेहतर परिणाम निकालने के लिए अवसर है, और सबसे अर्थ प्रदान करता है.
इन आंकड़ों से उठाया एक विशेष मुद्दे DSF में, cooperativity बताते हैं कि प्रोटीन, या बंधन, कई घटनाओं पर रखा जाना चाहिए कि व्याख्या है. हम तारीख करने के लिए, केवल कई विशिष्ट बंधनकारी घटनाओं (जैसे, WcbM, आकार अपवर्जन क्रोमैटोग्राफी पर एक multimer के रूप में कार्य करता है जो एक जिसका सबसे अच्छा सजात 26 एक multimer है प्रोटीन, और [डेटा नहीं है की संभावना है कि प्रोटीन में इस घटना को देखा हैदिखाया]). यह बिल्कुल स्पष्ट DSF विकृतीकरण में मनाया नकारात्मक cooperativity एंजाइम अंततः नकारात्मक cooperativity दिखा देंगे कि इंगित करता है कि नहीं है: बल्कि, यह तरीकों की एक व्यापक रेंज का उपयोग कर अधिक अच्छी तरह से पता लगाया जाना चाहिए कि जटिल बंधन का एक संकेत हो सकता है. इस तरह के प्रोटीन की अधिक व्यापक अध्ययन रोचक प्रभाव की पहचान करने की संभावना है, हालांकि, कि हमारे लिए सुझाव है.
इस पद्धति का उपयोग हदबंदी निरंतर लिए दिया मूल्यों आम तौर पर इस तरह के इज़ोटेर्माल अनुमापन उष्मामिति और सतह plasmon अनुनाद के रूप में अन्य तरीकों, द्वारा प्रदान की उन के रूप में एक ही क्रम के हैं. हालांकि, मनाया निरपेक्ष मूल्यों इन तरीकों का उपयोग कर मनाया से अक्सर अधिक कर रहे हैं. यह कम से कम आंशिक रूप से हदबंदी निरंतर ligand के साथ प्रोटीन के पिघलने के तापमान पर मनाया जाता है कि इस तथ्य का परिणाम है. यह कश्मीर डी शारीरिक तापमान पर उस से भी आम तौर पर अधिक है. dissociation निरंतर समीकरणों से प्रतिक्रिया के तापमान से संबंधित है:
[1]
[2]
(ग θ मानक संदर्भ एकाग्रता है, जहां Δ जी प्रतिक्रिया के गिब्स मुक्त ऊर्जा परिवर्तन अनुसंधान, आर दाढ़ गैस स्थिर है, Δ एच प्रतिक्रिया में तापीय धारिता परिवर्तन है, और Δ प्रतिक्रिया में एन्ट्रापी परिवर्तन है .)
इस पद्धति के मापने योग्य सीमा में पृथक्करण स्थिरांक साथ प्रतिक्रियाओं आम तौर पर एक नकारात्मक Δ आर जी होगा, और इसलिए समीकरण पर तापमान में वृद्धि के प्रभाव [1] लगातार हदबंदी बढ़ाने के लिए किया जाएगा. दोनों गिब्स मुक्त ऊर्जा का गठन कि Δ एच और Δ शर्तों (समीकरण [2]) temperatur हैंई निर्भर 27, और पृथक्करण निरंतर पर प्रभाव इन तापमान निर्भरता की भयावहता और हस्ताक्षर पर निर्भर करेगा, और जरूरी बातचीत निर्भर हो जाएगा. नतीजतन, यह इस विधि द्वारा निर्धारित पृथक्करण स्थिरांक आरटी पर संचालित है कि तरीकों से निर्धारित उन लोगों से कभी कभी अधिक कर रहे हैं कि अप्रत्याशित नहीं है. तापमान निर्भरता भी, बेशक, शारीरिक तापमान की तुलना में कम तापमान पर हदबंदी निरंतर प्रदान करने के लिए करते हैं जो कई अन्य तरीकों की एक चेतावनी है.
यह आईटीसी के विपरीत, एक लेबल तरीका है कि DSF पद्धति का एक और चेतावनी है. (SYPRO नारंगी) का इस्तेमाल किया फ्लोरोसेंट लेबल हाइड्रोफोबिक है, और इसलिए कुछ मामलों में प्रोटीन के लिए हाइड्रोफोबिक ligands के बंधन के साथ प्रतिस्पर्धा कर सकते हैं. नतीजतन, यह कुछ मामलों में, प्राप्त हदबंदी निरंतर कृत्रिम कारण लेबल के साथ प्रतिस्पर्धा करने के लिए उठाया जाएगा कि संभावना है. हालांकि, विविध ligands की तुलना, (प्राथमिक उपयोग के लिएDSF), मतभेद आत्मीयता से यौगिकों की रैंकिंग को प्रभावित करने के लिए पर्याप्त रूप से महत्वपूर्ण होने की उम्मीद नहीं कर रहे हैं.
इस पद्धति का एक संभावित वापसी प्राप्त किया जा सकता है कि पता लगाने की सीमा है. सिद्धांत रूप में, यह सही प्रोटीन एकाग्रता के निचले से 50% है, और इस श्रेणी में भी मूल्यों संदिग्ध सटीकता के होने की संभावना है कि कश्मीर डी के लिए एक मूल्य को मापने के लिए संभव नहीं होना चाहिए. सीमा के इस अंत में पता लगाने की सीमा प्रोटीन और डाई की सांद्रता कम करने से एक छोटे से बढ़ाया जा सकता है, साधन की संवेदनशीलता प्रोटीन एकाग्रता में और कमी को रोकने जाएगा. इसी तरह, संवेदनशीलता के ऊपरी छोर ligand की घुलनशीलता से निर्धारित किया जाएगा. कश्मीर डी के लिए एक गणितीय मजबूत अनुमान प्राप्त करने के लिए, यह लगभग होने की ligand सांद्रता की आवश्यकता है जो ligand बाध्य रूप में मौजूद प्रोटीन, 90% के साथ डेटा प्राप्त करने के लिए सबसे महत्वपूर्ण हैly दस बार कश्मीर डी (कोई cooperativity संभालने). पता लगाने की सीमा इसलिए जरूरी प्रासंगिक बफर में ligand की घुलनशीलता का दसवां किया जाएगा. इस विधि का पता लगाने की सीमा आमतौर पर प्रोटीन और ligand के आधार पर, मिमी 1 माइक्रोन के बीच और 1 और 100 के बीच लेकर जाएगा कि इसका मतलब है.
अंत में, अंतर स्कैनिंग fluorimetry प्रोटीन की एक विस्तृत श्रृंखला के लिए लागू एक बहुमुखी तकनीक है. यहाँ प्रस्तुत तरीकों का उपयोग कर, यह तेजी से और सस्ते में विभिन्न ligands के लिए एक प्रोटीन की आत्मीयता निर्धारित करने के लिए संभव है. यह विशेष रूप से छोटे प्रयोगशालाओं में, प्रोटीन शुद्धि और स्थिरीकरण में आवेदन, metagenomes से एंजाइमों के समारोह या विशिष्टता elucidating के लिए काफी संभावना है, और दवाओं की खोज में.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| StepOne real time PCR instrument | Life Technologies | 4376357 | DSF can be performed with many other instruments. The StepOne instrument has very convenient software for data analysis. |
| Protein thermal shift software v1.0 | Life Technologies | 4466037 | |
| MicroAmp Fast optical 48-well plates | Life Technologies | 4375816 | |
| Optical sealing tape | Life Technologies | 4375323 | Bio-rad part no. 223-9444 is an alternative supplier |
| U-bottomed 96-well plates | Fisher | 11521943 | |
| SYPRO Orange | Life Technologies | S6650 | For a smaller volume supplier, use Sigma part no. S5692 |
| SPSS statistics version 20 | IBM | Other statistics packages will provide similar functionality | |
| GraphPad Prism 6.02 | GraphPad | Other statistics packages will provide similar functionality | |
| Hand applicator (PA1) | 3M | 75-3454-4264-6 | |
| Hexokinase from Saccharomyces cerevisiae | Sigma-Aldrich | H5000 | |
| Glucose | Fisher scientific | 10141520 |
References
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