Introduction
上皮間葉転換（EMT）は、胚発生の間に臓器の形態形成や組織リモデリングを駆動発生プログラムです。異常に活性化されると、EMTは腫瘍転移および臓器線維症1,2を推進しています。説得力のある研究はcobble-が失われ、接着結合タンパク質E-カドヘリンの発現を抑制するなどのツイスト、カタツムリ、およびZEBなどのいくつかの転写因子、によって定義されたEMT過程において転写調節の重要性を記載している上皮形態と紡錘形の間葉表現型3-8のゲインのような石。 RNAのゲノムワイド解析による最近の研究では、スプライシングパターン上皮または間葉表現型9,10のいずれかと関連している遺伝子群が存在することを明らかにした。私たちの研究室からの作業は、機能的に選択的スプライシングとEMTを接続。細胞表面接着分子CD44を研究することによって、私たちはCD44 alternことが実証されativeスプライシングは、しっかりとEMTの間に規制され、より重要なのは、因果的に切り替えることがCD44スプライスアイソフォームは11 EMTに貢献します。
ヒト多エキソン遺伝子の95％までは、あるいは12〜14にスプライシングされる選択的スプライシングは、遺伝子調節の普及と保存されたモデルを表す。単一の遺伝子から複数のタンパク質産物を生成することにより、選択的スプライシングは、ヒトゲノムの複雑さの別の層を追加すること、タンパク質の多様性のために必須の機構を構成する。このように、選択的スプライシングの調節不全は、潜在的にヒトの疾患の原因となる重大な生物学的効果につながる可能性があります。実際、疾患における異常な選択的スプライシングはスプライソソーム機構をコードする遺伝子の変異は、一般的に骨髄異形成症候群26-28に見られる最近の知見を含め、十年以上15-25文書化されています。従って、選択的にスプライシングされたiを検出するための信頼できる方法を開発するsoforms EMTを含む多様な生物学的プロセスの研究に非常に重要である。
ここでは、誘導性EMTモデルを用いて選択的スプライシングの変化を検出するためのプロトコルを提供する。 PCRプライマーを設計し、スプライスアイソフォームを検出するための方法は、EMTの間の選択的スプライシングの研究のためだけでなく、他の生物学的プロセスにおける選択的スプライシングの研究のためのみならず、適当である。 EMTの間に選択的スプライシングを調査することは、より良い、癌の転移を治療するための効果的な戦略の開発を促進し、EMTおよび腫瘍転移のメカニズムを理解するために不可欠である。
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Protocol
EMT誘導の1。細胞培養
注：EMTは、上皮細胞におけるTGFβの治療または転写因子ツイストの異所性発現、カタツムリ、またはZEB1 / 2によって誘導することができる。このプロトコルで9,11,29不死化ヒト乳房上皮細胞（HMLE /ツイスト-ER、博士Jヤン、UCSDの贈り物）でのツイスト-ER融合タンパク質の発現を介して誘導性EMTシステムについて説明する。 4 -ヒドロキシタモキシフェン（TAM）処理すると、融合タンパク質ツイスト-ERは12〜14日9,11,29フルEMT遷移に転写し、その結果を駆動するために核に移行。そのようなHMLE /カタツムリ-ER、HMLE /TGFβ、およびMCF10A /TGFβのような追加のEMT誘導系は、これまでの出版物11,30に記載されています。
- 5％のCO 2で37℃のインキュベーター内で無血清乳房上皮細胞成長培地（MEGM）にHMLE /ツイスト-ER細胞を維持します。継代の細胞を2〜3日毎にそれらを80％コンフルエンスに達したとき。 5〜10分間、37℃で0.15％トリプシンで細胞をインキュベートし、次いで、5％ウシ血清/ DMEMでトリプシンを不活性化する。細胞をスピンダウンし、MEGMで再懸濁します。 1〜4個の割合で新しい組織培養皿で細胞をプレート。
- 200μMの溶液を作製するためにエタノールにTAMに溶解する。 -20℃で、光とストアからTAMを保護します。 20 nMのTAMの最終濃度を作るために10,000希釈：使用前に、たて1でMEGM培地にTAMを追加します。
- EMTの誘導のために、重複して10cmの組織培養皿に1.6×10 6 HMLE /ツイスト-ER細胞をプレート。 20 nMのTAM含有MEGM培地で培養細胞。
- 重複して10cmディッシュにプレート1.6×10 6 HMLE /ツイスト-ER細胞と非TAM処理の対照として0.01％エタノールで細胞を処理。
- 二日間のインキュベーション後に、細胞の形態学的変化を記録するために10倍の倍率で光学顕微鏡下で写真を撮る。
- 制御の一皿から培地を吸引したりTAM処理された細胞。 RNA単離およびタンパク質分析のためのRIPAバッファー中で、残りの半分のためのRNA溶解緩衝液中にプレートの半分を廃棄することにより、冷PBSで細胞を、収穫細胞を洗浄する。
- 重複して10cmディッシュにおける再メッキ1.6×10 6細胞による制御またはTAM処理した皿から継代細胞。連続して20 nMのTAMや車両で細胞を処理する。
- 繰り返しますビヒクル処置対照細胞が敷石状の上皮形態を維持する一方で、その時点で、TAM処理されたツイスト-ER細胞は、紡錘状の間葉の形態を示し、14日目まで5回隔日〜7を繰り返します。
EMTの2キャラ
注：EMTの完了は次式で示されます。紡錘状の線維芽細胞のような外観に石畳状の上皮形態から（1）細胞の形態学的変化; （2）細胞間結合におけるE-カドヘリンの局在の喪失;損失によって定義されたEMTマーカーの（3）切り替え式上皮マーカーおよび間葉マーカーのゲイン。
細胞形態学的変化がEMT誘導の時間経過の間に10倍の倍率で光学顕微鏡によって捕捉され、細胞接合部におけるE-カドヘリンの節で説明1免疫蛍光検出は、このセクションに記載されている。 EMTマーカーの発現を免疫ブロット法によって検出される。一般的な上皮マーカーはE-カドヘリン、γ-カテニン、およびオクルディンであり、間葉マーカーは、フィブロネクチン、N-カドヘリンおよびビメンチンを含む。イムノブロット法の一般的な手順は、セクション4で説明されている。
- TAM処理、種子を24ウェルプレートのウェルに入れ12mmのガラスの円形カバースリップ上で1×10 5細胞の12日目に。
- 48播種後時間、吸引媒体及び予め温めPBSで細胞を洗浄する。
- 15分間予め温め、4％パラホルムアルデヒドで細胞を固定します。
- PBSで細胞を3回洗浄する。
- 15のためにPBS中0.2％トリトンX-100で細胞をインキュベートRTで分。
- PBSで細胞を3回洗浄する。
- 非特異的結合をブロックするために室温で1時間、5％BSA / PBSで細胞をインキュベートする。
- 加湿チャンバーOの中で/ N 4℃で1％のBSA / PBSで1:50に希釈した一次抗体、E-カドヘリンと細胞をインキュベートします。注：一次抗体の希釈の範囲は1時50分〜1の間、通常は次のとおりです。200、および各抗体のための最適な希釈は、実験的に決定されるべきである。
- 一次抗体をデカントし、PBSで細胞を3回洗浄する。
- RTで1時間500希釈：1中の蛍光標識二次抗体で細胞を培養する。この段階からは、光から細胞を保護する。
- 二次抗体をデカントし、PBSで3回洗浄する。
- 10分間の0.1〜1グラム/ mlのDAPIまたはヘキストで染色細胞。
- PBSで細胞を3回洗浄します。
- マウントはマニキュアと封入剤の液滴と、シールカバースリップでカバースリップ。
- 細胞を観察し、取る63X蛍光顕微鏡画像。
付加的な抗体を用いた染色は、EMT表現型を確認するために行うことができる。例えば、N-カドヘリンおよびα-平滑筋アクチンは、間葉表現型29,31,32のために染色することができる。細胞骨格構造の再編成は、F-アクチン11ファロイジンで細胞を染色することによってモニターすることができる。また、細胞運動性および細胞死抵抗性についてのアッセイは、EMT 11の特性を調べるために行うことができる。
定量RT-PCRアッセイを用いて検出スプライスアイソフォームの3。
- プライマー設計
注：プライマー対は、慎重に異なるスプライスアイソフォームを増幅するように設計されるべきである。エクソンは、最も一般的に観察された選択的スプライシングイベントをスキップし、プライマー設計の戦略を説明するために例として示されている。 図1Aは、可変エクソンのような第三のエクソンと4つのエクソンプレmRNAを示している。エクソンの包含3結果エクソン3のスキッピングのに対し、より長いスプライスアイソフォームの生産は、短いスプライスアイソフォームを生成します。プライマーは、エクソン3に含まれるアイソフォームおよびエクソン3スキップさアイソフォームを区別するために、およびこのmRNAの全転写産物を検出するように設計される必要がある。- エクソン包含を検出するために、慎重に可変エクソン含まアイソフォームの特異的増幅を可能にする、可変エクソン3、近隣の構成的エクソン4内のリバースプライマー内部フォワードプライマーを設計します。フォワードの両方を設計し、ゲノムDNAまたはプレmRNAから増幅されたPCR産物を避けるために、同じ変数エクソン内のプライマーをリバースしないようにしてください。
- 特にエクソンスキッピングイベント、変数エクソン3が含まれている場合には他の方法で破壊される構成的エクソン2及びエクソン4の接合部にまたがるプライマーの設計1を増幅した。このように、構成的エクソン4内の他のプライマーを設計し、PCR産物は、可変エクソン3がexcludである場合にのみ生成されますエドと構成的エクソン2及びエクソン4は、続いて接合されている。
- 遺伝子の全転写物を検出するために、したがって、2つの構成のエクソン1及び2内のプライマーを設計し、PCR産物は、すべてのアイソフォームから増幅される。
- 必ず全てのプライマーの融解温度（Tm）が約55°C、各プライマーの長さは約18〜22ヌクレオチドであることを確認し、PCR産物のサイズは80〜150塩基対である。
- RNA抽出：全RNA単離キットを用いてRNAを抽出し（材料の表を参照）。
- 350μlのRNA溶解バッファーで細胞を回収します。
- 溶解物に70％エタノール350μl添加し、十分に混合します。
- RNA精製カラムにサンプルを転送します。
- 1分間のを10,000×gで遠心し、フロースルーを捨てる。
- RNA洗浄緩衝液IIで二度私は、RNAの洗浄緩衝液500μlで一回カラムを洗浄して。
- 残留するRNA洗浄バッファーを削除する2分間最高速度で遠心分離することにより、カラムからII。
- 新しい1.5 mlチューブにカラムを移し、カラムマトリックスの中央に50μlのヌクレアーゼフリー水を添加し、最高速度で遠心分離してRNAを溶出する。
- 第一鎖cDNAの合成
- UV吸収測定によりRNAの濃度と品質を決定します。注：良質のRNAは、約2.0の260nmで/ 280 nmの吸光度比を持つ必要があります。
- 20μlの最終容量中250 ngの全RNA、0.05μgのランダムヘキサマープライマー、50pmolのMgCl 2を 、10ピコモルのdNTP、2μLの5×GoScriptバッファー、及び1μlのRT酵素が含まれている逆転写酵素（RT）反応を設定します。
- RT酵素を不活性化するために5分間70℃でインキュベートし、1時間、42℃でRT反応を行います。
- リアルタイムPCR
- 10μlのSYBRグリーンマスターミックスで構成されて20μlの反応を設定し、0.1〜1.0μlのcDNAテンプレート、および5フォワードピコモルおよびリバースプライマー。
- 以下のステップを40サイクルでリアルタイムPCRを実行します。95℃の変性を10秒、10秒、58℃のアニーリング、および30秒間60℃の拡張のために。三重でPCR反応を実行します。
- 解離曲線を確認し、単一のピークが各プライマーセットについて観察されることを確認してください。
- 増幅曲線の二次導関数値を計算することによって定量化サイクル（CQ）値を得る。
- 「デルタデルタはCq（ΔΔCq） 'は、次式に示すような方法を使用して、非誘導サンプルと比較して、誘導されたサンプル中の標的mRNAの相対量（RQ）を算出する。参照として、そのようなGAPDHまたはTBPのようなハウスキーピング遺伝子を使用します。
より正確にスプライスアイソフォームの相対値を算出し、tの彼は考慮されるべき複数の参照遺伝子の使用。結果は、Pfaffl ら 33,34により記載された修飾絶対値の定量法を用いて分析することができる。
タンパク質レベルでのスプライスアイソフォームの4。審査
- 100μlの氷冷したRIPA緩衝液中で細胞を回収します。
- 約10分間、氷上で溶解物を設定してください。
- 4°Cで10分間14,000×gで遠心分離し、上清を収集する。
- ブラッドフォードアッセイによってタンパク質濃度を測定する。
- SDSローディング緩衝液中のタンパク質試料を希釈し、10％SDS-PAGEゲル中のタンパク質の20〜40μgのを読み込む。
- 1.5時間20mAでSDS-PAGEゲルを実行します。
- 85 V.で3時間、4℃での湿式転送システムでPVDF膜へトランスファータンパク質は、標的タンパク質の分子量に応じて転送時間を調整する。
- RTで1時間30分間、5％無脂肪乳でブロック膜。
- メンブレンWIインキュベート4℃のCO / Nにおける一次抗体番目。 200〜1：5000、実験的に各抗体のための最適希釈を決定する一次抗体の希釈の範囲は、通常1との間である。このプロトコルで使用される抗体の希釈は、「特定の試薬や機器一覧表」に記載されています。
- スプライスアイソフォームを検出するために、特定のアイソフォームを認識する特異的抗体を使用しています。別の方法として、構成的エクソンコード領域中のエピトープを認識する抗体を使用し、それらの異なるタンパク質の大きさに基づいて、同時にスプライスアイソフォームを検出します。
- 同時に、EMTマーカーについて免疫ブロッティングによりEMTを監視します。間葉系マーカーとして使用するE-カドヘリン、γ-カテニン、および上皮マーカーとしてオクルディン、およびフィブロネクチン、N-カドヘリンおよびビメンチン。
- 5分間隔でTBS-T（50mMのトリス、150mMのNaCl、0.05％ツイーン20、pH7.4）で洗浄膜は三回。
- HRP結合二次蟻を有する膜をインキュベートRTで1時間10,000希釈：1 ibody。
- 5分間隔でTBS-Tで洗浄膜は三回。
- 化学発光検出システムを用いてタンパク質を可視化し、オートラジオグラフィーフィルムに膜を公開します。
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Representative Results
上記の手順は、EMTの間に選択的スプライシングを検出するための堅牢な方法を提供する。ツイストに誘導されるEMT時のCD44スプライスアイソフォームの切り替えの代表的な結果は、一例として以下に示す。
HMLE /ツイスト-ER細胞でのツイストによって誘導されるEMTは、細長い線維芽細胞表現型への上皮表現のような石畳、石からの移行（ 図2A）、上皮マーカーE-カドヘリン、γ-カテニンとオクルディンとの欠如によって特徴づけられた間葉マーカーフィブロネクチン、N-カドヘリン、およびビメンチン（ 図2B）のアップレギュレーション。さらに、EMTは、細胞-細胞間結合（ 図2C）におけるE-カドヘリンの局在の消失によって評価した。
EMT中のCD44スプライスアイソフォームの切り替え式は定量RT-PCRおよび免疫ブロッティングによって調べた。ヒトCD44遺伝子は、9変数のエクソンから構成されている。 CD44の選択的スプライシングは、プロへの細胞が可能に少なくとも一つの可変エクソン、及び全ての可変エキソンを欠くCD44標準（CD44sの）を含む首領CD44変異体（CD44vは） 図3Aは、さまざまなCD44スプライスアイソフォームの検出のためのプライマー設計の戦略を示している。リバースプライマーは、V5とV6変数を含むCD44vスプライスアイソフォームの検出のために構成的エクソン5と6の間の接合部にまたがるながらエクソンスキップされ、製品のCD44sのを検出するために、フォワードプライマーは、構成的エクソン5に位置していますエクソン、フォワードおよびリバースプライマーは、それぞれ、V5およびV6内で設計されています。他のCD44可変エクソンを含有するアイソフォームの検出のためのプライマーは、同じ戦略を用いて設計することができる。さらに、総CD44転写物は、前方使用して構成的エクソン2およびエクソン3であった（ 図3A）に位置する逆方向プライマーを検出する。図3Bに示すように、定量RT-PCRは、これらのプライマーセットを利用してCDの有意な減少を示した分析44V mRNAおよびツイスト-ER発現HMLE細胞中のTAM治療の14日後のCD44sのmRNAの増加。これとは対照的に、CD44の総転写物は、EMT（ 図3C）の間に変化しないままであった。 CD44sのタンパク質の発現が大幅に（ 図3D）をアップレギュレートされたのに対し、定量RT-PCRの結果と一致して、CD44vのタンパク質レベルは、著しく減少した。したがって、CD44の主要なアイソフォームは、EMTの過程ではCD44sにCD44vからシフトした。
図1。プライマーの設計。エクソンスキッピングモデルでスプライシングアイソフォームを検出するためのプライマーの位置を示す模式図。灰色のボックスは、構成的エキソンを表し、オレンジ色のボックスは、可変エキソンを表し、ボックスを連結する細い線はイントロンを示す。プライマーの位置はindicatです矢印によって編：黒い矢印は、全mRNAを検出するためのプライマーセットを示し、オレンジ色の矢印は、エクソン含まアイソフォームを増幅するためのプライマーセットを示し、青色の矢印は、エクソンスキッピングアイソフォームを検出するためのプライマーセットを示している。
EMTの2誘導図。 HMLE /ツイスト-ER細胞におけるEMTマーカーの（A）の位相差画像（10X）の前（未処理）HMLE /ツイスト-ER細胞の形態学的変化を示すとTAM治療の14日後（B）イムノブロット分析（未処理）の前にとTAM治療の14日後。 TAM処理、ダウンレギュレートされた上皮マーカーE-カドヘリン、γ-カテニン、およびオクルディン、および間葉マーカーのフィブロネクチン、N-カドヘリン、およびビメンチンの際にアップレギュレートされた。（C）免疫蛍光画像（63X）、E-カドヘリンの喪失を示すTAM治療の14日後に細胞間結合での局在。緑色の染色はE-カドヘリンを示し、DAPI染色（青色）は核を示している。スケールバー=10μmである。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
EMT中のCD44スプライスアイソフォームの図3。スイッチ。 （A）CD44スプライスアイソフォームの検出のためのプライマー設計。灰色のボックスは、構成的エキソンを表し、オレンジ色のボックスは、可変エキソンを表し、ボックスを連結する細い線はイントロンを示す。プライマーの位置は矢印で示されている：黒矢印はCD44全mRNAを検出するためのプライマーセットを示し、オレンジの矢印はCD44v5-6を増幅するためのプライマーセットを示し、青色の矢印はプライマーセットを示すCD44sのを検出する。（B、C）は、具体的にCD44v、可変エキソンv5のとv6（v5の/ 6）およびCD44sの（B）、およびCD44全mRNAを含む検出EMTのプライマーを用いた時のCD44アイソフォームのレベルを、定量RT-PCR分析（C） 。デイにおけるmRNAの相対的発現レベルは14細胞は、TAMにおける0細胞は、処置対応する日と非処理群に正規化した。エラーバーはSEMを示す; HMLE /ツイスト-ER細胞におけるTAM誘発性EMT時のCD44アイソフォームのN = 3（D）イムノブロット分析。 E-カドヘリンとN-カドヘリンのレベルは、EMT状態を識別するためにモニターした。
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Discussion
ここで説明する手順は、誘導性EMTモデルにおける選択的スプライシングの検出を可能にする。このように、スプライスアイソフォーム発現の動的変化は、EMTの時間経過を通して捕捉することができる。非関連の細胞株とは異なる遺伝的背景が過度選択的スプライシングに影響を与える可能性があるため、この方法は、選択的スプライシングの比較のために異なるepithelial-または間葉表現する細胞株の使用よりも利点を有する。選択的スプライシングの変化について何らかの結論を引き出すことができる前に、しかし、EMTをうまく誘導は慎重にさまざまなEMTマーカーを使用して確認する必要があります。さらに、ここで説明するツイスト-ER誘導性EMTシステムに加えて、カタツムリ-ERまたはTGFβによって誘導されたもののような他のEMTシステムが実験結果11,30の検証のために推奨されている。
EMTの間のスプライスアイソフォームの切り替えは、RNAおよびタンパク質レベルの両方で検出することができる。スプライスイソフォーム特異的抗体は、タンパク質分析のために好ましい。アイソフォーム特異的抗体が利用できない場合、スプライスアイソフォームのタンパク質レベルは、免疫ブロッティングSDS-PAGE上でそれらの分子量に基づいて決定することができる。各アイソフォームのRNAレベルは、アイソフォーム特異的プライマーによって定量することができる。定量RT-PCRアッセイを用いて、各アイソフォームの倍変化は、高感度かつ正確に判定することができる。そのような臨床試料中の特定のスプライスアイソフォームの発現を分析するように、実験材料が限られているとき、特に、定量RT-PCR分析は、免疫組織化学のために、アイソフォーム特異的抗体の不足を補うであろう定量的尺度を提供する。
ここに述べた方法は、EMTの間の既知のスプライスアイソフォームの変化の検出に適している。さらに、この方法は、ゲノムワイドな選択的スプライシングの研究のために及びEMTの間に新規スプライスアイソフォームの切り替えの同定のために拡張することができる。これを達成するために、そのようなRNAディープシーケンシングまたはスプライシング敏感なマイクロアレイプラットフォームなどの大規模な技術の使用は、上述の誘導性EMTモデルから単離したRNAを用いて実施することができる。それにもかかわらず、アイソフォームの変化の定量RT-PCRの検証は、任意の大規模解析、以下が必要です。
結論として、選択的スプライシングを動的にEMT、胚発生および腫瘍転移に重要であるプロセスの間に規制されている。ヒトゲノムにおける選択的スプライシングの高周波を考慮すると、選択的スプライシングの調節は、細胞分化、組織の発達、及びプログラム細胞死35-41を含む他の多くの生物学的および病理学的プロセスにおいて重要な役割を果たしている可能性がある。スプライスアイソフォームの検出のために本明細書に記載したプロトコルは、これらの他のシステムに適用可能である。
スプライシングレポーターミニ遺伝子アッセイなどの追加の実験的な様式は、A、Bができるeはさらに、シス作用エレメントおよび選択的スプライシング30,42,43を制御するトランス作用因子の調節メカニズムを調査するために使用。さらに、EMTの間に特定のスプライスアイソフォームの機能的役割は、サイレンシングまたは異所的に特定のアイソフォームを発現し、説明し、EMT誘導性システム11におけるEMT誘導を監視することで調べることができる。
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 4-hydroxytamoxifen | Sigma | H7904 | Make stock solution by dissolving 4-hydroxytamoxifen in ethanol to 200 μM. Keep the solution at -20 °C protected from light. |
| E.Z.N.A. Total RNA Isolation kit | Omega Bio-Tek | R6731 | Total RNA isolation kit |
| GoScript Reverse Transcription System | Promega | A5001 | Reagent for qRT-PCR assay |
| GoTaq qPCR Master Mix | Promega | A6002 | Reagent for qRT-PCR assay |
| LightCycler 480 Real-Time PCR System | Roche | Equipment for qRT-PCR assay | |
| CD44 antibody | R&D Systems | BBA10 | 1:1,000 dilution |
| E-cadherin antibody | Cell Signaling Technology | 4065 | 1:2,500 dilution for immunoblotting; 1:50 dilution for immunofluorescence |
| γ-Catenin antibody | Cell Signaling Technology | 2309 | 1:1,000 dilution |
| Occludin antibody | Santa Cruz Biotechnology Inc. | sc-5562 | 1:500 dilution |
| Fibronectin antibody | BD Transduction Laboratories | 610077 | 1:5,000 dilution |
| N-cadherin antibody | BD Transduction Laboratories | 610920 | 1:2,000 dilution |
| Vimentin antibody | NeoMarkers | MS-129-p1 | 1:500 dilution |
| GAPDH antibody | Millipore Corporation | MAB374 | 1:10,000 dilution |
| Amasham ECL Western blotting detection reagent | GE Health Life Science | RPN2209 | Chemiluminescence system |
References
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