Summary
这个协议描述了用于测量肌肉细胞的收缩力在体外使用的微型硅悬臂梁的柔韧培养表面。细胞收缩引起悬臂弯曲，可以测量，记录和转换成力读数，用于测量收缩功能的体外提供一种非侵入性和可扩展的系统。
Abstract
的多个预测和生物相关的体外测定法的发展的前提是多功能的细胞培养系统，促进种子细胞的功能评价的进步。为此，微型悬臂技术提供了一个平台，用以测量各种细胞类型，包括骨骼，心脏和平滑肌细胞的收缩的功能，通过收缩引起的基板弯曲的评估。复用的悬臂阵列的应用提供了一种方式来开发中等至高通量的协议，以评估药物疗效和毒性，疾病的表型和进展，以及神经肌肉和其他细胞 - 细胞相互作用。该原稿提供的信息用于制造可靠的悬臂阵列用于此目的，并且需要在这些表面上成功地培养细胞的方法。设置在需要进行官能肛门的步骤进一步描述收缩的细胞类型ysis保持上使用一种新的激光和光检测系统的这种阵列。到这样的技术可以应用于提供亮点的精度和收缩功能可以利用本系统的分析的可再现性的有代表性的数据，以及在广泛的研究。成功的广泛采用该系统的能提供研究者的手段来在体外进行快速，低成本的功能性研究，导致了组织的性能，疾病发展和响应于新的治疗治疗更准确的预测。
Protocol
1，悬臂式芯片制造
在图1中提供了所描述的制造步骤示出的细节。
- 放置上的硅绝缘体（SOI）晶片在烘箱中烘在125℃下进行20分钟至脱水它们。
- 淀积1.5微米厚的氧化硅层上，用等离子的脱水SOI晶片的把手层增强的化学气相沉积（PECVD）的工具。
- 放置在旋涂机卡盘与装置层朝上的晶片。确保晶片的中心，取2毫升P20引物上的中心晶片，并旋转以3,000 rpm离心60秒以1000转数/秒的加速度。 P20引物促进光致抗蚀剂的器件层的密合性。
- 而晶片仍然在旋涂机夹头，分配2毫升S1818光致抗蚀剂，在晶片的中心，和旋转的转数3000rpm，60秒，在1000转/秒的加速度与邻btain 1.5微米厚的光刻胶层。
- 放置在晶片上的热板上，并持续1分钟进行软烤115℃。
- 为了从悬臂掩模将图案转移到光致抗蚀剂的器件层上执行使用光刻接触掩模对准器的硬接触UV曝光。计算的基础上的125毫焦/厘米2的S1818光致抗蚀剂的曝光能量值的曝光时间。
- 浸在726 MIF光刻胶显影剂晶片1分钟同时轻轻摇动晶片来回开发的光致抗蚀剂。
- 用去离子水（DI）晶片与擦干，最好使用旋转清洗机（SRD）的工具。
- 除去从晶片的边缘的光致抗蚀剂（最多5毫米的边缘）用棉棒蘸丙酮。
- 装入晶片的深反应离子刻蚀（DRIE）工具，具有光致抗蚀剂面朝上，并运行一个配方通过德维蚀刻图案化硅层策层。埋入氧化层用作蚀刻停止，所以，用50％进行蚀刻，以100％以上的周期比预计是必要的，以确保完整的蚀刻。
- 放置在热致抗蚀剂浴溶液晶片20分钟，剥去光致抗蚀剂。晶圆转移到快速转储冲洗机（QDR）冲洗用去离子水晶圆。以下的光刻胶剥离，加载晶片在SRD中的工具来冲洗和干燥晶片。检查在显微镜下的晶片，以确保如期悬臂模式出现。
- 沉积1微米厚的一层未掺杂的氧化硅的利用PECVD工具在晶片的器件层上。该氧化层用作保护层的过程中进一步的处理步骤的悬臂。
- 放置在旋涂机夹头朝上把手层晶片以开始晶片的背面侧的处理。确保晶片的中心，取2毫升P20引物上的晶片的中心，并旋以3000rpm为60秒，在1000转/秒的加速度。
- 而晶片仍然在旋涂机夹头，分配2毫升SPR220-4.5光致抗蚀剂上的中心晶片，并旋转以2000rpm，持续45秒，以1000转数/秒的加速度以得到6.5微米厚的一层光致抗蚀剂。
- 放置在接近热板的晶片进行软烘烤，在115℃进行2分钟。
- 使用光刻接触对准器能够正面/背面对准，对准背侧窗口掩模的前侧悬臂模式和以从背面窗口掩模的图案转移到光致抗蚀剂的操作层上执行硬接触UV曝光。使用基于480毫焦/厘米2为SPR220-4.5光致抗蚀剂的曝光能量值计算的曝光时间。
- 紫外曝光后，让晶片的下一个处理步骤之前，保持在一个暗区30分钟。
- 通过浸入晶片开发光致抗蚀剂à726 MIF光刻胶显影剂2分钟，同时轻轻摇晃晶圆来回。
- 用去离子水（DI）晶片与擦干，最好使用旋转清洗机（SRD）的工具。
- 放置在烘箱中的晶片在90℃下12小时。
- 刻蚀使用的RIE系统与氟化气体和配方用于蚀刻氧化物的晶片的背面氧化硅层。在晶片的背面上的图案化的氧化物作为蚀刻掩模，以便进一步处理。检查在显微镜下的晶片，以保证硅氧化物在曝光窗被完全蚀刻。
- 除去用干净的房间拭子蘸取丙酮在晶片的边缘的光致抗蚀剂（最多5毫米的边缘）。
- 加载在DRIE工具与晶片并运行一个配方的图案化操作层蚀刻至500μm的深度与埋入氧化层用作蚀刻停止。分割该蚀刻成多个运行，以防止过度加热晶片，这将导致硅的不一致的蚀刻。该蚀刻步骤完全消除悬臂下方的硅。
- 执行使用25％稀释的HF蚀刻剂，剥离低于悬臂埋入氧化层和上悬臂的顶部的保护性氧化层的湿法蚀刻步骤。
注意：此步骤发行的硅悬臂梁的底面，也打开了一个窗口下方，以提供一个接入探测与激光的悬臂。 - 冲洗用一系列的去离子水浴场，仔细用氮气干燥晶圆。由于悬臂是在他们的基地只支持，不直接对悬臂使用去离子水或惰性气体有力的喷雾剂。
- 从沿着在手柄层的蚀刻步骤中产生的解理线晶片劈开单个芯片。
2，细胞培养
- 根据此前公布的方法17准备13F盖玻片。
注：如果13F海湾rslips不可用，可以使用任何疏水性表面与上述95°的接触角。 - 消毒悬臂芯片和13F盖玻片的70％乙醇溶液风干的流罩。
- 广场上的13层顶部盖玻片个人悬臂芯片标准的12孔板内。
- 涂层与该生物聚合物或表面改性的细胞类型优化的悬臂根据标准细胞培养协议被使用。
- 在其特定的生长培养基中重悬浮细胞至所需浓度。
注意：此协议将导致细胞脱落，通过悬臂窗口和未附着到所需悬臂表面有相当多的。细胞制剂因此，应当作出3-4倍比标准盖玻片制剂更加集中。例如，大鼠骨骼肌卫星细胞的播种典型地采用500至700个细胞/平方毫米15,16的接种密度，并以2,000个细胞/平方毫米使用悬臂衬底。优化实验，应进行新的细胞来源，以确定一个合适的接种密度。 - 吸取200μl的细胞悬浮液上的悬臂晶片表面，确保介质的泡沫覆盖悬臂窗户完全。如果介质灯芯通过窗口，并不构成对悬臂顶部上的静电气泡取代13F盖玻片并重新尝试电镀。
- 传送含有芯片的培养箱板和使细胞附着至少1小时（优选2-3小时）。
- 在此之后的电镀周期，用无菌镊子芯片1毫升生长培养基转移到一个干净的好，没有一个13F盖玻片，加满油的文化。
- 返回板的孵化器。
- 根据他们的标准协议，用于在体外维持在盖玻片上维持细胞。对骨骼肌细胞，介质组合物的一个开关来诱导肌管形成一次细胞汇合将是必要的。
3，安装硬件和软件的悬臂挠度分析
- 将加热的培养皿成一个堂堂正正的电镜的阶段。
- 添加3毫升目前的细胞悬浮在（+的10mM HEPES）馈送介质的加热显微镜阶段。
- 安装在加热的培养皿的内侧不锈钢电极以15mm的间隔距离，并将它们连接到脉冲发生器，能够产生不同的强度，频率和波形的场刺激脉冲的，以允许系统以产生场刺激当适当的细胞。
- 螺栓氦 - 氖激光器，装在XY平移阶段，在显微镜台的下侧，并调整它使得激光束以30°角relativ通过加热培养皿的底部导向E至悬臂的平面。
- 螺栓象限光检测模块，安装在XY平移阶段，对显微镜载物台的下侧，并调整位置，以使反射的激光束的土地中的4个象限的中心， 图2提供了硬件设置的概况必要为实现所描述的协议。
- 编写一个软件程序来控制线性致动器的跨悬臂扫描。写，参照图3中提供的流程图，该软件程序。编程为与该系统一起使用的图形界面，在图4中提供。
4，录音悬臂式弯沉数据
- 打开悬臂分析硬件和相关的软件。
- 将加热阶段的热敏电阻到培养基中，然后等待它来读取37℃。
- 插入悬臂芯片与cantileve阶段RS面向舞台的右侧。
- 打开显微镜光源。
- 聚焦显微镜使悬臂的边缘进入视野，并使用激光/光电探测器的控制软件来定位激光束对悬臂1。注意的提示：假设悬臂是面向舞台的右边，悬臂1是一个位于阵列的左上角和数字中的左下向下运行至16。悬臂17是在右上位置，并运行到32中的右下角（ 图5A）。
- 按“PLAY”的录音软件。
- 定位在光检测器，使得在x和y帧中的信号读出“0”，通过调节步进电机控制的光检测器。
- 在激光/光检测器的控制软件中设置悬臂1的位置（ 图4）。
- 移动激光到悬臂16的前端，则重复步骤4.7，并设置cantilevER在激光/光电探测器的控制软件16位。
- 移动激光到悬臂32的前端，则重复步骤4.7，并设置悬臂32的位置，在激光/光检测器的控制软件。
- 移动激光到悬臂17的前端，则重复步骤4.7，并设置悬臂17的位置，在激光/光检测器的控制软件。
- 关掉显微镜光源与架空光在实验室。
- 在刻录软件，按“记录”。
- 设置脉冲发生器硬件到40毫秒，5 V脉冲1Hz的频率，并打开机器。
注意：任选地，采用优化的刺激方案为特定的细胞来源，在这一点上，所述设置是基于使用人类和啮齿动物细胞来源12,13,15,16收集到的数据的指导方针。 - 使用激光/光电探测器的控制软件，设置跨越32悬臂阵列扫描硬件，在旺火上停5秒ê。
- 当32悬臂的扫描完成后，关闭刺激器，然后停止录音软件，实现了数据文件。
- 检查记录的跟踪每个悬臂的收缩活动的证据。请记下每个悬臂阳性反应。甲收缩被定义为峰，如果偏转是至少0.1 V以上的基线。
- 从激光/光电探测器的控制软件的扫描协议，删除所有非敏感的悬臂。
- 活动的悬臂可以再无刺激，以获得细胞的自发收缩活动的阅读来重新扫描。
- 运行扫描具有或不具有广泛的领域的电刺激之后，另外的治疗性化合物的培养基中，以观察在培养的细胞中的功能性输出的效果。
- 进行疲劳评估通过电刺激的细胞长时间和对照的水平扫描 actility测量需要多长时间的峰值力下降到低于特定阈值。
- 在运动神经元中被保持在共培养与肌肉的实验中，测量经过治疗运动神经元，肌管悬臂共培养的神经肌肉接头处形成一个神经兴奋剂（如谷氨酸）或突触抑制剂（ 例如 ，D-筒箭毒碱）和扫描分别为16自发活动的增加和减少。
- 作为执行决定的计划实验的需要具体的扫描。
悬臂挠度数据的5分析
- 使用改性斯通方程15（下面详述），以生悬臂偏转的数据（以伏特）转换成应力在细胞层或肌管（帕斯卡），并直接测量细胞收缩力（在纳米牛顿）的读出：
广告/ 51866 / 51866eq1.jpg“/>公式1
式（2） - 其中δ=悬臂尖端偏转和应力的肌管产生，σC =应力由肌管产生，假设一个均匀的厚薄膜的悬臂，C 检测器的整个宽度=照片与电压到激光位置的系统特定的系数-detector，θ=相对于悬臂的面内的激光和检测器的角度，E Si为硅的弹性模量， 吨Si为厚度悬臂的， 吨 f =肌管厚度，V = 硅的毒害的比率硅，L =悬臂长度，激光P =路径长度悬臂针尖至探测器和 w
- 假设肌管是均匀的膜，在肌管的力等于在薄膜上的力，从而导致式（3）通过等同的力从应力的计算和假设小区的横截面面积被用于斯通的的应用程序，它方程。
式（3） - 以下功能的数据采集，固定悬臂芯片的免疫细胞化学分析或利用细胞使用标准技术的蛋白质或DNA分析。
- 可选地，返回，以便在稍后的时间点，重新评估功能表现的细胞培养箱代替制备用于分子分析。
式（2） Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
收缩细胞对悬臂成功的文化是一个相对简单的过程，利用标准的细胞培养技术（ 图5）。悬臂支撑承包细胞的百分比将取决于细胞类型而异正在研究和具体的栽培技术采用。使用从大鼠后肢来源的原胚细胞，收缩活性，对悬臂检查的12％检测到的组（n = 4）。使用所描述的激光和光检测器系统的收缩功能的分析提供了关于所接种的细胞的功能的成熟准确的实时数据。使用标准的电生理学软件然后可以用于分析原始数据，便于相关的功能特性，如峰值力，峰值时间的力，并且以一半的弛豫时间的计算中，如示于图7。后续数据收集从处理的培养与治疗化合物允许比较功能特性的有和无药物添加，从而使得化合物的活性和随后的体内应答的预测的评估。此外，延长的刺激协议提供的装置来评估疲劳的速率在 培养细胞中，从而扩大生理数据从该系统中（ 图8）获得的水平。
悬臂培养可修改成包括运动神经元的培养系统与骨骼肌肌管16，以便使神经肌肉突触形成的影响（ 图9）的评估。在这样的培养物，自发收缩活动的速率相比的速率收缩响应于治疗与神经元特异性刺激剂，如谷氨酸。任何观察到的谷氨酸诱导的增加的收缩率表明培养的神经元的活化，从而导致乙酰胆碱的释放以及随后的肌醇管激活。治疗与突触抑制剂，如乙酰胆碱受体阻断剂D-筒箭毒碱，导致停止谷氨酸诱导的活性的进一步证明了功能性神经肌肉突触在这些培养16存在下进行。
图1原理图，详细悬臂制造流程。在流程图中列出的数字与标题中的方法部分协议的步骤“悬臂芯片制造。” 请点击这里查看该图的放大版本。
图2硬件用于在悬臂评估细胞收缩的激光/光检测系统的细节。 （一）照片用于悬臂评估修改后的电镜。激光（i）和光检测器（ⅱ）安装在XY平移阶段的阶段的下方。一个透明的培养皿被安装在舞台上的（iii）中，其允许激光通路通过阶段的下侧的悬臂阵列（B）示意图的“自上而下”的显微镜载物台的透视图。 XY平移阶段允许在X和Y两个平面（红色箭头）的激光器和光检测器的运动，有利于激光的运动来询问各悬臂以阵列。悬臂片（ⅲ）应被放置成与朝向舞台的右侧朝向悬臂的阶段，为了使系统正常运行（C）近拍激光（ⅰ）的照片和光检测器（ⅱ）安装在下方的显微镜载物台上。激光定位在30°角相对于所述悬臂芯片（θ）的平面中的（D）关闭了培养皿的照片。宽视场电刺激是由一对银电极装置施加的位置15毫米相距（ⅳ）。的加热元件（ⅴ）附着到培养皿的底部，用于保持在分析过程中的培养，在37℃。温度控制是动态的，并通过热敏电阻放置在介质（未示出）来调节。 请点击这里查看这个数字的放大版本。
图3流程图的逻辑基础软件来控制。扫描的激光和光检测器的两个软件的回路控制动作：用于用户输入和用于控制所述扫描运动的循环的主回路。执行安装程序，同时在主回路，其次是激活第二个循环的中高通量数据采集。 请点击这里查看该图的放大版本。
软件图4的图形用户界面中使用悬臂评估过程中控制激光器和光电探测器的位置。 （A）中的按钮来手动控制X和Y平面的激光和光检测器的位置（B）控制，用于手动设置的4个角部的悬臂的位置（1，16，17，和32），从而允许软件推断在数组中的剩余悬臂的位置（C）控制允许用户选择哪些伸臂中包含的每个扫描。 请点击这里查看该图的放大版本。
图个定制悬臂芯片的5图像用在该系统中，并保持在类似的表面的细胞的代表性图像。 （一）拍摄一个单一的，定制的悬臂式芯片。每个芯片包含32个悬臂排成2排16悬臂1位于右上角的形象和悬臂32的左下角。悬臂式芯片是15×15毫米2。原代大鼠骨骼肌细胞（B）相位对比图像生长在悬臂第每个悬臂是750微米长，100微米，宽4微米厚的（C）维持在一个悬臂主大鼠肌管的免疫细胞化学染色。细胞用的肌球蛋白重链抗体探针染色。注意培养的纤维的条纹模样，表示收缩机器的成熟。悬臂边都在此图像中，以提供大规模的指示被人为地突出。 请点击这里查看该图的放大版本。
图6示意图说明斯通方程用于导出由肌管的悬臂上产生力的条款。δ=悬臂尖挠度和应力的肌管，C产检测器 =光检测器上与电压到激光位置的系统特定的系数，θ=相对于悬臂的面内的激光和检测器的角度，E Si为硅的弹性模量， 吨Si为厚度的悬臂，T F =肌管的厚度，V = 硅硅毒比，L =悬臂长度，并从悬臂尖端激光探测器，P =路径长度。 请点击这里查看该图的放大版本。
图7。代表性的原始数据和使用说明的悬臂系统收缩的形式分析。 （A）从悬臂大鼠原代肌管的宽领域的电刺激的原始数据跟踪的例子。顶部迹=激光偏转（以伏特为单位）中的x轴，表示纵向应变上的悬臂。中间迹=激光偏转（以伏特为单位），在y轴上，显示整个悬臂的扭转变形。底迹=用于诱发肌管收缩在该系统中的电脉冲的时间位置的指示（B）使用标准的电生理学软件，它可以测量峰值力（PF），达峰时间力（TTP）和时间的一半从原代大鼠骨骼肌肌管从收集到的原始数据松弛（半RT）（C）分页收缩数据组（n = 11）。修改后的斯托尼方程的应用程序允许悬臂应力计算从伏原始数据的读数。从这个数据，还可以生成直接计算的力（以牛顿为单位）。转载瓦特公布的数据第i个许可13。 请点击这里查看该图的放大版本。
图8。代表性的数据表明骨骼肌疲劳分析悬臂文化 。原始数据（以伏特为单位）转化成肌管的力（在纳米牛顿）和重新绘制的测量结果。数据表明针对1 Hz的宽广领域的电脉冲0分钟（黑色线），并持续刺激120分钟（灰色轨迹）后悬臂肌小管的收缩幅度。 请点击这里查看该图的放大版本。
来自骨骼肌的运动神经元共培养物的维持于悬臂，表明运动神经元的刺激有和无另外一种神经肌肉阻断剂的作用效果的分析图9代表的痕迹。原始数据（以伏特为单位）转化成肌管的测量力（纳米牛顿），并重新绘制，由培养肌管没有神经刺激自发收缩（一）测量。肌管收缩（二）下通过加为200μm的谷氨酸神经刺激测试（C）测量肌小管萎缩以下谷氨酸和12.5微米的D-筒箭毒碱处理。转载许可16公布的数据， 请点击这里查看该图的放大版本。
下面的表格列出了用于培养细胞中所描述的验证试验的特异性试剂，以及必要的设备来执行该悬臂评估。 ，请注意到，用来培养试剂是不必要的，该系统应具有任何实验室保持收缩细胞的体外培养方法很容易地集成，并提供所列出的试剂应研究者要重复描述的具体的实验结果。
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Discussion
在分析微尺度悬臂蜂窝收缩证据的关键步骤是在放置于显微镜载物台的悬臂芯片，并且激光和光检测器的阵列中的角悬臂的末端的随后对准。如果不正确地进行，则该软件将无法推断剩余的悬臂的位置的阵列中，从而可能导致假阴性积累数据收集期间。运营商应注意，以确保悬臂芯片校准激光的位置之前，躺在平齐培养皿的底部。如果芯片坐在在盘的角度，它会改变反射激光束的路径和混淆的数据集。
一种功能性空气表必须采用数据收集过程中取消了背景振动。悬臂的厚度小（约4微米）在本研究中使用的PRovides高灵敏度收缩活性，但具有增加的灵敏度的振动的副作用。运营商应该照顾到周围的硬件移动尽可能少的数据记录过程中，为了减少背景读数。最后，将在舞台上的悬臂芯片时，应注意保证芯片不会接触到的文化与刺激银电极接触良好。的宽视场的刺激与电极接触芯片的应用将改变电流路径和对系统的有效刺激培养细胞的能力产生负面影响。
为了获得力量输出骨骼肌肌管的更精确的读数，强烈建议执行培养细胞的功能一旦分析完成的免疫染色。列出的方程组需要以计算力的肌管的横截面面积（CSA）的输入。而假定的值可以基于P的使用revious数据，利用共聚焦成像技术将提供由订约肌管所施加的力的更准确的估计的肌管的确切CSA测量。与原始的收缩数据有问题的电池的物理特性是在跨越多个悬臂正火结果有价值和实验条件15之间，并且因此产生的整个组织的响应准确地预测对药物治疗或疾病的关键。斯通方程假设检验的肌管跨越所以应努力为仅包括从细胞中符合此假设获得的数据在悬臂的整个长度。如果这是不可能的，有限元分析可用于提供的力的精确测量，从较小的肌管如前15出版。该分析方法是更为劳动密集的，因此不适合于高通量应用，但如果优化可能是必要细胞培养物中符合斯通的假设不能得到。
如前所述，培养参数可以从标准盖玻片制剂被转移。然而，建议考虑采用无血清培养基的组合物和非生物底物的使用本系统在药物筛选应用。由于动物血清的不确定性质的新的治疗的效果可通过在培养基中加入这些添加剂被混淆。无血清培养基的配方可为啮齿动物和人类骨骼肌培养18-21，并提供更多的控制，进行复合评估明确的环境。同样，使用上的悬臂生物涂料（胶原，层粘连蛋白等）的引入可变性对它们避免应用的非生物基质的细胞制剂。硅烷自组装单分子层的上表面的文化沉积已被证实前tensively以支持多种类型的细胞16,18,20,22-31的粘附和发展，并代表了装置，以产生在一个可靠的和可重复的方式完全定义的表面。
由于存在于哺乳动物系统收缩细胞的范围内，该模型用于在体外测定法中的应用是比较宽的。虽然使用的骨骼肌细胞进行了优化，该系统是可能适用的平滑肌细胞和心肌细胞，以及，提供给执行剂量响应的快速评估，以在这些细胞中的实时新型疗法的手段。当前悬臂芯片包括32悬臂（ 图5A）的阵列，但可以很容易地改变，以包括更多。这样的阵列进行分析，产生从单一文化的数据点有相当数量，从而大大增加任何观察到的差异的统计力量。证明在图8中，将细胞培养在这个系统中发生疲劳随着时间的推移，响应于连续的宽视场的刺激，从而对细胞在体外。加成支配运动神经元到该培养模型的持久性水平的药物效果的评估也允许突触形成的评估通过肌肉的测量收缩响应于神经兴奋剂（ 图9）。而在多路测定基线功能参数的测量（ 图7）具有比在体外培养的标准生物分子评估明显的优势，以评估神经肌肉功能和接种细胞的续航能力的能力大大提高了该模型的药物筛选的适用性和疾病建模应用。所描述的技术提供了研究者进行健康和患病的肌肉细胞在体外迅速，成本低官能评价的手段。培养系统的通用性和H功能细节从原始数据的分析获得的IGH水平，应该产生在体内的组织反应的更精确的预测的新的病理和化学的挑战。
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Acknowledgments
该研究是由卫生部资助号R01NS050452和R01EB009429研究所。在外部进行悬臂芯片制造由合作者在位于康奈尔大学的纳米加工设施。在悬臂的制造过程中使用的所有设备被设在该设施。特别感谢小敏的Esch和Jean-马修普罗特其悬臂微加工的援助。由查尔斯·休斯，阿莱克斯Zelenin和埃里克·御从合成现实实验室在UCF的生成影视动画的悬臂功能。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Primary rat muscle growth medium | |||
| Neurobasal medium | Life Technologies | 21103-049 | |
| B27 (50x) | Life Technologies | 17504044 | 1x |
| Glutamax (100x) | Life Technologies | 35050061 | 1x |
| G5 supplement | Life Technologies | 17503-012 | 1x |
| Glial-Derived Neurotrophic Factor | Cell sciences | CRG400B | 20 ng/ml |
| Brain-Derived Neurotrophic Factor | Cell sciences | CRB600B | 20 ng/ml |
| Ciliary Neurotrophic Factor | Cell sciences | CRC400A | 40 ng/ml |
| Neurotrophin-3 | Cell sciences | CRN500B | 20 ng/ml |
| Neurotrophin-4 | Cell sciences | CRN501B | 20 ng/ml |
| Acidic Fibroblast Growth Factor | Life Technologies | 13241-013 | 25 ng/ml |
| Cardiotrophin-1 | Cell sciences | CRC700B | 20 ng/ml |
| Heparin Sulphate | Sigma | D9809 | 100 ng/ml |
| Leukemia Inhibitory Factor | Sigma | L5158 | 20 ng/ml |
| Vitronectin | Sigma | V0132 | 100 ng/ml |
| Primary rat muscle differentiation medium | |||
| NB Activ 4 | Brain Bits LLC | NB4-500 | |
| Equipment | |||
| Class 2 red diode laser | Newport | ||
| Photo-detector | Noah Industries | ||
| Model 2100 Pulse stimulator | A-M systems | ||
| Multiclamp 700B Digitizer | Axon Instruments | ||
| Patch clamp microscope and stage | Olympus | ||
| Delta T4 culture dish controller | Bioptechs | ||
| Axoscope software | Molecular Devices | ||
| LabVIEW software | National Instruments | ||
| 37 oC, 5% CO2 incubator | NAPCO | ||
| Class 2 microbiological flow hood | Labconco | ||
| Pipettes and tips | Eppendorf |
References
- Bischoff, R. Enzymatic liberation of myogenic cells from adult rat muscle. Anat. Rec. 180, 645-661 (1974).
- Yasin, R., et al. A quantitative technique for growing human adult skeletal muscle in culture starting from mononucleated cells. J. Neurol. Sci. 32, 347-360 (1977).
- Dennis, R. G., Kosnik, P. E., 2nd, Excitability and isometric contractile properties of mammalian skeletal muscle constructs engineered in vitro. In Vitro Cell Dev. Biol. Anim. 36, 327-335 (2000).
- Khodabukus, A., Baar, K. Defined electrical stimulation emphasizing excitability for the development and testing of engineered skeletal muscle. Tissue Eng Part C Methods. 18, 349-357 (2012).
- Langelaan, M. L. P., et al. Advanced maturation by electrical stimulation: Differences in response between C2C12 and primary muscle progenitor cells. Journal of tissue engineering and regenerative medicine. 5, 529-539 (2011).
- Stephenson, G. M., O'Callaghan, A., Stephenson, D. G. Single-fiber study of contractile and biochemical properties of skeletal muscles in streptozotocin-induced diabetic rats. Diabetes. 43, 622-628 (1994).
- Harber, M., Trappe, S. Single muscle fiber contractile properties of young competitive distance runners. Journal of applied physiology (Bethesda, Md: 1985). 105, 629-636 (2008).
- Hvid, L. G., et al. Four days of muscle disuse impairs single fiber contractile function in young and old healthy men. Experimental gerontology. 48, 154-161 (2013).
- Edman, K. A.
- Krivickas, L. S., Walsh, R., Amato, A. A. Single muscle fiber contractile properties in adults with muscular dystrophy treated with MYO-029. Muscle Nerve. 39, 3-9 (2009).
- Sung, J. H., et al. Microfabricated mammalian organ systems and their integration into models of whole animals and humans. Lab on a chip. 13, 1201-1212 (2013).
- Wilson, K., Molnar, P., Hickman, J. J. Integration of functional myotubes with a Bio-MEMS device for non-invasive interrogation. Lab on a chip. 7, 920-922 (2007).
- Wilson, K., Das, M., Wahl, K. J., Colton, R. J., Hickman, J. Measurement of contractile stress generated by cultured rat muscle on silicon cantilevers for toxin detection and muscle performance enhancement. PLoS ONE. 5, (2010).
- Binnig, G., Quate, C. F., Gerber, C.
- Pirozzi, K. L., Long, C. J., McAleer, C. W., Smith, A. S., Hickman, J. J. Correlation of embryonic skeletal muscle myotube physical characteristics with contractile force generation on an atomic force microscope-based bio-microelectromechanical systems device. Applied physics letters. 103, 83108 (2013).
- Smith, A., Long, C., Pirozzi, K., Hickman, J. A functional system for high-content screening of neuromuscular junctions in vitro. Technology. 1, 37-48 (2013).
- Stenger, D. A., et al. Coplanar molecular assemblies of amino- and perfluorinated alkylsilanes: characterization and geometric definition of mammalian cell adhesion and growth. Journal of the American Chemical Society. 114, 8435-8442 (1992).
- Das, M., Rumsey, J. W., Bhargava, N., Stancescu, M., Hickman, J. J. A defined long-term in vitro tissue engineered model of neuromuscular junctions. Biomaterials. 31, 4880-4888 (2010).
- Rumsey, J. W., Das, M., Bhalkikar, A., Stancescu, M., Hickman, J. J. Tissue engineering the mechanosensory circuit of the stretch reflex arc: Sensory neuron innervation of intrafusal muscle fibers. Biomaterials. 31, 8218-8227 (2010).
- Das, M., Rumsey, J. W., Bhargava, N., Stancescu, M., Hickman, J. J. Skeletal muscle tissue engineering: A maturation model promoting long-term survival of myotubes, structural development of the excitation-contraction coupling apparatus and neonatal myosin heavy chain expression. Biomaterials. 30, 5392-5402 (2009).
- Das, M., et al. Developing a novel serum-free cell culture model of skeletal muscle differentiation by systematically studying the role of different growth factors in myotube formation. In Vitro Cell Dev Biol Anim. 45, 378-387 (2009).
- Stenger, D. A., Pike, C. J., Hickman, J. J., Cotman, C. W. Surface determinants of neuronal survival and growth on self-assembled monolayers in culture. Brain research. 630, 136-147 (1993).
- Hickman, J. J., et al. Rational pattern design for in vitro cellular networks using surface photochemistry. Journal of Vacuum Scienc., & Technology A: Vacuum, Surfaces, and Films. 12, 607-616 (1994).
- Das, M., Molnar, P., Devaraj, H., Poeta, M., Hickman, J. J. Electrophysiological and morphological characterization of rat embryonic motor neurons in a defined system. Biotechnology progress. 19, 1756-1761 (2003).
- Rumsey, J. W., et al. Node of Ranvier formation on motor neurons in vitro. Biomaterials. 30, 3567-3572 (2009).
- Murugan, R., Molnar, P., Rao, K. P., Hickman, J. J. Biomaterial Surface patterning of self assembled monolayers for controlling neuronal cell behavior. International journal of biomedical engineering and technology. 2, 104-134 (2009).
- Guo, X., Johe, K., Molnar, P., Davis, H., Hickman, J. Characterization of a human fetal spinal cord stem cell line, NSI-566RSC, and its induction to functional motoneurons. Journal of Tissue Engineering and Regenerative Medicine. 4, 181-193 (2010).
- Varghese, K., et al. A new target for amyloid beta toxicity validated by standard and high-throughput electrophysiology. PLoS ONE. 5, e8643 (2010).
- Natarajan, A., et al. Patterned cardiomyocytes on microelectrode arrays as a functional, high information content drug screening platform. Biomaterials. 32, 4267-4274 (2011).
- Davis, H., et al. Rat Cortical Oligodendrocyte-Embryonic Motoneuron Co-Culture: An Axon-Oligodendrocyte Interaction Model. Journal of biomaterials and tissue. 2, 206-214 (2012).
- Natarajan, A., DeMarse, T., Molnar, P., Hickman, J. Engineered In Vitro Feed-Forward Networks. J Biotechnol Biomater. 3, 2 (2013).
