Alternative splicing regulation has been shown to contribute to the epithelial-mesenchymal transition (EMT), an essential cellular program in various physiological and pathological processes. Here we describe a method utilizing an inducible EMT model for the detection of alternative splicing during EMT.
Alternative splicing plays a critical role in the epithelial-mesenchymal transition (EMT), an essential cellular program that occurs in various physiological and pathological processes. Here we describe a strategy to detect alternative splicing during EMT using an inducible EMT model by expressing the transcription repressor Twist. EMT is monitored by changes in cell morphology, loss of E-cadherin localization at cell-cell junctions, and the switched expression of EMT markers, such as loss of epithelial markers E-cadherin and γ-catenin and gain of mesenchymal markers N-cadherin and vimentin. Using isoform-specific primer sets, the alternative splicing of interested mRNAs are analyzed by quantitative RT-PCR. The production of corresponding protein isoforms is validated by immunoblotting assays. The method of detecting splice isoforms described here is also suitable for the study of alternative splicing in other biological processes.
Эпителиальных мезенхимальных перехода (EMT) является программой развития, что приводит органов морфогенез и ремоделирования ткани во время эмбриогенеза. При аномально активирована, ЕМТ способствует метастазирования опухоли и органов фиброз 1,2. Неотразимых исследования описано важность регуляции транскрипции в процессе ЕМТ, определяется несколькими факторами транскрипции, такими как кручение, улитки, и ZEB, которые подавляют экспрессию слипчивых перехода белка Е-кадгерина, в результате чего потери cobble- камень как эпителиальной морфологии и коэффициента усиления веретеновидным мезенхимальных фенотипа 3-8. Недавние исследования через генома анализа РНК показали, что существует группа сплайсинг генов, узоры, связанный либо с эпителиальными или мезенхимных фенотипов 9,10. Работа с нашей лаборатории функционально связаны альтернативный сплайсинг и EMT. Изучая CD44 молекул адгезии клеточной поверхности, мы показали, что CD44 чередующеесятельный сплайсинга жестко регулируется во время EMT, и что еще более важно, что CD44 сращивания переключения причинно изоформы способствует EMT 11.
Альтернативный сплайсинг представляет собой широко распространенную и консервативный модель регуляции генов, как до 95% генов нескольких экзонов человека являются альтернативного сплайсинга 12-14. По генерировать множество белковых продуктов из одного гена, альтернативный сплайсинг, является важным механизмом для белка разнообразия, добавляя еще один уровень сложности в геноме человека. Таким образом, нарушение регуляции альтернативного сплайсинга может потенциально привести к глубоким биологических эффектов, вызывающих заболевания человека. Действительно, аберрантная альтернативный сплайсинг при заболеваниях были задокументированы более десяти лет 15-25, в том числе последних выводов, что мутации в генах, кодирующих сплайсосома машины обычно встречаются в миелодиспластических синдромах 26-28. Таким образом, разработка надежных методов выявления альтернативного сплайсинга Isoforms имеет большое значение в изучении различных биологических процессов, включая EMT.
Здесь мы предлагаем протокол для обнаружения изменений в альтернативного сплайсинга, используя индуцибельную модель EMT. Способы конструирования ПЦР-праймеров и обнаружения сплайсинга изоформы пригодны не только для изучения альтернативного сплайсинга во ЕМТ, но также и при изучении альтернативного сплайсинга в других биологических процессах. Исследуя альтернативный сплайсинг во EMT необходимо для того, чтобы лучше понять механизмы EMT и метастазирования опухоли, тем самым способствуя развитию эффективных стратегий для лечения рака метастазы.
Процедура, описанная здесь, включает обнаружение альтернативного сплайсинга в индуцируемого модели ЕМТ. По существу, динамические изменения экспрессии изоформ сплайсинга могут быть захвачены в течение времени ход EMT. Этот метод имеет преимущества перед использованием различных epitheli…
The authors have nothing to disclose.
The authors would like to acknowledge Wensheng Liu for invaluable help with cell imaging. This work was supported by grants from the US National Institutes of Health (R01 CA182467), American Cancer Society (RSG-09-252-01-RMC), Lynn Sage Foundation, and A Sister’s Hope Foundation.
Name of the reagent | Company | Catalogue number | Comments (optional) |
4-hydroxytamoxifen | Sigma | H7904 | Make stock solution by dissolving in ethanol to 200μM, and keep at -20℃ protected from light. |
E.Z.N.A. Total RNA Isolation kit | Omega Bio-Tek | R6731 | Total RNA isolation kit |
GoScript Reverse Transcription System | Promega | A5001 | Reagent for qRT-PCR assay |
GoTaq qPCR Master Mix | Promega | A6002 | Reagent for qRT-PCR assay |
LightCycler 480 Real-Time PCR System | Roche | Equipment for qRT-PCR assay | |
CD44 antibody | R&D Systems | BBA10 | 1:1000 dilution |
E-cadherin antibody | Cell Signaling Technology | 4065 | 1:2500 dilution for immunoblotting; 1:50 dilution for immunofluorescence |
γ-catenin antibody | Cell Signaling Technology | 2309 | 1:1000 dilution |
occludin antibody | Santa Cruz Biotechnology Inc. | sc-5562 | 1:500 dilution |
fibronectin antibody | BD Transduction Laboratories | 610077 | 1:5000 dilution |
N-cadherin antibody | BD Transduction Laboratories | 610920 | 1:2000 dilution |
vimentin antibody | NeoMarkers | MS-129-p1 | 1:500 dilution |
GAPDH antibody | Millipore Corporation | MAB374 | 1:10000 dilution |
Amasham ECL Western blotting detection reagent | GE Health Life Science | RPN2209 | Chemiluminescence system |