En integrert pakke med bildeteknikker har blitt brukt for å bestemme polypp morfologi og vev struktur i Karibia koraller Montastraea annularis og M. faveolata. Fluorescens, serie blokk ansikt, og to-foton konfokal laser scanning mikroskopi har identifisert lobate struktur, polypp vegger, og estimert chromatophore og zooxanthellae tettheter og fordelinger.
En integrert pakke med bildeteknikker har blitt brukt for å bestemme den tredimensjonale (3D) morfologi og cellestruktur av polypp vev bestående Karibia rev bygningen koraller Montastraea annularis og M. faveolata. Disse metodene inkluderer fluorescens mikroskopi (FM), serie blokk ansiktet imaging (SBFI), og to-foton konfokal laser scanning mikroskopi (TPLSM). SBFI gir dype vev bildebehandling etter fysisk seksjonering; Det detaljer vev overflatestruktur og 3D-visualisering til vev dybder på mer enn 2 mm. Komplementær FM og TPLSM avkastning ultra-høyoppløselige bilder av vev cellestruktur. Resultatene er: (1) identifisert tidligere har vært rapportert fliket vev morfologier på den ytre vegg av individuelle korall polypper, og (2) skapte de første overflatekart av 3D-fordeling og tetthet av vev chromatophores og algelignende dinoflagellate zooxanthellae endosymbionts. Spectral absorpsjon ertks 500 nm og 675 nm på henholdsvis, antyder at M. annularis og M. faveolata inneholde lignende typer klorofyll og chromatophores. Imidlertid, M. annularis og M. faveolata oppviser betydelige forskjeller i vevet tetthet og 3D fordeling av disse viktige cellulære komponenter. Denne studien fokuserer på avbildningsmetoder indikerer at SBFI er svært nyttig for analyse av store mm-skjellprøver av decalcified korall vev. Gratis FM og TPLSM avsløre subtile Submillimeter skala endringer i mobilnettet fordeling og tetthet i nondecalcified korall vevsprøver. Den TPLSM teknikken gir: (1) minimalt invasiv prøvepreparering, (2) overlegen optisk snitte evne, og (3) minimal lys absorpsjon og spredning, samtidig som tillater dype vev avbildning.
Global oppvarming og medfølgende miljøendringer er direkte påvirker helse og fordelingen av tropiske marine koraller 1-4. Flere virkninger blir observert, inkludert korallbleking og fremveksten av smittsomme sykdommer 5-6. Imidlertid vil mer nøyaktig prediksjon av fremtidig korall svar på disse miljøtrusler krever at en histologisk "baseline" etableres, som definerer vev morfologi og celle sammensetning og fordeling for "tilsynelatende friske" koraller. I sin tur, "påvirket" koraller kan deretter kvantitativt forhold. Videre bør dette baseline etableres for tilsynelatende friske koraller under en rekke miljøforhold, slik at "sunn reaksjon" kan også måles på tvers av miljø gradienter. Som et første skritt mot å etablere denne baseline, har en høyoppløselig 3D studie foretatt av hvordan tilsynelatende sunn koraller polypp vevmorfologi og cellulær sammensetning reagerer på økninger i vanndybde (WD) og tilhørende reduksjon i sollys irradians. Resultatene kan så brukes til å etablere en mer omfattende forståelse av mekanistisk korall tilpasning, samt å få innsikt i korall-symbiont evolusjon og forbedring av lys høsting.
Steinkoraller (Scleractinia) er koloni marine virvelløse dyr som spiller vertskap for en kompleks samling av andre mikroorganismer, kollektivt referert til som koraller holobiont 7-10. Forskningen foretatt i denne studien søker å bruke en pakke med cutting-edge imaging teknologi å samtidig spore endringer med økende vanndyp i vevet pigmenter og symbiotisk zooxanthellae av tilsynelatende friske verts koraller. Dette vil etablere den nødvendige sammenlignende vev celle "baseline" over en batymetrisk gradient for tilsynelatende friske koraller og fungere som indikatorer på koraller heaLTH 10. Korall pigmenter, kalt chromatophores, handle for å absorbere, reflektere, scatter, brekker, diffract, eller på annen måte forstyrre hendelsen solstråling 11. Den zooxanthellae-chromatophore endosymbiotic forholdet har aktivert coevolution strategisk fordelaktig lys-høsting optimalisering og skjelettvekststrategier, samt trofiske plastisitet (skiftende fôringsstrategier back-og-tilbake fra autotrophy å heterotrophy) for koraller dyr 12.
Den sørlige karibiske øya nasjon av Curaçao (tidligere en del av De nederlandske Antillene) ligger ca 65 km nord for Venezuela i øst-vest trending Aruba-La Blanquilla skjærgården (figur 1A). Den 70 km lange sørkysten av Curaçao inneholder en kontinuerlig moderne og miocen-pliocen-pleistocen-Holocene gamle fringing korallrev kanalen 13,14. Gjennomsnittlig årlig SST på Curaçao varierer ca 3 ° C enett år om gangen, alt fra et minimum på 26 ° C i slutten av januar til maksimalt 29 ° C i begynnelsen av september, med en gjennomsnittlig årlig temperatur på 27,5 ± 0,5 º C (NOAA SST datasett, 2000-2010). Korallrevet ved Playa Kalki (12 ° 22'31.63 "N, 69 ° 09'29.62" W), liggende nær nordvestspissen av Curaçao (figur 1A), ble valgt for prøvetaking fordi det har vært tidligere godt studert og marine økosystem på dette stedet er badet i frisk nonpolluted sjøvann 7,15-19. . To nært beslektede scleractinian korallarter, M. annularis og M faveolata, ble valgt for eksperimentering og analyse i denne studien fordi hver art: (1) utstillinger distinkt forskjellige og nonoverlapping batymetriske distribusjoner på rev veiene med hensyn til sokkelen pause og assosiert karbonat sedimentære avsetningsmiljø (M. annularis range = 0-10 m WD; M. faveolataområde = 10-20 m WD 20; figurene 1B, 2A og 2B); (2) er en vanlig korallrev rammeverk byggmester hele det karibiske hav 21; og (3) har godt studert økologiske, fysiologiske, og evolusjonære relasjonene 22.
Feltet prøvetaking for denne studien ble gjennomført ved hjelp av standard dykking teknikker offshore av Playa Kalki på Curaçao. Et grunt til dypt vann batymetriske transekt ble etablert som kjørte over sokkelen, over sokkelen pause, og inn i de dype vann forgrunnen rev miljøer. Tilsynelatende friske koraller hoder ble deretter identifisert for prøvetaking langs denne batymetrisk transektet, inkludert: (1) tre individuelle ~ 1 m diameter korallhoder M. annularis, som alle var på 5 m vanndyp (WD); og (2) tre individuelle ~ 1 m diameter korallhoder M. faveolata, som alle var på 12 m WD. Photosynthetically aktiv stråling (PAR) ble målt som 33-36% PAR ved 5 m WD og 18-22% PAR på 10 m WD. Prøvetakingen ble utført i januar når SST var 26 ° C ved vanndybder på både 5 m og 12 m. Hver av disse seks koraller hoder ble samplet i tre eksemplarer på tilsvarende romlige posisjoner (ie., Ca 45 ° N breddegrad på hver av de seks halvkuleformet koraller hoder). Hver enkelt prøve besto av en 2,5 cm diameter korall vev-skjelett kjerne biopsi som ble samlet inn med en renset bue punch. Tre koraller vev-skjelett biopsier ble samplet på standard SCUBA med hansker fra hver av de korallhoder (9 fra M. annularis kolonier ved 5 m WD og 9 fra M. faveolata på 12 m WD). Umiddelbart etter innsamling på dybde, ble hver biopsi kjerneprøve plasseres i et sterilt 50 ml sentrifugerør av polypropylen, skrue-toppen forsegles, og returneres til overflaten. Sjøvannet ble dekantert fra hvert sentrifugerør og hver kjernebiopsi ble deretter nedsenket, lagres og transporteres i 4% paraformaldehyd.
<p class="Jove_content"> SBFI bildebehandling har tidligere blitt utført på et bredt spekter av biologiske prøver, inkludert hel-hjerne og hel-hjertet menneskelig vev, intakte mus embryoer, sebra fisk embryoer, og flere typer dyr prøver med intakte bein 23-30. De fleste av disse studiene benyttet optisk / lysmikroskopi med enten fluorescens eller lyse feltteknikker. Men studier har blitt utført ved ultra-høy forstørrelse ved hjelp av scanning elektronserie blokk ansiktet bildebehandling i det siste 31. I denne studien har en modifisert SBFI protokoll utviklet for og brukes på koraller for første gang. Fordi M. annularis og M. faveolata korall polypper er 1-2 mm i tykkelse, ville ingen av de rutinemessige lysmikroskopi teknikker være i stand til å trenge inn i hele tykkelsen av koraller polypp vev. Derfor har vi SBFI prøveopparbeidelse protokollen spesielt utviklet for korallprøver. I tillegg har vi tilpasset designet en stereo holder, Som er motorisert for å bevege seg i både x og y-retningene. Denne anordning tar bilder av blokken flate av prøven i stedet for å samle delene ved hjelp av en vanlig mikrotomen i front av mikroskop. Vi har også innført en annen ikke-lineære optiske to-foton mikroskopisk teknikk for å bli det same koraller polypper over hele tykkelsen av koraller vev. Dette overvinner de begrensninger som følger av SBFI i form av decalcification og muligheten for endringer i vev morfologi og volum (krympende) som kan induseres av behandlingsprotokoller prøveopparbeidelse (dehydrering) og. Videre ble utslipps profiler fra korallene spektralt vedtatt å identifisere sine peak utslipp og variasjoner mellom chromatophores og fotosyntese zooxanthellae. Disse resultatene ble vurdert i sammenheng med den metode som brukes, og deres individuelle fordeler med hensyn til anskaffelses tid, analyse tid, og evnen til å løse gode strukturelle detaljer uten at structural integritet av koraller vev.Korallrev forskning er en svært tverrfaglig forskningsinnsats, som involverer analyse av samtidige fysiske, kjemiske og biologiske fenomener som opererer i det marine miljø. Studiet av komplekse korallrev økosystemer er derfor best ferdig i løpet av noen 'Powers of Ten' kontekstuelle rammeverk (Figur 10). Denne grafisk sammenstilling illustrerer at korall økosystem dekker et bredt spekter av romlige dimensjoner (10 -9-10 5 m). Videre illustrerer denne øvelsen at geobiological an…
The authors have nothing to disclose.
We thank Donna Epps, histologist at Institute for Genomic Biology, University of Illinois Urbana-Champaign (UIUC), for her capable technical assistance in sample preparation and sectioning. This work was supported by a research grant to B.W. Fouke from the Office of Naval Research (N00014-00-1-0609). In addition, C.A.H. Miller received grants from the UIUC Department of Geology Wanless Fellowship, UIUC Department of Geology Leighton fund and UIUC Department of Geology Roscoe Jackson fieldwork fund. Interpretations presented in this manuscript are those of the authors and may not necessarily represent those of the granting institutions. We also thank the Caribbean Research and Management of Biodiversity (Carmabi) laboratory on Curaçao for their support and collaboration in collecting the coral tissue biopsy samples. We thank Claudia Lutz, IGB Media Communication Specialist for her able language correction.
Coral Tissue Skeleton | None | None | 2.5 cm Biopsy from natural habitat |
Arch Punch Coring Device | C.S. Osborne and Company | No. 149 | For Coral biopsy collection |
Paraformaldehyde | Electron Microscopy Sciences | RT 15700 | 16% Pre-diluted |
Histoclear/Safeclear II | Electron Microscopy Sciences | RT 64111-04 | Non-Toxic alternate to Xylene, Dehydration and Deparafinization |
Xylene and Ethanol | Fisher Scientific | Fisher Scientific | Dehydration |
Paraffin Wax | Richard Allen Scientific | Type H REF 8338 | Infiltration solution |
Vybar | The Candle Maker | None | Component of Red Wax |
Stearin | The Candle Maker | None | Component of Red Wax |
Sudan IV | Fisher Chemical | S667-25 | Red Wax-Opaque background |
Wheat Germ Agglutinin (WGA) | Life Technologies | W32466 | For labeling Coral Mucus |
Prolong Gold | Life Technologies | P36095 | Anti-fade mounting media |
Fluoro Dish | World Precision Instruments | FD-35-100 | For two-photon imaging |
XY Motor, Driver and Controller | Lin Engineering | 211-13-01R0, R325, R256-RO | XY Translational Movement |
Hot Plate | Corning | DC-220 | Melting all wax |
Convection Oven | Yamato | DX-600 | Infiltration and Embedding |
Tissue Processor | Leica | ASP 300 | Dehydration, Infiltration |
Microtome | Leica | RM2055 | Disposable knifes |
Stereo Microscope | Carl Zeiss | Stereolumar V 12 | 1.5x (30 mm WD) Objective |
Fluorescence Microscope with ApoTome | Carl Zeiss | Axiovert M 200, ApoTome I System | Imaging thin section of a polyp: Zooxanthellae |
Axiocam camera | Carl Zeiss | MRm | Monochrome camera 1388×1040 pixels |
Axiovision Software | Carl Zeiss | Version 4.8 | Image acquisition program |
Two-Photon Laser | Spectraphysics | Maitai eHP, pulsed laser (70 fs) | With DeepSee module |
Laser Scanning Microscope | Carl Zeiss | LSM 710 with Spectral Detector | 34 channel PMT detection |
Zen Software | Carl Zeiss | 2010 or above | for two-photon and spectral image acquisition |
Imaris Suite Software | Bitplane, Inc., | Version 7.0 or above | 3D Volume, Iso-surface Rendering, Visualization |