Abstract
En lang rekke fremgangsmåter er for tiden tilgjengelige for bestemmelse av dissosiasjonskonstanten mellom et protein og samspill små molekyler. Men de fleste av disse krever tilgang til spesialutstyr, og ofte krever en grad av kompetanse til å effektivt etablere pålitelige eksperimenter og analysere data. Differential scanning fluorimetry (DSF) blir stadig mer brukt som en robust metode for innledende screening av proteiner for å kommunisere små molekyler, enten for å identifisere fysiologiske partnere eller for hit oppdagelse. Denne teknikken har den fordel at den krever bare en PCR-maskin egner seg for kvantitativ PCR, og så egnet instrumentering er tilgjengelig i de fleste institusjoner; et utmerket utvalg av protokoller er allerede tilgjengelig; og det er sterke presedens i litteraturen for flere anvendelser av fremgangsmåten. Tidligere arbeid har foreslått flere måter å beregne dissosiasjonskonstanter fra DSF data, men disse er matematisk krevende. Her, vi Demonstrate en fremgangsmåte for å estimere dissosiasjonskonstanter fra en moderat mengde DSF eksperimentelle data. Disse dataene kan vanligvis samlet og analysert innenfor en enkelt dag. Vi viser hvordan forskjellige modeller kan benyttes til å passe data som er samlet fra enkle bindingsbegivenheter, og hvor samarbeidende binding eller uavhengige bindingsseter er til stede. Til slutt presenterer vi et eksempel på dataanalyse i en sak der standardmodeller ikke gjelder. Disse metodene er illustrert med data samlet inn på kommersielt tilgjengelige kontroll proteiner, og to proteiner fra vår forskningsprogram. Samlet gir vår metode en grei måte for forskere å raskt få ytterligere innsikt i protein-ligand interaksjoner ved hjelp av DSF.
Introduction
Alle proteiner vil binde, med varierende slektskap, til et variert utvalg av andre molekyler fra enkle ioner til andre store makromolekyler. I mange tilfeller, proteiner binder seg til små molekyl partnere som en del av deres normale funksjon (f.eks, en kinase-binding til ATP). Andre interaksjoner kan være urelatert til funksjon, men er nyttige som eksperimentelt verktøy (for eksempel små molekyler som stabiliserer proteiner for å forbedre krystalliseringen lykkes, eller hjelpe med å opprettholde proteiner i løsningen); mens små molekyler som binder til aktive seter og allosteriske områder av proteiner kan opptre som inhibitorer, og så modulere aktiviteten av enzymer.
Det finnes et stort utvalg av teknikker som kan brukes for å bestemme affiniteten av proteiner for partner molekyler. Isoterm titrering kalorimetri 1 er allment sett på som en "gullstandard", som det gir fyldig informasjon om reaksjoner, er etiketten gratis, og har begrenset muligheter for enrtifacts av eksperimentet. Men til tross for nylige forbedringer i følsomheten av instrumentering og automasjon av eksperimentelle oppsettet, er det fortsatt relativt dyrt i form av proteinbehovet, har i beste fall en lav til middels gjennomstrømning, og er best egnet til interaksjoner med moderat til høye affiniteter (10 nM til 100 uM K d) 2. Andre etikett gratis metoder som overflate plasmonresonans eller bilags interferometri 3 tilbyr høyere hastigheter, og har oppnådd følsomheten til å oppdage mindre molekyler så lave som 100 Da. Men store gjennomgangs instrumenter for disse metodene er relativt dyrt, bare kan rettferdiggjøres hvor det vil være en kontinuerlig gjennomstrømning av relevante prosjekter, og så sannsynligvis vil være utilgjengelige for mange akademiske laboratorier.
Differential scanning fluorimetry (DSF, eller thermofluor) ble først beskrevet i 2001 4 som en metode for legemiddelforskning. I denne method, er proteiner inkubert med et fluorescent farvestoff (opprinnelig naftalen-sulfon-fargestoffer ble anvendt), som forandrer sin fluorescens ved å binde seg til de hydrofobe regioner av proteinene. Den protein-dye prøven blir så oppvarmet, og fluorescens overvåkes ved at varmen stiger. Den utfolding av protein, og eksponering av hydrofobe deler av proteinet, gir opphav til et karakteristisk mønster i fluorescens som en funksjon av temperatur (figur 1A). Forsøket kan utføres i små mengder i en hvilken som helst kommersiell kvantitativ PCR instrument, og så i et enkelt eksperiment, kan et stort antall prøver blir testet samtidig (vanligvis 48, 96 eller 384 prøver, avhengig av instrumentets modell). Eksperimenter kan vanligvis utføres i omkring en time, noe som gir mulighet for høy gjennomstrømning analyse av prøvene 5.
Ytterligere forbedringer av metodikken har sett innføringen av fargestoffer med bedre spektrale egenskaper 6,7 8,9. Utvalget av anvendelser av metoden har blitt utvidet, med et særlig fokus på å etablere optimale forhold for utarbeidelse og lagring av proteiner 10, og på å identifisere potensielle bindingspartnere for å hjelpe krystallisering 11. Den relativt høy gjennomstrømning av metoden, relativt lave kostnader i protein (~ 2 pg per reaksjon), og anvendbarhet til å studere svake bindingsmolekyler har gjort DSF et verdifullt verktøy for fragment basert drug design, spesielt i en akademisk sammenheng 12-14.
Til tross for den brede anvendelse av DSF å studere protein-ligand-vekselvirkninger, er det få studier som er beskrevet bestemmelse av dissosiasjonskonstanter fra disse studiene. Imidlertid har disse tendens til å produsere detaljerte ligninger som beskriver utfolding av protein, med mange parametre som må monteres på spredte data, eller i enkelte tilfeller estimated 7,15-17. Disse fremgangsmåter er av spesiell relevans i vanskelige tilfeller, for eksempel tett bindende forbindelser, eller proteiner som viser uvanlige overganger. Imidlertid, i mange laboratorier, disse detaljerte analyser er for tungvint for rutinemessig bruk. Vi vil derfor foreslå alternative behandlinger for ulike scenarier, og vise hvordan disse kan brukes til å passe data som følge av ulike protein-ligand interaksjoner. Vår metode bruker StepOne qPCR instrument, som skreddersydd dataanalyse programvare er tilgjengelig; mens dette gir raskere dataanalyse, kan resultatene fra andre instrumenter bli behandlet ved hjelp av tidligere publiserte metoder 9, og det samme genetisk analyse kan utføres.
Protocol
1. Fastsettelse av en omtrentlig verdi for dissosiasjonskonstanten (dvs. innen en størrelsesorden)
- Forbered blandingen beskrevet i Tabell 1.
- Forbered lagrene av liganden av interesse på det høyeste tilgjengelige konsentrasjon, og deretter ved seks ti gangers fortynning av denne. Der hvor en omtrentlig K d er kjent fra tidligere data, tar sikte på å ha minst to konsentrasjoner over og under K d.
- Delmengde 18 pl av blandingen i åtte brønner i en qPCR plate. Tilsett 2 mL av løsningsmiddel til den første brønnen. Tilsett 2 pl av hvert medlem av liganden fortynningsserie (trinn 1.2) til en brønn hver av de gjenværende syv brønner.
- Plasser en qPCR segl over platen. For å oppnå en god forsegling av platen, å plassere en hånd applikator (se tabeller av spesifikke reagenser) i midten av platen. Glatt ned forseglingen til den ene siden, og deretter gjenta på den andre halvdelen avplate.
- Sentrifuger plate ved 500 x g i to minutter for å fjerne luftbobler.
- Sett platen i en StepOne qPCR instrument. Velg "Melt kurve" alternativet, ROX-filtre, og velger den raske rampehastigheten (dette gir en 2 min pause ved 25 ° C, etterfulgt av en rampe til 99 ° C i løpet av 40 min, og deretter en pause på 2 min). Kjør en termisk denaturering.
MERK: Script-filer for å utføre en kjøring er tilgjengelig elektronisk på http: // www.exeter.ac.uk/biosciences/capsular. - Ved avslutningen av instrumentet løp, klikk på "Analyze"-knappen på skjermen. Lagre resultatfilen.
- Åpne Protein Thermal Shift programvare.
- Opprett en ny studie; i kategorien egenskaper, gir dette et navn, og i kategorien betingelser, detalj ligander.
- Flytte til Experiment kategorien Files, og importere den lagrede resultater filen (XXX.eds), og angi innholdet av hver brønn (mal files er tilgjengelige fra forfatterne).
- Flytt til fanen Analysis, og trykk på "Analyze" knappen.
MERK: Dette vil analysere resultatene. Det er mulig å eksportere resultatene for videre undersøkelser med Excel ved hjelp av kategorien Export. Resultatene blir eksportert i en fane avgrenset format. Det er best å åpne den eksporterte filen i Excel, og umiddelbart spare i Excel-format.
- Kontroller at proteinet i nærvær av løsningsmiddel alene gir et resultat lik den som er vist i figur 1A. Deretter undersøke smeltetemperaturer observert i resultatene i "replikere"-panelet. Sørg for at dette viser en klar økning i smeltetemperatur med økende ligandkonsentrasjon.
MERK: Ideelt sett vil dette gi en klar maksimal smeltetemperatur (forutsatt at proteinet er fullt ligand bundet), og et tilnærmet K d, hvor smeltetemperaturen er halvveis mellom den ligand-fritt protein ogden maksimale.
2. eksperimentelle oppsettet for fastsetting dissosiasjonskonstanten
- Forbered blandingen beskrevet i tabell 2 som en master mix.
- Forbered lagrene av liganden på femten forskjellige konsentrasjoner, som blir fortynnet ti ganger i det endelige eksperiment. Ideelt sett er konsentrasjoner på minst to størrelsesordener over og under den beregnede K d, og midt konsentrasjoner på den beregnede K d. Fokus på syv av de punkter i en størrelsesorden av den beregnede K d, med en annen fire punkter på hver side av denne; hvis det er et valg, inkluderer flere poeng på verdier som er mette.
MERK: Hvis det er nødvendig, er det mulig å endre de eksperimentelle forhold, slik at ligandsysternene bestandene er på dobbel eksperimentelle konsentrasjon, hvor ligand løselighet er begrensende. - Legg 120 mL av masterbland åtte brønner i en U-bunnet 96-brønners plate, til å virke som et reservoar for praktisk utmatning av konsentrat-blanding. Bruk en 8 kanals pipette å dispensere 18 mL i en kolonne av en PCR-plate. Gjenta for ytterligere fem kolonner, for å gi totalt 48 brønner fylt i en 6 x 8 mønster på platen.
- Tilsett 20 pl av liganden bestander, eller løsningsmiddel, for å separere brønner i en U-bunnet 96-brønners plate. Ved hjelp av en 8 kanals pipette, aspirer 2 mL av åtte forskjellige ligand aksjer (eller løsemiddel). Legg disse til en kolonne i PCR plate som var fylt med master mix i trinn 2.3. Gjenta med de samme åtte ligand / løsemiddel aksjer for ytterligere to kolonner. Sug 2 ul av de resterende åtte ligand eller løsemiddelbestander, og legge disse til en fjerde kolonne i platen. Gjenta dette for ytterligere to kolonner. Dette vil gi triplikatprøvene for alle 16 ligand og oppløsningsprøver.
- Plasser en qPCR segl over platen (se trinn 1.4).
- Sentrifuger plate ved 500 xgto min.
- Sett platen i qPCR instrumentet. Kjør en termisk denaturering med parameterne som er angitt i trinn 1.6.
- Ved avslutningen av instrumentet løp, klikk på "Analyze"-knappen på skjermen. Lagre resultatfilen.
- Åpne Protein Thermal Shift programvare. Opprett en ny studie; i kategorien egenskaper, gir dette et navn, og i kategorien betingelser, detalj ligander.
- Flytte til Experiment kategorien Files, og importere den lagrede resultater filen (XXX.eds), og angi innholdet av hver brønn.
MERK: malfiler er tilgjengelig elektronisk på http: // www.exeter.ac.uk/biosciences/capsular. - Flytt til fanen Analysis, og trykk på "Analyze" knappen.
- Velg "Replikater" fanen fra menyen på venstre side av skjermen for å vise resultatene som triplicates. Vurdere påliteligheten av dataene basert på hvor tett de triplicates er. Should de triplicates viser dårlig reproduserbarhet, undersøke rådata nøye.
- Analysere dataene ved å bruke både Boltzmann eller derivat metoder for å vurdere smeltetemperaturen. Velg "Repliker resultater"-kategorien, og i "Repliker resultater plot", veksle "Plot av:" knappen mellom "Tm - Boltzmann" og "Tm - Derivative". Velg den metoden som gir større reproduserbarhet for prøven. Eksportere resultatene for videre undersøkelser med Excel ved hjelp av kategorien Export.
MERK: For prøver som viser flere overganger, er det nesten alltid best å bruke den deriverte metoden i flere smeltemodus. Resultatene blir eksportert i en fane avgrenset format. Det er best å åpne den eksporterte filen i Excel, og umiddelbart spare i Excel-format. - Gjenta eksperimentet i det minste to ganger, inkludert en gjentagelse på en separat dag, for å sikre reproduserbarhet av resultatene. Skulle dataanalyse (se trinn 3 nedenfor)indikerer at verdien av K d er vesentlig forskjellig fra den opprinnelige anslag, endre de ligand-konsentrasjonen deretter (se trinn 2.2) for å sikre et godt område av verdier rundt K d.
3. Data Analysis fastslår dissosiasjonskonstanten henhold Termisk Denaturering
- Lag en tabell i Excel av liganden konsentrasjoner og smeltetemperaturen.
- Åpne GraphPad Prism programvare, og skape et XY-bord. Inn dataene, ved hjelp av X-kolonnen for den ligand konsentrasjoner og Y kolonnen for smeltetemperaturen resultater.
MERK: et eksempel vises er Figur 1B. Et skript med ligninger forhåndsinstallert, og alternative instruksjoner for bruk av SPSS statistikkpakke, er tilgjengelig elektronisk på http: // www.exeter.ac.uk/biosciences/capsular. - I kategorien Analyse velg alternativet for å endre analyse parameter,s (Ctrl + T). Slik skriver du inn den riktige modellen, velg "New" og "Opprett ny ligning". Sett ligningen beskrevet i tabell 3 som "Single nettstedet ligandbinding".
MERK: Et eksempel på denne fremgangsmåten er vist i figur 1C. Ved bruk av skriptet med ligninger forhåndslastet, kan den relevante ligning rettes valgt fra listen i stedet for angitt. Avledning av denne ligningen er gitt i bilag. - Velg "Regler for startverdier" boksen, og angi regler for startverdier som beskrevet i Tabell 3.
- Begrense parameteren P, som "Constant lik" og angi den endelige konsentrasjon av proteinet (i de samme enheter som liganden er gitt i).
- Velg OK for å utføre analysen.
MERK: Et eksempel på denne fremgangsmåten er vist i figur 1D. Den grafiske programvare produserer en figur som viser data og passformen til modellen. Eksempler på these analyser er vist i de representative data.
4. Montering av data til samarbeidsmodeller
For å passe data til en samarbeidsmodell, velge mellom enten en enkel samarbeidsmodell eller en modell der to separate dissosiasjonskonstanter er definert. Den første metoden er å foretrekke i tilfelle av negativ cooperativity, eller som en første undersøkelse. Men i prinsippet er det bedre i tilfeller med positiv cooperativity å modellere to forskjellige dissosiasjonskonstanter 18. I dette tilfellet kan modellering videre forutsatt at enten sekvensiell binding av ligander, eller uavhengig binding av ligander.
- Følg de samme innledende trinnene som i protokoll 3. Men på trinn 3.3, setter en av ligningene i tabell 3 oppført som "Simple samarbeidsmodellen", "Sequential binding av to ligander", eller "Uavhengig binding av to ligander" 18.
- Velg de relevante regler for startverdierforbundet med hver av disse ligningene i tabell 3.
- Undersøke tilpasning av modellen til dataene. Dataene må passe dårlig, bør du vurdere en annen modell.
Merk: Det er også viktig å nøye undersøke montering av smeltetemperaturen til data av Protein Termisk Shift programvare (trinn 2.9): Noen ganger er det nødvendig å endre parametrene her for å få de beste resultatene. En annen vurdering er om omfanget av datapunkter er ideelt, og om det er noen unormale punkter: enten et begrenset sett med data på hver side av K d, eller en enkelt unormal punkt (spesielt på de høyeste ligand konsentrasjoner), kan påvirke resultatene. - Gjenta eksperimentet minst to ganger (se trinn 2.12) for å sikre reproduserbarhet.
5. Montering av data til Curves Viser Binary Flytter i Smeltetemperatur
Av og til, i stedet for en gradert respons på ligand, proteinene værtobservert å vedta en binær respons, hvor bundet prøven er klart adskilt fra ubundet prøven. Et eksempel er gitt i de representative resultater (figur 4). I dette tilfellet vil montering av smeltetemperaturer ikke gi en god passform for K d.
- Eksportere rådata utgang fra Protein Thermal Shift programvare. For hver temperatur punkt, beregner den midlere fluorescens for null ligand og ligand høyeste konsentrasjoner. Tabellarisk oppstilling av resultatene fra hvert datapunkt ved siden av disse.
MERK: Feilen skapt her er mindre enn feilen i de monterte smeltetemperatur. - Åpne SPSS statistikkpakke. Kopier temperaturer, de to middel datasett, og data for hvert forsøk til en data vindu i SPSS. I kategorien variabel, satt den gjennomsnittlige datasettet for ingen ligand som "lav", og gjennomsnittlig datasettet for den høyeste ligandkonsentrasjonen som "høy".
- Last ned syntaks fil tilgjengeligonline på på http: // www.exeter.ac.uk/biosciences/capsular . Velg "Run → Kjør alle".
- Kopier andelen bundet resultatene til en ny Excel-arbeidsbok, med relevante ligand konsentrasjoner.
- Åpne Graphpad programvare, og skape et XY-bord. Inn dataene, ved hjelp av X-kolonnen for den ligand konsentrasjoner og Y kolonnen for smeltetemperaturen resultater. I kategorien analyse, velg "Endre analyseparametere". Slik skriver du inn den riktige modellen, velg "New" og "Opprett ny ligning". Tast ligningen gitt i tabell 3, som er oppført som "Analyse av binære skift i smeltetemperatur".
- Velg "Regler for startverdier" boksen, og angi regler for startverdier er beskrevet i Tabell 3. Begrense parameter P, som "Konstant lik" og skriv inn den endelige konsentrasjonen av protein (i de samme enhetene som ligand er gitt i).
MERK: eksempler på å fullføre disse boksene for protokollen i avsnitt 3 er vist i figur 1C, D. - Hvis det er en god passform, kan resultatene bli forbedret ved å ekstrapolere til den forventede resultat ved uendelig ligandkonsentrasjon. Fra modellen av andelen bundet på hver ligandkonsentrasjon, undersøke verdien for den høyeste verdien av ligandkonsentrasjon. Hvis dette er 0,99 eller større, er videre analyse neppe bedre resultater.
- Hvis andelen er mindre enn 0,99, er et ytterligere trinn nødvendig for å korrigere for effektene av det ubundne proteinet i den høyeste ligandkonsentrasjonen prøven. Ved trinn 5.2, skrive andelen av bundet ligand på det høyeste ligandkonsentrasjonen punkt (fra trinn 5.7) i celle R2 (en annen celle kan anvendes, og R2 erstattes hensiktsmessig i ligningen i tabell 3). Lag en ekstra kolonne etter gjennomsnittet av de høyeste ligandkonsentrasjon resultater. I first celle, kopiere ligningen oppført i tabell 3 som "ekstrapolering til uendelig ligandkonsentrasjon". Kopier denne formelen til de gjenværende cellene i denne kolonnen.
Merk: Denne beregningen fjerner effekten av ubundet protein i høyeste ligandkonsentrasjonen. Forskjellen mellom den fri ligand protein, og den høyeste ligandkonsentrasjonen er multiplisert med den resiproke verdi av andelen er bundet på det høyeste ligand konsentrasjon for å gi den forventede forskjell mellom helt bundet og ubundet protein tilstander ved hver temperatur-punkt. Denne forskjellen er lagt til eller trukket fra ubundet tilstand for å gi den forventede fluorescens for fullt ligand bundet protein. - Sett på kolonnen for maksimal ligandkonsentrasjonen i SPSS dataark med denne nye kolonnen, og gjenta databeslaget.
MERK: trinn 05.07 til 05.09 må kanskje gjentas hvis modellen antyder en ytterligere betydelig endring i andelen bundet på maksimalt ligand concentratipå (hvis dette er tilfelle, ville det trolig være ideelt å gjenta eksperimentet med en høyere ligandkonsentrasjon punkt inkludert). - I tilfeller hvor proteinet viser en binær forskyvning og viser samarbeids oppførsel, antydet ligningen i trinn 5.5 bør være substituert med de fra trinn 4.1. "Toppen" og "bunnen" parametere bør erstattes av 1 og 0 henholdsvis.
- Gjenta eksperimentet minst to ganger (se trinn 2.12) for å sikre reproduserbarhet.
Representative Results
En utmerket test substrat for denne metoden er heksokinase. Dette har fordelene av å være lett kommersielt tilgjengelig, og som har to substrater som er funnet i de fleste laboratorier, og som gir klare og reproduserbare resultater i analysen. En innledende konsentrasjon skjermen (protokoll 1), ved hjelp av heksokinase og glukose (figur 2A), antyder at den sannsynlige K d vil være i området 0,2 til 1,7 mM. Derfor, ble en større skjerm (protokoll 2) utføres ved hjelp av de konsentrasjoner som er vist i tabell 4. Resultatene (Figur 2b) viser en god tilpasning til den ene side ligandbindende ligning (Protocol avsnitt 3.3) [9], og ga en K d på 1,2 ± 0,1 mM.
Den antatte heptose-guanyl transferase WcbM 19,20 viser en sterk termisk skift på binding til GTP (figur 3A). En første skjerm antydet at Kd vil være i området fra omkring 100 uM. Derfor, ble en full skjerm satt opp, ved hjelp av de konsentrasjoner som vist i tabell 5 Montering av resultatene til ligning 3.3 viste en rimelig tilpasning (R 2 av 0,981; figur 3B). .Imidlertid, Er det en tydelig forskjell mellom dataene og den modellen, noe som tyder på at en annen ligning er nødvendig. Søking av Protein Databank 21 med WcbM sekvensen viste at de nærmeste homologer for hvilke strukturer er fastsatt skjema dimer. Dataene ble derfor analysert ved hjelp av de tre likningene for samarbeidsvillig, sekvensiell, og uavhengig binding av to ligander (protokoll 4). Monterings statistikk for en samarbeidsmodell ga en R2 verdi på 0,998 og standardavvik av rester (Sy.x) av 0.215, mens både sekvensielle og uavhengige bindende modellene ga en R2 verdi på 0,992 og en Sy.x av 0.480 og 0.461 respektivt. Dette tyder på at modellenå gi best mulig passform til dataene ble samarbeidsmodellen: her, en K ½ av 230 ± 10 mm ble observert, med en n-verdi på 0,52 ± 0,02 (Figur 3C). Dette indikerte en negativ cooperativity i bindingen. Legg merke til at en K ½ ble brukt i dette tilfelle i stedet for K d, som enhetene for K d ville være heller utilfredsstillende 0,52 pM.
Den antatte BNP-6-deoksy-β-D-mannan -heptopyranose 2- O -acetylase, WcbI 22, viser en heller uvanlig resultat i differensial skanning fluorimetry. I fravær av eventuelle ligander, viser det en klar og enkel denaturering (figur 4A). Koenzym A (CoA) ble identifisert som en ligand av dette proteinet ved hjelp DSF, og affiniteten til proteinet for denne partner ble undersøkt som beskrevet i protokollen. I nærvær av høye konsentrasjoner av CoA, en sterk shift til en høyere temperatur er observert, med en endring i smeltetemperatur på 15 ° C. Imidlertid, i det mellomliggende konsentrasjoner, i stedet for å skifte til et monofasisk smelter ved en mellomliggende smeltetemperatur, WcbI viste en bifasisk smelting, med proteinet ser ut til å smelte ved enten liganden frie temperatur, eller fullstendig bundet smeltetemperatur (figur 4A) . Andelene av de to arter endret på en doseavhengig måte, med økende substratkonsentrasjonene øke andelen som smeltet ved høyere temperatur (figur 4B). Direkte analyse av disse dataene var utfordrende: utrustning til Boltzmann ligningen ga svært dårlig anfall, mens avledede metoder fremhevet at to smelte hendelser ble forekommende, men fikk ikke hjelp i å demonstrere en endring med økende ligandkonsentrasjon.
En mindre konvensjonell tilnærming til å analysere disse dataene ble derfor vedtatt (protokoll 5). Fluorescens derivative resultater uten ligand og ved høyeste ligandkonsentrasjonen ble tatt som representerer i det vesentlige alt protein i den lavere smeltetemperatur, eller det høyere smeltetemperatur tilstand. De gjenværende avledede data ble montert ved hvert punkt som summen av en andel av hver av disse to tilstander, med andelen summert til enhet (figur 4C). De oppnådde data ble deretter montert som før for å oppnå en tilsynelatende K d, ved hjelp av de samme ligninger som før. Dette fremhevet at "høy" ligand punkt er sannsynlig å være bare 95% ligandbundet. Dataene ble deretter ekstrapolert til en forutsigelse av resultatet for en 100% bundet protein, og data som tilpasning på gjentatt for å gi en tilsynelatende K d på 58 ± 2 uM. Dette har gitt en utmerket passform av de eksperimentelle resultatene til forpliktende modell (figur 4D).
FO: content-width = "5in" src = "/ filer / Ftp_upload / 51809 / 51809fig1highres.jpg" width = "500" />
Figur 1. Eksempler på eksperimentoppsett og analyse. (A) Eksempler på den forventede formen av en termisk denaturering profil (tatt fra data for gjær heksokinase). Den karakteristiske form av de rå data viser en progressiv økning i fluorescensen til et maksimum, etterfulgt av et grunt nedgang (diskutert i mer detalj i 9). Dette er ledsaget av en enkelt topp i den første deriverte av fluorescens. (B) Eksempel på dataregistrering i Graphpad. Ligand konsentrasjon er gitt på x-aksen, og observerte smeltetemperaturer på Y-aksen. (C) Eksempel på definisjon i ligning Graphpad. (D) Eksempler på fullstendig å sette de innledende verdiene av variablene, og for fiksering av proteinkonsentrasjonen, for å muliggjøre korrekt bestemmelse av dissosiasjonskonstanten.m / filer / Ftp_upload / 51809 / 51809fig1highres.jpg "target =" _blank "> Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
. Figur 2. Interaksjon av heksokinase med glukose målt ved differensiell scanning fluorimetry (A) Et første eksperiment teste et bredt spekter av glukosekonsentrasjoner tyder på at K d er sannsynlig å være i området fra 0,2 -. 1,7 mm (B) En detaljert eksperiment, testing av 16 konsentrasjoner av glukose, tillater bestemmelse av den tilsynelatende K d som 1,12 ± 0,05 mM. Dataene passer svært godt til modellen for ett bindings arrangement (med bunnen (T1) og øvre (T2) temperaturen passende til 35,4 ± 0,2 ° C og 49,3 ± 0,5 ° C henholdsvis). Legg merke til atDisse data ble samlet i nærvær av 10 mM MgCl2. Disse bildene ble utarbeidet med GraphPad. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 3. Samspill WcbM med GTP avslører en anti-kooperativ binding. (A) Et første eksperiment teste et bredt spekter av konsentrasjoner GTP tyder på at K d er sannsynlig å være i området fra 200 -. 500 pM (B) En detaljert eksperiment, testing 16 konsentrasjoner av GTP, antyder en verdi for den tilsynelatende K d på 120 ± 20 pM. Imidlertid, når en logaritmisk skala brukes for x-aksen, er det en betydelig discrePancy mellom modell og data. (C) Analyse av de samme dataene med en samarbeidsmodell viser en utmerket tilpasning til data der en enkel samarbeidsmodellen brukes. Her ble en K ½ av 230 ± 20 mikrometer bestemt, med cooperativity koeffisient n = 0,52 ± 0,02 (med bunnen (T1) og toppen (T2) temperaturer montering på 69.63 ± 0.06 ° C og 79,9 ± 0,1 ° C henholdsvis). Som WcbM synes å være dimerisk, innebærer dette at enzymet er helt anticooperative i sin binding til GTP. Disse bildene ble utarbeidet med GraphPad. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 4. WcbI viser en bifasisk smelte mønsteri nærvær av sin ligand koenzym A (CoA). (A) WcbI, i fravær av ligand (blått), viser en enkel monofasisk smelte mønster. Ved høye ligand konsentrasjoner (1 mm; grønn linje), er et lignende mønster observert. Imidlertid, ved mellomliggende ligand konsentrasjoner. (60 uM; rød linje), to distinkte smeltetopper, tilsvarende ligand-fri og bundet ligand-tilstander blir observert (B) Overgangen mellom de to sett av topper er doseavhengig på tvers av den fulle område av konsentrasjoner. (C) Modellering av den bifasiske smelting som en sum av en del av de frie ligand og ligand høye resultater gir en god tilpasning til dataene (stiplet linje lilla, sammenlignet med rød linje). Dette passer er forbedret ved å ekstrapolere resultatet observert for høy ligandkonsentrasjon (hvor modellen antyder ~ 95% belegg) til full bruk (stiplet blå linje). (D) Resultatene for andel av WcbI bundet til CoA sho data ws en utmerket tilpasning til en enkel binding modellen, med en K-d på 58 ± 2 uM (disse data representerer data som er samlet på to forskjellige dager, med noe forskjellige ligand-konsentrasjon som er valgt for den andre dag basert på det første settet med resultater). Paneler. (A - C) ble utarbeidet ved hjelp av Excel, og panel (D) ved hjelp Graphpad Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Tabell 1. Oppskrift for innledende forsøk.
| Reagens | Volum i mix (ul) |
| Protein | Til endelig konsentrasjon på 0,11 mg / ml |
| 0.3 | |
| 0.5 M HEPES pH 7.0 | 3.7 |
| 5 M NaCl | 5.6 |
| Vann | Til 180 mL |
Dette beskriver en "konsentrat-blanding" av protein, deteksjon reagens og buffer for en innledende rekognosering eksperiment for å gi et estimat av K d, som beskrevet i protokoll delen 1. Denne bufferblanding er hensiktsmessig for generiske proteiner. Der hvor tidligere resultater tyder på andre buffere som skal brukes, bør disse være substituert. Hvis proteinet lager er ved en lav konsentrasjon (dvs. mindre enn 0,3 mg / ml), kan det være nødvendig å redusere mengden av ytterligere buffer tilsatt for å kompensere for buffer allerede er til stede i proteinprøven.
| Reagens | Volum i mix (ul) |
| Protein | Til endelig konsentrasjon på 0,11 mg / ml |
| 5,000x SYPRO Orange | 1.78 |
| 0.5 M HEPES pH 7.0 | 22.2 |
| 5 M NaCl | 33.3 |
| Vann | Til 180 mL |
Dette beskriver den "master mix" av protein, deteksjon reagens, og bUffer for en fullstendig bestemmelse av K d for en proteinprøve, som beskrevet i protokoll delen 2. Denne bufferblanding er hensiktsmessig for generiske proteiner. Der hvor tidligere resultater tyder på andre buffere som skal brukes, bør disse være substituert. Hvis proteinet lager er ved en lav konsentrasjon (dvs. mindre enn 0,3 mg / ml), kan det være nødvendig å redusere mengden av ytterligere buffer tilsatt for å kompensere for buffer allerede er til stede i proteinprøven.
Tabell 3. ligninger og rammer for dataanalyse.
| Skritt i forsøksprotokoll | Ligningen nødvendig | Parametere som kreves | Beskrivelse av variabler og parametere |
| 3.3 | </ Td> | ||
| Enkelt område ligandbinding | Y = Bottom + ((Top-Bottom) * (1 - ((PK d -X + sqrt (((P + X + K d) ^ 2) - (4 * P * X))) / (2 * P )))) | P: protein konsentrasjon. Kd: dissosiasjon konstant. P og Kd er gitt i de samme andeler som ble brukt for den ligand konsentrasjoner. Topp, Bunn: smelter temperaturer på uendelig ligandkonsentrasjon og ingen ligandkonsentrasjon hhv. | |
| 3.4 | Bottom = * YMIN | YMIN: Minimum verdien av Y (laveste eksperimentelle protein Tm, i dette tilfellet) | |
| Top = * YMAX YMAX: Maksimal verdi av Y (høyeste eksperimentell protein Tm) | |||
| K d = * X på YMID | YMID: Verdien av Y som tilsvarer gjennomsnittet av YMIN og YMAX. X er den tilsvarende X-verdi (her, den aktuelle ligand-konsentrasjon) | ||
| P = (Initial verdi, for å være passe) | |||
| 4.1 | |||
| Enkel samarbeidsmodellen | Y = Bottom + ((Top-Bottom) * (((X / Kd) ^ n) / (1 + ((X / Kd) ^ n)))) | n: Hsyk koeffisient. Dette beskriver cooperativity, eller andre biokjemiske egenskaper, av proteinet, og er ikke nødvendigvis et estimat på hvor mange ligand bindingssteder i proteinet. En Hill koeffisient på en representerer ingen cooperativity; verdier lavere enn én indikerer negativ cooperativity, og verdier større enn én positiv cooperativity. | |
| Bottom = * YMIN | |||
| Top = * YMAX | |||
| K d = * X på YMID | |||
| P = (Initial verdi, for å være passe ) | |||
| n = (Initial verdi, for å være passe) | |||
| Sekvensiell binding av to ligander | Y = Bottom + ((Top-Bottom) * ((X ^ 2) / (K d * K2)) / (1 + (X / K d) + ((X ^ 2) / (K d * K2))) ) | K2: dissosiasjonskonstant for andre bindende hendelsen. | |
| Bottom = * YMIN | |||
| Top = * YMAX | |||
| DTH: 123px; "> K d på YMID = * X | |||
| K2 = * X på YMID | |||
| P = (Initial verdi, for å være passe) | |||
| Uavhengig binding av to ligander | Y = Bottom + ((Top-Bottom) * ((X ^ 2) / (K d * K2)) / (1 + (2 * X / K d) + ((X ^ 2) / (K d * K2) ))) | ||
| Bottom = * YMIN | |||
| H: 123px; "> Top = * YMAX | |||
| K d = * X på YMID | |||
| K2 = * X på YMID | |||
| P = (Initial verdi, for å være passe) | |||
| 5.5 | |||
| Analyse av binære skift i smeltetemperaturen | Y = 1 - ((PK d -X + SQRT (((P + X + K d) ^ 2) - (4 * P * X))) / (2 * P)) | 23px; ">||
| Bottom = * YMIN | |||
| Top = * YMAX | |||
| K d = * X på YMID | |||
| P = (Initial verdi, for å være passe) | |||
| 5.8 | |||
| Ekstrapolering til uendelig ligandkonsentrasjon | (C2 - ((1-$ R $ 2) * B2)) / $ R $ 2 | B2: celle inneholdende produktet med ingen ligand. C2: celle inneholdende produktet med maksimal ligand. $ R $ 2: celle inneholdende andelen bundet ved maksimal ligandkonsentrasjon. |
Trinn 3, 4 og 5 krever tilsetning av detaljerte ligninger inn i analyse-programvare, og nøyaktig definisjon av startparametre for dataanalyse. Ligningene for hver relevante trinn er vist, med de riktige valg av parametrene. En forklaring på betydningen av variabler og parametere er oppgitt som referanse.
Tabell 4. Konsentrasjoner for screening av samspillet heksokinase med glukose.
| Prøvepunkt | Ligand (glucose) konsentrasjon (mM) |
| 1 | 0 |
| 2 | 0.001 |
| 3 | 0.005 |
| 4 | 0,01 |
| 5 | 0,03 |
| 6 | 0.1 |
| 7 | 0.3 |
| 8 | 0.4 |
| 9 | 0.7 |
| 10 | 1.1 |
| 11 | 2.1 |
| 12 | 3.7 |
| 13 | 5.3 |
| 14 | 7 |
| 15 | 9 |
| 16 | 11 |
Heksokinase fra spirende gjær Saccharomyces cerevisiae ble tilsatt til konsentrat-blanding som beskrevet i protokollen, supplert med 10 mM MgCl 2 som magnesium er et kjent kofaktor. Den innledende estimat av K-d var mellom 0,5 og 2 mm. Forsøk ble satt opp for å gi de angitte sluttkonsentrasjoner på glukose.
Tabell 5. Konsentrasjoner for screening av samspillet WcbM med BNP.
| Prøvepunkt | Ligand (GTP) konsentrasjon (mikrometer) |
| 1 | 0 |
| 2 | 0.5 |
| 3 | 1 |
| 4 | 5 |
| 5 | 10 |
| 6 | 25 |
| 7 | 50 |
| 8 | 100 |
| 9 | 250 |
| 10 | 8px; "> 500|
| 11 | 1000 |
| 12 | 2500 |
| 13 | 5000 |
| 14 | 7500 |
| 15 | 10.000 |
| 16 | 20.000 |
WcbM fra Burkholderia pseudomallei ble lagt til master mix som beskrevet i protokollen. Den opprinnelige estimat av K d var rundt 100 mikrometer. Forsøk ble satt opp for å gi de angitte sluttkonsentrasjoner på GTP, med formål å dekke minst to størrelsesordener over og under K d.
Discussion
Differential scanning fluorimetry har vist sin makt som en robust og fleksibel metode for å karakterisere proteiner, og identifisere potensielle protein ligander. Den godt dokumenterte suksesser i påskynde protein stabilisering, medisiner (spesielt i mindre godt finansiert laboratorier) og krystallisering 10,23-25 har gjort det til en attraktiv metode for innledende screening av forbindelser. Forbindelser tilsatt til proteiner viser en klar doseavhengig økning i den tilsynelatende smeltetemperatur 7,9. Men det har vært få forsøk på å bruke resultatene fra disse forsøkene for å fastslå åpen bindende konstanter til hjelp i rangeringen forbindelser for deres affinitet. Her presenterer vi en fremgangsmåte for systematisk å bestemme en tilsynelatende dissosiasjonskonstant for proteiner i nærvær av en ligand.
Resultatene som presenteres her viser at DSF kan raskt og robust anslag av dissosiasjonskonstanten foren protein-ligand-formasjon. De observerte data kan manipuleres med kommersielt tilgjengelige verktøy for å tilveiebringe en hurtig bestemmelse av K d, uten behov for å gjøre antagelser om den sannsynlige verdi av parameterne. Fremgangsmåten har en betydelig fordel over noen sammenlignbare fremgangsmåter for å være parsimonious både protein og tiden som kreves. Eksperimentet som er beskrevet her vil forbruke 0,13 mg protein pr forsøket (ca. 0,4 mg til eksperimentene gjentatt i triplikat). Dette er bra sammenlignet med isotermisk titrering kalorimetri (ITC), der en enkelt eksperiment med en gjennomsnittlig 40 kDa protein vil forbruke like mye. Den fullstendige sett av eksperimenter kreves for denne protokollen vil forbruke rundt 4 timer, inkludert preparatet, for en enkelt sett av eksperimenter. Igjen, dette er sannsynlig å være betydelig raskere enn metoder som ITC eller overflate-plasmonresonans, som mens kraftig krever ofte betydelige optimalisering for å oppnå de beste data.
Våre resultater viser at det gjenstår et krav om å nøye undersøke de rå data, til tilpasning av disse data bestemmer smeltetemperaturen, og i form av smeltetemperaturdata for å bestemme dissosiasjonskonstant. En første utfordring er formen av de rådata som er produsert i protein-smelting. I noen tilfeller, vil formen ikke er nøyaktig den som ble observert i figur 1A. Vanlige problemer kan lave temperaturer skift på ligandbinding, høy bakgrunn fluorescens, og uvanlige flere overganger i temperaturen. Lav temperatur skift blir sett på binding av en rekke ligander. For denne fremgangsmåten, er den mest kritiske parameter feilen i T m måling, sammenlignet med temperaturen skiftet. Dataene kan som regel være utstyrt rimelig godt når standardavviket for triplikat målinger ikke overskrider 10% av smeltetemperaturen forskyvning mellom ubundet og fullstendig bundet protein. Vår erfaring er at der slik templitteraturen skift er bare 2 ° C, kan dette være tilstrekkelig for montering av data, hvis de enkelte datapunkter er svært nøyaktig. Et annet spørsmål er uvanlig formet kurver. Disse ofte variere mellom fritt protein og ligand bundet form, som den bindende ligand påvirker utfolding moduser av proteinet. I disse tilfeller må brukeren vurdere om dataene kan brukes med passende hensyn til de modeller som skal brukes for bestemmelse av smeltetemperaturen og dissosiasjonskonstanten. Et annet vanlig problem er at tilsetningen av en kofaktor til proteinet (for eksempel MgCl2 i vårt eksempel med heksokinase) er nødvendig for å oppnå de mest pålitelige data. Vår erfaring er at en nøye vurdering av alle sannsynlige faktorer i forsøket på scenen for å ta innledende avlesninger er avgjørende for å oppnå de beste resultatene. Videre kan alternative teoretiske behandlinger avdekke trekk ved disse dataene 15,17. Endelig, er det ikke uvanlig for enkelte proteiner som contain opprinnelig utsatt hydrofobe regioner for å vise høy bakgrunn fluorescens. Det finnes en rekke løsninger på disse problemer, som har blitt grundig gjennomgått andre steder 6,9.
Spesielt må brukeren vurdere å benytte Boltzmanns eller derivat modeller (for eksempel figur 4), og i tilfelle av bruk av derivater, enten flere smelter skal modelleres. De to fremgangsmåter for å modellere den termiske utfolder varierer i at Boltzmanns metode passer de eksperimentelle data til Boltzmann ligningen, forutsatt at en vanlig sigmoidal form til utfolding kurve. I motsetning til dette tar den deriverte metoden den første deriverte av de eksperimentelle data ved hvert punkt (nedre panel i figur 1A), og vurderer smeltetemperaturen til å være punktet for høyest første deriverte. Derivatet metoden returnerer generelt en høyere smeltetemperatur ved omkring 2 - 3 ° C. De fleste proteinene vil returnere en mer konsistentresultat (dvs. standardfeilen for smeltetemperaturen for triplikat eksperimenter er lavere) for en av de to metodene. Det er vanligvis tett forbundet til den nøyaktige formen av proteinet utfolding kurve, og det er nødvendig empirisk å bestemme den beste metode i hvert tilfelle. Hvor den deriverte modellen brukes, er det også viktig å vurdere flere smelte hendelser. Noen data viser tydelig bevis for flere overganger, og i disse tilfellene resultatene vil trolig være enklere å tolke hvis disse flere smelte hendelser er modellert. I sammenheng med denne protokollen, er det ofte tilfelle at tilsetning av ligand kan føre til et protein til å skifte fra å ha flere smelte overganger til en enkelt overgang (f.eks, ved å stabilisere de termisk skjøre underdomene), eller vice versa. Vi vil derfor argumentere for at rådata blir undersøkt sammen før man vurderer hvilken tilnærming vil være best å bruke.
Etter modelling av de enkelte smeltetemperaturer, kan ytterligere problemer oppstår i montering disse til modellene som presenteres i protokollen delen. Det er viktig å nøye undersøke skikket til dissosiasjonskonstanten ligning ved hjelp av en logaritmisk skala, da denne analysen fremhever ofte avvik mellom de observerte data og modellen (e .g., Figur 3). Mens resultatene som oppnås er vanligvis robuste, pleie i tolkningen tilbyr muligheten til å trekke ut bedre resultater, og de mest betydning, fra dataene.
En bestemt sak reist av disse dataene er tolkningen som bør plasseres på proteiner som viser cooperativity, eller flere bindende hendelser, i DSF. Vi har til dags dato, bare observert dette fenomenet i proteiner som er forventet å ha flere spesifikke bindings hendelser (f.eks WcbM, et protein som beste homologue er en multimer 26, og som fungerer som en multimer på størrelse utelukkelse kromatografi [Data ikkevist]). Det er ikke i det hele tatt klart at den negative cooperativity observert i DSF denaturering indikerer at enzymet til slutt vil vise negativ cooperativity: i stedet, kan dette være en indikasjon på komplekse binding som må bli undersøkt mer grundig ved hjelp av et bredere spekter av metoder. Dette antyder oss imidlertid at mer omfattende studier av slike proteiner er sannsynlig å identifisere interessante effekter.
De angitte for dissosiasjonskonstanten ved hjelp av denne metoden verdier er generelt av samme størrelsesorden som de som leveres av andre metoder, slik som titrering isoterm kalorimetri, og overflate-plasmonresonans. Men de absolutte verdier er ofte høyere enn det som observeres ved hjelp av disse metoder. Dette er i det minste delvis er en konsekvens av det faktum at dissosiasjonskonstanten er observert ved smeltetemperaturen for proteinet med liganden. Denne K d er generelt høyere enn det ved fysiologiske temperaturer. Den dissociation Konstanten er relatert til temperaturen av reaksjonen ved ligningene:
[1]
[2]
(Hvor c θ er standardreferansekonsentrasjon, Δ r G er Gibbs fri energi endring av reaksjonen, R er den molare gasskonstant, er Δ H entalpien endring i reaksjonen, og Δ S er entropi endring i reaksjons .)
Reaksjoner med dissosiasjonskonstanter i den målbare spekter av denne fremgangsmåte vil generelt ha en negativ Δ r G, og så virkningen av en økning i temperaturen i ligning [1] vil være å øke dissosiasjonskonstant. Både Δ H og Δ S vilkår som utgjør Gibbs fri energi (ligning [2]) er temperature avhengig 27, og effekten på dissosiasjonskonstanten vil avhenge av størrelse og fortegn av disse temperaturavhengigheter, og vil nødvendigvis være avhengig av interaksjon. Følgelig er det ikke uventet at de dissosiasjonskonstanter bestemt ved denne metoden er noen ganger større enn de som bestemmes ved hjelp av metoder som opererer ved RT. Temperaturavhengighet er naturligvis også en påminnelse for mange andre metoder, som har tendens til å gi dissosiasjonskonstanten ved temperaturer som er lavere enn den fysiologiske temperatur.
En annen forbeholdet av DSF metoden er at den er en merket fremgangsmåte, i motsetning til ITC. Den fluorescerende markør som brukes (SYPRO Orange) er hydrofobt, og slik at i noen tilfeller kan konkurrere med bindingen av hydrofobe ligander til proteiner. Følgelig er det sannsynlig at i noen tilfeller, dissosiasjonskonstanten erholdt vil være kunstig hevet på grunn av konkurranse med etiketten. Imidlertid, for sammenlikning av forskjellige ligander, (den primære bruk avDSF), forskjellene er usannsynlig å være tilstrekkelig stor til å påvirke rangeringen av forbindelser med affinitet.
En potensiell ulempe ved denne metoden er påvisningsgrensen som kan oppnås. I prinsippet skulle det ikke være mulig å måle en verdi for K d som er lavere enn 50% av proteinkonsentrasjonen, og til og med verdiene i dette området er sannsynlig å være av tvilsom nøyaktighet. Mens grensen for deteksjon ved denne ende av området kan forlenges litt ved å redusere konsentrasjonene av protein og fargestoff, vil følsomheten av instrumentet hindre ytterligere reduksjon i proteinkonsentrasjon. Tilsvarende vil den øvre ende av følsomheten bli bestemt av løseligheten av liganden. For å oppnå et matematisk robust estimat for K d, er det mest viktig å fremskaffe data med 90% av proteinet tilstede i ligand-bundet form, noe som krever ligand konsentrasjoner å være omtrentligly ti ganger K d (forutsatt ingen cooperativity). Deteksjonsgrensen vil derfor nødvendigvis være en tiendedel av oppløseligheten av ligand i det aktuelle buffer. Dette betyr at grensene for påvisning av metoden vil typisk være i området mellom 1 mM og mellom 1 og 100 mM, avhengig av protein og ligand.
Som konklusjon, er differensial scanning fluorimetry en allsidig teknikk som gjelder for et stort utvalg av proteiner. Ved hjelp av de fremgangsmåter som er presentert her, er det mulig å raskt og billig å bestemme affiniteten av et protein for forskjellige ligander. Dette har stort potensial for anvendelse i protein rensing og stabilisering, belyse funksjonen eller spesifisitet av enzymer fra metagenomes, og i medisiner, særlig i små laboratorier.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| StepOne real time PCR instrument | Life Technologies | 4376357 | DSF can be performed with many other instruments. The StepOne instrument has very convenient software for data analysis. |
| Protein thermal shift software v1.0 | Life Technologies | 4466037 | |
| MicroAmp Fast optical 48-well plates | Life Technologies | 4375816 | |
| Optical sealing tape | Life Technologies | 4375323 | Bio-rad part no. 223-9444 is an alternative supplier |
| U-bottomed 96-well plates | Fisher | 11521943 | |
| SYPRO Orange | Life Technologies | S6650 | For a smaller volume supplier, use Sigma part no. S5692 |
| SPSS statistics version 20 | IBM | Other statistics packages will provide similar functionality | |
| GraphPad Prism 6.02 | GraphPad | Other statistics packages will provide similar functionality | |
| Hand applicator (PA1) | 3M | 75-3454-4264-6 | |
| Hexokinase from Saccharomyces cerevisiae | Sigma-Aldrich | H5000 | |
| Glucose | Fisher scientific | 10141520 |
References
- Freyer, M. W., Lewis, E. A. Isothermal titration calorimetry: experimental design, data analysis, and probing macromolecule/ligand binding and kinetic interactions. Methods Cell Biol. 84, 79-113 (2008).
- Ladbury, J. E. Calorimetry as a tool for understanding biomolecular interactions and an aid to drug design. Biochem Soc Trans. 38, 888-893 (2010).
- Abdiche, Y., Malashock, D., Pinkerton, A., Pons, J. Determining kinetics and affinities of protein interactions using a parallel real-time label-free biosensor, the Octet. Anal Biochem. 377, 209-217 (2008).
- Pantoliano, M. W., et al. High-density miniaturized thermal shift assays as a general strategy for drug discovery. J Biomol Screen. 6, 429-440 (2001).
- Senisterra, G., Chau, I., Vedadi, M. Thermal denaturation assays in chemical biology. Assay Drug Dev Technol. 10, 128-136 (2012).
- Ericsson, U. B., Hallberg, B. M., Detitta, G. T., Dekker, N., Nordlund, P. Thermofluor-based high-throughput stability optimization of proteins for structural studies. Anal Biochem. 357, 289-298 (2006).
- Lo, M. C., et al. Evaluation of fluorescence-based thermal shift assays for hit identification in drug discovery. Anal Biochem. 332, 153-159 (2004).
- Nettleship, J. E., Brown, J., Groves, M. R., Geerlof, A. Methods for protein characterization by mass spectrometry, thermal shift (ThermoFluor) assay, and multiangle or static light scattering. Methods Mol Biol. 426, 299-318 (2008).
- Niesen, F. H., Berglund, H., Vedadi, M. The use of differential scanning fluorimetry to detect ligand interactions that promote protein stability. Nat Protoc. 2, 2212-2221 (2007).
- Geders, T. W., Gustafson, K., Finzel, B. C. Use of differential scanning fluorimetry to optimize the purification and crystallization of PLP-dependent enzymes. Acta Crystallogr Sect F Struct Biol Cryst Commun. 68, 596-600 (2012).
- Vedadi, M., et al. Chemical screening methods to identify ligands that promote protein stability, protein crystallization, and structure determination. Proc Natl Acad Sci USA. 103, 15835-15840 (2006).
- Davis, B. J., Erlanson, D. A. Learning from our mistakes: the 'unknown knowns' in fragment screening. Bioorg Med Chem Lett. 23, 2844-2852 (2013).
- Larsson, A., Jansson, A., Aberg, A., Nordlund, P. Efficiency of hit generation and structural characterization in fragment-based ligand discovery. Curr Opin Chem Biol. 15, 482-488 (2011).
- Scott, D. E., et al. Using a fragment-based approach to target protein-protein interactions. Chembiochem. 14, 332-342 (2013).
- Cimmperman, P., et al. A quantitative model of thermal stabilization and destabilization of proteins by ligands. Biophys. J. 95, 3222-3231 (2008).
- Matulis, D., Kranz, J. K., Salemme, F. R., Todd, M. J. Thermodynamic stability of carbonic anhydrase: measurements of binding affinity and stoichiometry using ThermoFluor. Biochemistry. 44, 5258-5266 (2005).
- Zubriene, A., et al. Measurement of nanomolar dissociation constants by titration calorimetry and thermal shift assay - radicicol binding to Hsp90 and ethoxzolamide binding to CAII. Int J Mol Sci. 10, 2662-2680 (2009).
- Weiss, J. N. The Hill equation revisited: uses and misuses. FASEB J. 11, 835-841 (1997).
- Cuccui, J., et al. Characterization of the Burkholderia pseudomallei K96243 capsular polysaccharide I coding region. Infect Immun. 80, 1209-1221 (2012).
- DeShazer, D., Waag, D. M., Fritz, D. L., Woods, D. E. Identification of a Burkholderia mallei polysaccharide gene cluster by subtractive hybridization and demonstration that the encoded capsule is an essential virulence determinant. Microb Pathog. 30, 253-269 (2001).
- Berman, H., Henrick, K., Nakamura, H. Announcing the worldwide Protein Data Bank. Nat Struct Biol. 10, 980 (2003).
- Vivoli, M., Ayres, E., Beaumont, E., Isupov, M., Harmer, N. Structural insights into WcbI, a novel polysaccharide biosynthesis enzyme. IUCr Journal. 1 (1), 28-38 (2014).
- Sorrell, F. J., Greenwood, G. K., Birchall, K., Chen, B. Development of a differential scanning fluorimetry based high throughput screening assay for the discovery of affinity binders against an anthrax protein. J Pharm Biomed Anal. 52, 802-808 (2010).
- Uniewicz, K. A., et al. Differential scanning fluorimetry measurement of protein stability changes upon binding to glycosaminoglycans: a screening test for binding specificity. Anal Chem. 82, 3796-3802 (2010).
- Wan, K. F., et al. Differential scanning fluorimetry as secondary screening platform for small molecule inhibitors of Bcl-XL. Cell Cycle. 8, 3943-3952 (2009).
- Koropatkin, N. M., Holden, H. M. Molecular structure of alpha-D-glucose-1-phosphate cytidylyltransferase from Salmonella typhi. J Biol Chem. 279, 44023-44029 (2004).
- Paleskava, A., Konevega, A. L., Rodnina, M. V. Thermodynamics of the GTP-GDP-operated conformational switch of selenocysteine-specific translation factor SelB. J Biol Chem. 287, 27906-27912 (2012).
