Ex vivo preparações da Intacta Vomeronasal Órgão e acessórios bulbo olfatório
Summary
O mouse do bulbo olfativo acessório (AOB) tem sido difícil de estudar, no contexto da codificação sensorial. Aqui, nós demonstramos uma dissecação que produz uma preparação ex vivo em que os neurônios AOB permanecem funcionalmente ligados às suas entradas periféricas, facilitando a investigação sobre o processamento de informações de feromônios e cairomônios rato.
Abstract
O sistema olfativo acessório rato (AOS) é um caminho sensorial especializado para detectar odores voláteis sociais, feromônios e cairomônios. O primeiro circuito neural na via AOS, chamado bulbo olfatório acessório (AOB), desempenha um papel importante no estabelecimento de comportamentos típicos do sexo, como a agressão territorial e acasalamento. Este circuito pequeno (<1 mm 3) possui a capacidade de distinguir estados comportamentais únicas, tais como sexo, tensão e estresse a partir de sugestões de quimio nas secreções e excreções de animais da mesma espécie. Enquanto a organização compacta deste sistema apresenta oportunidades únicas para a gravação de grandes porções do circuito ao mesmo tempo, a investigação de processamento sensorial no AOB continua sendo um desafio, em grande parte devido à sua localização experimentalmente desvantajosa no cérebro. Aqui, nós demonstramos uma dissecação de várias etapas que remove a AOB intacta dentro de um único hemisfério do crânio anterior mouse, deixando conectaríons para ambos os vomeronasais periférica neurônios sensoriais (VSNs) e circuitos neuronais locais intactos. O processo apresenta a superfície de MAA para dirigir a inspecção visual, facilitando electrofisiológico e gravações ópticas de AOB elementos de circuito, na ausência de anestésico. Após a inserção de uma cânula fina no órgão vomeronasal (VNO), que abriga os VSNs, pode-se expor diretamente da periferia de odores e feromônios sociais durante a gravação de actividade a jusante da AOB. Este procedimento permite investigações controladas em AOS processamento de informação, que pode lançar luz sobre mecanismos que ligam a exposição feromônio a mudanças no comportamento.
Introduction
Processamento sensorial no cérebro de mamíferos tipicamente se estende por vários circuitos neuronais reciprocamente conectados, cada um dos quais extrai as características particulares de estímulos sensoriais. Em vias sensoriais, processamento de informação precoce é vital para a percepção eo comportamento normal. No sistema olfativo acessório (AOS), o bulbo olfativo acessório (AOB) é o principal circuito neural que liga a periferia sensorial para estruturas a jusante que ditam o equilíbrio hormonal 1,2, agressão 3 e 4 excitação. Como tal, o processamento de informações dentro deste circuito está fortemente ligada a mudanças no comportamento animal.
O bulbo olfativo acessório está localizado em camundongos e ratos no aspecto dorsal / caudal / posterior do bulbo olfatório (MOB) sob o denso, vascularizado seio rinal. A AOB recebe inervação aferente de axônios dos neurônios sensoriais vomeronasais periférica (VSNs) que residem no órgão vomeronasal (VNO), um small tubo cego terminou no focinho anterior logo acima do palato mole. Estes axónios atravessar a folha de tecido delicado do septo no limite medial das passagens nasais. Vários estudos investigaram as respostas neurais AOB a fontes de odores AOS (tais como a urina de rato) in vivo com ratos anestesiados 5-7 ou animais livremente explorando 8. O heróico anestesiados estudos in vivo envolvidos (a) traqueostomia para garantir a anestesia profunda e evitar a aspiração de estímulos líquido 5-7, (b) de estimulação do gânglio cervical simpático 6 ou punção direta do órgão vomeronasal 5,7 introduzir odores voláteis e (c) com ou sem craniotomias ablações do lobo frontal para permitir o avanço do eléctrodo para o MAA 6. Awake / comportando estudos 8-10 implantação cirúrgica envolvida de um Microdrive. Em suma, esses paradigmas experimentais são poderosos, mas extremamente difícil e muitas vezes requer anestesia.
<p class = "jove_content"> Curiosamente, vários estudos tentaram manter estruturas sensoriais e circuitos neurais jusante vivos fora do corpo (ex vivo) com algum sucesso 11-15. Porque as conexões entre o VNO e AOB permanecer ipsilateral, e porque o tecido da linha média do septo pode ser exposto a superfusate oxigenado em um único hemisfério, buscou-se desenvolver uma abordagem ex vivo de um único hemisfério para isolar essas estruturas, mantendo sua conectividade funcional. Recentemente, conseguiu atingir esta meta 16. Esta preparação mantém tanto o VNO e AOB vivo e funcionalmente ligados por pelo menos 4-6 horas porque ambos os axônios (ao longo do tecido septal suave linha média) e AOB são relativamente rasas <600 mM recursos que são acessíveis a superfundidos oxigenado artificial líquido cefalorraquidiano ( ACSF). Este VNO-AOB ex vivo preparação permite a introdução de estímulos controlados para o VNO através de uma cânula fina, eacesso visual direto para a pequena AOB para a colocação do eletrodo-alvo e / ou microscopia de fluorescência ao vivo. Este método é vantajoso quando se deseja estudar estes circuitos na ausência de anestésico. Como essa abordagem rompe ligações centrífugas, não é bem adequado para investigações sobre a modulação da função centrífuga AOB. O VNO-AOB ex vivo preparação é difícil de aprender, mas uma vez alcançado produz uma plataforma confiável sobre a qual a investigar organização circuito, processamento de informação, e plasticidade neural neste circuito sensorial poderosa.Protocol
Representative Results
Discussion
O VNO-AOB ex preparação vivo descrito neste protocolo é uma alternativa útil para anestesiados in vivo 5-7 e fatia vivo agudo 17 experimentos de função AOB. Ao contrário de experimentos fatia AOB agudas, que também expõem elementos do circuito para registros eletrofisiológicos e ópticos, esta preparação mantém todos os aferentes sensoriais e conexões intra-AOB. Embora isso também pode ser dito de anestesiado em abordagens in vivo, a prese…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Esta pesquisa foi apoiada por R00 DC011780 (JPM: NINDS, NIH), F30 DC011673 (GFH: NINDS, NIH) e os fundos de inicialização UT Southwestern (JPM).
Materials
| Straight Scissors | Fine Science Tools | 14002-14 | |
| Fine Scissors-Straight | Fine Science Tools | 14060-10 | |
| Fine Scissors-Curved | Fine Science Tools | 14061-10 | |
| Adson Forceps | Fine Science Tools | 11006-12 | |
| #3 Scalpel Handle | Fine Science Tools | 10003-12 | |
| #11 Scalpel Blades | Fisher Scientific | 3120030 | |
| Straight Carbon Steel Razor Blades | Fisher Scientific | 12-640 | |
| 35 mm Petri Dish | Fisher Scientific | 08-772-21 | |
| Dissection Chamber | Custom | N/A | See Fig. 1 |
| Delrin plastic plank 0.6 cm x 1.5 cm x 0.1 cm | Custom | N/A | |
| Dow Corning Silicon Vacuum grease | Fisher Scientific | 146355D | |
| #5 Forceps, Student | Fine Science Tools | 91150-20 | |
| #5 Forceps, Biologie Tip | Fine Science Tools | 11295-10 | |
| #5 Forceps, Student | Fine Science Tools | 91150-20 | |
| Vannas Spring Scissors | Fine Science Tools | 15000-08 | |
| 0.0045" Polyimide Tubing | A-M Systems | 823400 | |
| 1/16" Male Luer | Cole-Parmer | EW-45505-00 | |
| 1/16" Tubing | Fisher Scientific | 14-171-129 | |
| Two ton epoxy | Grainger | 5E157 | |
| ValveBank Pressurized Perfusion Kit | AutoMate Scientific | 09-16 | |
| ValveLink digital/manual controller | AutoMate Scientific | 01-18 | |
| NaCl | Sigma-Aldrich | various | |
| KCl | Sigma-Aldrich | various | |
| CaCl2 dihydrate | Sigma-Aldrich | various | |
| MgCl2 hexahydrate | Sigma-Aldrich | various | |
| NaHCO3 | Sigma-Aldrich | various | |
| NaH2PO4 | Sigma-Aldrich | various | |
| myo-inositol | Sigma-Aldrich | various | |
| Na-pyruvate | Sigma-Aldrich | various | |
| Na-ascorbate | Sigma-Aldrich | various | |
| HEPES buffer | Sigma-Aldrich | various | |
| glucose | Sigma-Aldrich | various |
References
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