Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Bioengineering
Click here for the English version

Bioengineering

Microscale सिलिकॉन cantilevers का उपयोग सेलुलर सिकुड़ा समारोह का आकलन करने के लिए Published: October 3, 2014 doi: 10.3791/51866
Automatic Translation
1, 1, 1, 1, 1, 1
1NanoScience Technology Center, University of Central Florida

Summary

इस प्रोटोकॉल विट्रो में मांसपेशियों की कोशिकाओं का सिकुड़ना को मापने के लिए लचीला संस्कृति सतहों के रूप में microscale सिलिकॉन cantilevers के उपयोग का वर्णन करता है. सेलुलर संकुचन, मापा दर्ज की, और इन विट्रो में सिकुड़ा समारोह को मापने के लिए एक गैर इनवेसिव और स्केलेबल प्रणाली प्रदान करने, सेना के readouts में परिवर्तित किया जा सकता है जो ब्रैकट झुकने का कारण बनता है.

Abstract

अधिक भविष्य कहनेवाला और जैविक रूप से प्रासंगिक विट्रो में assays के विकास वरीयता प्राप्त कोशिकाओं के कार्यात्मक मूल्यांकन की सुविधा जो बहुमुखी सेल संस्कृति प्रणालियों की उन्नति पर predicated है. कि अंत करने के लिए, microscale ब्रैकट प्रौद्योगिकी झुकने संकुचन प्रेरित सब्सट्रेट के मूल्यांकन के माध्यम से, कंकाल, हृदय, और चिकनी मांसपेशियों की कोशिकाओं सहित सेल प्रकार की एक सीमा के सिकुड़ा कार्यक्षमता को मापने के लिए जो के साथ एक मंच प्रदान करता है. मल्टिप्लेक्स ब्रैकट सरणियों के आवेदन दवा प्रभावकारिता और विषाक्तता, रोग फेनोटाइप और प्रगति, साथ ही neuromuscular और अन्य सेल सेल बातचीत का आकलन करने के लिए उच्च throughput प्रोटोकॉल के लिए उदार विकसित करने के लिए साधन प्रदान करता है. यह पांडुलिपि इस उद्देश्य के लिए विश्वसनीय ब्रैकट सरणियों fabricating के लिए विवरण, और इन सतहों पर सफलतापूर्वक संस्कृति कोशिकाओं के लिए आवश्यक तरीकों प्रदान करता है. इसके अलावा विवरण कार्यात्मक गुदा प्रदर्शन करने के लिए आवश्यक कदम पर प्रदान की जाती हैसिकुड़ा प्रकार की कोशिकाओं के ysis एक उपन्यास लेजर और फोटो डिटेक्टर सिस्टम का उपयोग ऐसे सरणियों पर बनाए रखा. पर प्रकाश डाला गया परिशुद्धता और इस प्रणाली का उपयोग संभव सिकुड़ा समारोह के विश्लेषण की प्रतिलिपि प्रस्तुत करने योग्य प्रकृति प्रदान की प्रतिनिधि डेटा, साथ ही पढ़ाई की व्यापक रेंज है जो इस तरह की तकनीक लागू किया जा सकता है. इस प्रणाली के सफल व्यापक अपनाने साधन के साथ जांचकर्ताओं ऊतक प्रदर्शन, रोग विकास और उपन्यास चिकित्सीय उपचार के लिए प्रतिक्रिया की अधिक सटीक भविष्यवाणी करने के लिए अग्रणी, इन विट्रो में तेजी, कम लागत कार्यात्मक अध्ययन को करने के लिए प्रदान कर सकता है.

Protocol

1 ब्रैकट चिप निर्माण

वर्णित निर्माण चरणों की इलस्ट्रेटेड विवरण चित्र 1 में प्रदान की जाती हैं.

  1. एक ओवन में सिलिकॉन तकनीक पर इन्सुलेटर (सोइ) वेफर्स जगह और उन्हें निर्जलीकरण के लिए 20 मिनट के लिए 125 डिग्री सेल्सियस पर सेंकना.
  2. एक प्लाज्मा का उपयोग निर्जलित सोइ वेफर की संभाल परत पर सिलिकॉन ऑक्साइड की एक 1.5 माइक्रोन मोटी परत जमा रासायनिक वाष्प जमाव (PECVD) उपकरण बढ़ी.
  3. डिवाइस परत का सामना करना पड़ के साथ स्पिन coater चक पर वेफर रखें. , मे केन्द्रित सुनिश्चित 1,000 RPM / सेकंड की गति पर 60 सेकंड के लिए 3000 rpm पर वेफर के केंद्र, और स्पिन पर P20 प्राइमर के 2 मिलीलीटर बांटना. P20 प्राइमर डिवाइस परत को photoresist की आसंजन को बढ़ावा देता है.
  4. वेफर स्पिन coater चक पर अभी भी है, ओ के लिए 1000 rpm / सेकंड की गति पर 60 सेकंड के लिए 3000 rpm पर S1818 वेफर के केंद्र पर photoresist, और स्पिन के 2 मिलीलीटर बांटनाphotoresist की एक 1.5 माइक्रोन मोटी परत btain.
  5. एक गर्म थाली पर वेफर प्लेस और 1 मिनट के लिए 115 डिग्री सेल्सियस पर एक नरम सेंकना प्रदर्शन करते हैं.
  6. डिवाइस परत पर photoresist को ब्रैकट नकाब से पैटर्न का हस्तांतरण करने के क्रम में एक photolithography संपर्क मुखौटा aligner का उपयोग कर एक कठिन संपर्क यूवी जोखिम प्रदर्शन करना. 125 एमजे / S1818 photoresist के लिए 2 सेमी का जोखिम ऊर्जा मूल्य के आधार पर जोखिम समय की गणना.
  7. धीरे आगे पीछे वेफर मिलाते हुए जबकि 1 मिनट के लिए एक 726 MIF photoresist डेवलपर में वेफर डुबो कर photoresist का विकास करना.
  8. De-ionized (डी) पानी के साथ वेफर कुल्ला और अधिमानतः एक स्पिन कुल्ला ड्रायर (एस आर डी) उपकरण का उपयोग कर, यह सूखी.
  9. एसीटोन में डूबा एक कपास झाड़ू का उपयोग (धार से 5 मिमी तक) वेफर के किनारे से photoresist निकालें.
  10. Photoresist पक्ष का सामना करना पड़ के साथ, एक गहरी प्रतिक्रियाशील आयन खोदना (DRIE) उपकरण में वेफर लोड, और देवी के माध्यम से नमूनों सिलिकॉन परत खोदना एक नुस्खा चलानेCE परत. एक खोदना रोकने के रूप में दफन ऑक्साइड परत काम करता है, तो एक पूरा खोदना सुनिश्चित करने के लिए आवश्यक होने की उम्मीद है की तुलना में 100% अधिक चक्र के लिए 50% के साथ एक खोदना प्रदर्शन करते हैं.
  11. Photoresist पट्टी करने के लिए 20 मिनट के लिए एक गर्म photoresist स्नान समाधान में वेफर रखें. डि पानी के साथ वेफर कुल्ला करने के लिए एक त्वरित डंप-rinser (QDR) को वेफर स्थानांतरण. Photoresist पट्टी के बाद कुल्ला, और वेफर सुखाने के लिए एक एस आर डी उपकरण में वेफर लोड. उम्मीद के रूप में ब्रैकट पैटर्न दिखाई देता है यह सुनिश्चित करने के लिए एक खुर्दबीन के नीचे वेफर निरीक्षण किया.
  12. एक PECVD उपकरण का उपयोग वेफर की युक्ति परत पर संयुक्त राष्ट्र डाल दिया गया सिलिकॉन ऑक्साइड की एक 1 माइक्रोन मोटी परत जमा. आगे की प्रक्रिया के चरणों के दौरान cantilevers के लिए एक सुरक्षात्मक परत के रूप में यह परत ऑक्साइड कार्य करता है.
  13. वेफर के पीछे की ओर की प्रोसेसिंग शुरू करने के लिए ऊपर का सामना करना पड़ संभाल परत के साथ स्पिन coater चक पर वेफर रखें. सुनिश्चित करें वेफर 3,000 rpm पर P20 वेफर के केंद्र पर प्राइमर, और स्पिन के 2 मिलीलीटर बांटना, केंद्रित है1000 rpm / सेकंड की गति पर 60 सेकंड के लिए.
  14. वेफर स्पिन coater चक पर अब भी है, के एक 6.5 माइक्रोन मोटी परत प्राप्त करने के लिए 1000 rpm / सेकंड की गति पर 45 सेकंड के लिए 2,000 rpm पर वेफर के केंद्र, और स्पिन पर SPR220-4.5 photoresist की 2 मिलीलीटर बांटना photoresist.
  15. 2 मिनट के लिए 115 डिग्री सेल्सियस पर एक नरम सेंकना प्रदर्शन करने के लिए एक निकटता गर्म थाली पर वेफर रखें.
  16. सामने / वापस संरेखण में सक्षम एक photolithography संपर्क aligner का उपयोग, सामने की ओर ब्रैकट पैटर्न को पीठ खिड़की मुखौटा संरेखित और संभाल परत पर photoresist को पीठ खिड़की मुखौटा से पैटर्न का हस्तांतरण करने के क्रम में एक कठिन संपर्क यूवी जोखिम प्रदर्शन करते हैं. 480 एमजे / SPR220-4.5 photoresist के लिए 2 सेमी का जोखिम ऊर्जा मूल्य के आधार पर गणना की एक जोखिम समय का उपयोग करें.
  17. यूवी जोखिम के बाद, वेफर्स अगले प्रसंस्करण कदम से पहले 30 मिनट के लिए एक अंधेरे क्षेत्र में रहते हैं.
  18. वेफर में डुबो कर photoresist का विकास2 मिनट के लिए एक 726 MIF photoresist डेवलपर धीरे आगे पीछे वेफर मिलाते हुए.
  19. De-ionized (डी) पानी के साथ वेफर कुल्ला और अधिमानतः एक स्पिन कुल्ला ड्रायर (एस आर डी) उपकरण का उपयोग कर, यह सूखी.
  20. 12 घंटे के लिए 90 डिग्री सेल्सियस पर एक ओवन में वेफर्स रखें.
  21. Fluorinated गैसों के साथ एक आर.आई.ई. प्रणाली और ऑक्साइड नक़्क़ाशी के लिए एक नुस्खा का उपयोग वेफर की पीठ पर सिलिकॉन ऑक्साइड परत नक़्क़ाशी. वेफर की पीठ पर नमूनों ऑक्साइड आगे की प्रक्रिया के लिए एक खोदना मुखौटा के रूप में कार्य करता है. उजागर खिड़की में सिलिकॉन ऑक्साइड पूरी तरह से etched है कि यह सुनिश्चित करने के लिए एक खुर्दबीन के नीचे वेफर्स का निरीक्षण किया.
  22. एसीटोन में डूबा एक साफ कमरे झाड़ू का उपयोग (धार से 5 मिमी तक) वेफर के किनारे पर photoresist निकालें.
  23. साथ एक DRIE उपकरण में वेफर लोड और एक खोदना रोकने के रूप में दफन ऑक्साइड परत कामकाज के साथ 500 माइक्रोन की गहराई तक नमूनों संभाल परत खोदना एक नुस्खा चलाते हैं. के अत्यधिक ताप रोकने के लिए कई रन में इस खोदना भाजितसिलिकॉन की असंगत नक़्क़ाशी का कारण बनता है जो वेफर,. यह खोदना कदम पूरी तरह से cantilevers नीचे सिलिकॉन हटा.
  24. Cantilevers नीचे दफन ऑक्साइड परत और cantilevers के शीर्ष पर सुरक्षात्मक ऑक्साइड परत पट्टी करने के लिए, 25% पतला HF एचेंट का उपयोग कर एक गीला नक़्क़ाशी कदम प्रदर्शन.
    नोट: यह कदम सिलिकॉन cantilevers के नीचे की सतह विज्ञप्ति और भी लेजर के साथ ब्रैकट की जांच के लिए एक पहुँच प्रदान करने के लिए नीचे एक खिड़की खोलता है.
  25. एक डि पानी स्नान की श्रृंखला और नाइट्रोजन के साथ सावधानी से सूखे का उपयोग वेफर कुल्ला. Cantilevers उनके ठिकानों पर ही समर्थन कर रहे हैं के बाद से, सीधे cantilevers पर डि पानी या अक्रिय गैस की सशक्त स्प्रे का उपयोग नहीं करते.
  26. संभाल परत खोदना कदम के दौरान उत्पादन फोड़ना पंक्तियों के साथ वेफर से व्यक्तिगत चिप्स फोड़ना.

2 सेल संस्कृति

  1. पहले प्रकाशित तरीकों 17 के अनुसार 13F coverslips तैयार करें.
    नोट: यदि 13F कोवrslips उपलब्ध नहीं हैं, 95 डिग्री के ऊपर एक संपर्क कोण के साथ किसी भी हाइड्रोफोबिक सतह इस्तेमाल किया जा सकता है.
  2. ब्रैकट चिप्स और एक 70% इथेनॉल समाधान में 13F coverslips जीवाणुरहित और एक प्रवाह हुड में शुष्क हवा की अनुमति देते हैं.
  3. एक मानक 12 अच्छी तरह से थाली अंदर 13F coverslips के शीर्ष पर व्यक्ति ब्रैकट चिप्स रखें.
  4. कोट सेल प्रकार के लिए अनुकूलित biopolymer या सतह संशोधन के साथ cantilevers मानक सेल संस्कृति प्रोटोकॉल के अनुसार इस्तेमाल किया जा रहा है.
  5. वांछित एकाग्रता को उनके विशिष्ट मध्यम विकास में कोशिकाओं फिर से निलंबित.
    नोट: इस प्रोटोकॉल ब्रैकट खिड़की के माध्यम से गिरने और वांछित ब्रैकट सतह का पालन नहीं कोशिकाओं की एक पर्याप्त संख्या में परिणाम होगा. सेल तैयारी इसलिए मानक coverslip की तैयारी के लिए अधिक से अधिक ध्यान केंद्रित 3-4x बनाया जाना चाहिए. उदाहरण के लिए, चूहे कंकाल की मांसपेशी उपग्रह कोशिकाओं के बोने आम तौर पर 500 से 700 कोशिकाओं / वर्ग मिमी 15,16 के एक बोने घनत्व का उपयोग किया जाता है, और / वर्ग मिमी 2,000 कोशिकाओं पर ब्रैकट substrates के साथ किया जाता है. अनुकूलन प्रयोगों एक उपयुक्त बोने घनत्व का पता लगाने के लिए नए सेल के सूत्रों से बाहर किया जाना चाहिए.
  6. मध्यम का बुलबुला पूरी तरह ब्रैकट खिड़कियों को शामिल किया गया है, यह सुनिश्चित ब्रैकट चिप सतह पर सेल निलंबन के 200 μl पिपेट. मध्यम खिड़की के माध्यम से wicks और cantilevers के शीर्ष पर एक स्थिर बुलबुला फार्म नहीं करता है 13F coverslip जगह और चढ़ाना reattempt.
  7. एक मशीन के लिए चिप्स युक्त प्लेट हस्तांतरण और कोशिकाओं को कम से कम 1 घंटा (अधिमानतः 2-3 घंटा) के लिए पालन करने के लिए अनुमति देते हैं.
  8. इस चढ़ाना अवधि के बाद, मध्यम विकास के 1 मिलीलीटर के साथ संस्कृति एक 13F coverslip के बिना, एक साफ अच्छी तरह से करने के लिए चिप हस्तांतरण, और ऊपर बाँझ संदंश का उपयोग करें.
  9. इनक्यूबेटर थाली लौटें.
  10. Coverslips पर इन विट्रो रखरखाव के लिए उनके मानक प्रोटोकॉल के अनुसार कोशिकाओं को बनाए रखें. कंकाल की मांसपेशी कोशिकाओं के लिए,कोशिकाओं मिला हुआ जरूरी होगा बनने एक बार मध्यम रचना का एक स्विच myotube गठन को प्रेरित करने के लिए.

ब्रैकट विक्षेपन विश्लेषण के लिए हार्डवेयर और सॉफ्टवेयर के 3 सेटअप

  1. एक ईमानदार इलेक्ट्रोफिजियोलॉजी खुर्दबीन के मंच में एक गर्म संस्कृति पकवान.
  2. गरम खुर्दबीन मंच कोशिकाओं वर्तमान में (10 मिमी HEPES) में निलंबित कर रहे हैं खिला मध्यम के 3 मिलीलीटर जोड़ें.
  3. 15 मिमी की जुदाई दूरी पर गर्म संस्कृति डिश के अंदर पर स्टेनलेस स्टील इलेक्ट्रोड माउंट और, एक पल्स जनरेटर को अलग तीव्रता, आवृत्ति, और तरंग के क्षेत्र उत्तेजना दालों के उत्पादन में सक्षम उन्हें कनेक्ट, सिस्टम क्षेत्र उत्तेजना का उत्पादन करने की अनुमति उचित जब कोशिकाओं की.
  4. , माइक्रोस्कोप मेज के नीचे करने के लिए, XY translational चरणों पर घुड़सवार एक हीलियम नियॉन लेजर बोल्ट और लेजर बीम एक 30 डिग्री कोण relativ पर गर्म संस्कृति डिश के आधार के माध्यम से निर्देश दिया है कि ताकि इसे समायोजितब्रैकट के विमान के लिए ई.
  5. खुर्दबीन मंच के नीचे करने के लिए, XY translational चरणों पर घुड़सवार एक वृत्त का चतुर्थ भाग तस्वीर डिटेक्टर मॉड्यूल बोल्ट और 4 quadrants के केंद्र में परिलक्षित लेजर बीम भूमि. 2 चित्रा इतना है कि स्थिति को समायोजित की स्थापना की हार्डवेयर की एक सिंहावलोकन प्रदान करता है वर्णित प्रोटोकॉल को लागू करने के लिए आवश्यक.
  6. Cantilevers भर स्कैन कि रैखिक actuators नियंत्रित करने के लिए एक सॉफ्टवेयर प्रोग्राम लिखें. चित्रा 3 में प्रदान प्रवाह चार्ट के संदर्भ में सॉफ्टवेयर प्रोग्राम लिखें. इस प्रणाली के साथ प्रयोग के लिए प्रोग्राम ग्राफिकल इंटरफ़ेस चित्रा 4 में प्रदान की जाती है.

4 रिकॉर्डिंग ब्रैकट विक्षेपन डेटा

  1. ब्रैकट विश्लेषण हार्डवेयर और संबद्ध सॉफ्टवेयर ऑन करें.
  2. मध्यम में गर्म चरण thermistor डालें और यह 37 डिग्री सेल्सियस को पढ़ने के लिए प्रतीक्षा करें.
  3. Cantileve के साथ मंच में ब्रैकट चिप डालेंमंच के दाहिने हाथ की ओर की ओर उन्मुख रुपये.
  4. माइक्रोस्कोप प्रकाश स्रोत पर बारी.
  5. Cantilevers मानते हुए मंच के अधिकार, ब्रैकट 1 के लिए उन्मुख होते हैं: देखने में cantilevers के किनारों लाने और ब्रैकट 1 नोट की नोक पर लेजर बीम की स्थिति के लिए लेजर / फोटो डिटेक्टर नियंत्रण सॉफ्टवेयर का उपयोग करने के लिए माइक्रोस्कोप फोकस सरणी के ऊपर छोड़ दिया में तैनात एक है और संख्या नीचे बाएँ में नीचे 16 से चलाते हैं. ब्रैकट 17 शीर्ष सही स्थिति में है और नीचे सही (चित्रा 5A) में 32 को चलाता है.
  6. प्रेस रिकॉर्डिंग सॉफ्टवेयर पर 'खेल'.
  7. संकेत फोटो डिटेक्टर नियंत्रित stepper मोटर्स का समायोजन करके एक्स और वाई फ्रेम दोनों में "0" पढ़ता है तो फोटो डिटेक्टर स्थिति.
  8. लेजर / फोटो डिटेक्टर नियंत्रण सॉफ्टवेयर में सेट ब्रैकट 1 स्थिति (चित्रा 4).
  9. . कदम 4.7 दोहराने, ब्रैकट 16 की टिप करने के लिए लेजर ले जाएँ, और cantilev सेटएर लेजर / फोटो डिटेक्टर नियंत्रण सॉफ्टवेयर में 16 की स्थिति.
  10. लेजर / फोटो डिटेक्टर नियंत्रण सॉफ्टवेयर में कदम 4.7., और सेट ब्रैकट 32 की स्थिति को दोहराने, ब्रैकट 32 की टिप करने के लिए लेजर ले जाएँ.
  11. लेजर / फोटो डिटेक्टर नियंत्रण सॉफ्टवेयर में कदम 4.7., और सेट ब्रैकट 17 की स्थिति को दोहराने, ब्रैकट 17 की टिप करने के लिए लेजर ले जाएँ.
  12. माइक्रोस्कोप प्रकाश स्रोत और प्रयोगशाला में भूमि के ऊपर प्रकाश बंद करें.
  13. रिकॉर्डिंग सॉफ्टवेयर पर प्रेस "रिकॉर्ड".
  14. 1 हर्ट्ज की एक आवृत्ति पर 40 मिसे, 5 वी दालों के लिए पल्स जनरेटर हार्डवेयर सेट, और पर मशीन बारी.
    नोट: वैकल्पिक रूप से, इस बिंदु पर विशेष सेल के सूत्रों के लिए अनुकूलित उत्तेजना प्रोटोकॉल को रोजगार, कहा सेटिंग्स मानव और कृंतक सेल सूत्रों 12,13,15,16 का उपयोग कर एकत्र आंकड़ों के आधार पर दिशा निर्देश हैं.
  15. लेजर / फोटो डिटेक्टर नियंत्रण सॉफ्टवेयर का उपयोग करना, प्रत्येक पर कम से 5 सेकंड के लिए रोक, 32 ब्रैकट सरणी पार स्कैन करने के लिए हार्डवेयर सेटई.
  16. 32 cantilevers की स्कैन पूरा हो गया है, तो रिकॉर्डिंग सॉफ्टवेयर रोकने के लिए और डेटा फ़ाइल को लाने, उत्तेजक बंद कर देते हैं.
  17. सिकुड़ा गतिविधि के सबूत के लिए प्रत्येक ब्रैकट से दर्ज ट्रेस की जाँच करें. सकारात्मक प्रतिक्रियाओं के साथ एक ब्रैकट के एक नोट करें. विक्षेपन आधारभूत ऊपर कम से कम 0.1 वी है अगर एक संकुचन एक चोटी के रूप में परिभाषित किया गया है.
  18. लेजर / फोटो डिटेक्टर नियंत्रण सॉफ्टवेयर पर स्कैन प्रोटोकॉल से किसी भी गैर जिम्मेदार cantilevers निकालें.
  19. सक्रिय cantilevers तो सेल का सहज सिकुड़ा गतिविधि का एक पढ़ पाने के क्रम में उत्तेजना के बिना rescanned किया जा सकता है.
  20. संवर्धित कोशिकाओं के कार्यात्मक उत्पादन पर उसके प्रभाव का निरीक्षण करने के क्रम में मध्यम करने के लिए एक चिकित्सकीय यौगिक के अलावा के बाद, साथ या व्यापक क्षेत्र बिजली की उत्तेजना के बिना स्कैन चलाने.
  21. विद्युत विस्तारित अवधि और contr की स्कैनिंग के स्तर के लिए कोशिकाओं उत्तेजक से थकान के मूल्यांकन के लिए बाहर ले actility यह एक विशिष्ट सीमा से नीचे ड्रॉप करने के लिए पीक बल के लिए कितना समय लेता है को मापने के लिए.
  22. मोटर न्यूरॉन्स मांसपेशी के साथ सह संस्कृति में रखा जाता है जहां प्रयोगों में, neuromuscular एक न्यूरोनल उत्तेजक साथ motoneuron-myotube ब्रैकट सह संस्कृतियों के उपचार के माध्यम से जंक्शन गठन (जैसे ग्लूटामेट के रूप में) या synaptic अवरोध उपाय (जैसे, डी tubocurarine) और स्कैनिंग के लिए सहज गतिविधि में बढ़ जाती है और कम हो जाती है क्रमशः 16.
  23. योजना बनाई प्रयोगों की जरूरतों से तय रूप में विशिष्ट स्कैन प्रदर्शन.

ब्रैकट विक्षेपन डेटा के 5 विश्लेषण

  1. उपयोग स्टोनी के समीकरण 15 सेल परत या myotube (pascals में), और (नैनो न्यूटन में) सेलुलर सिकुड़ा बल का एक सीधा माप में तनाव का एक readout में (वोल्ट में) कच्चे ब्रैकट विक्षेपन डेटा परिवर्तित करने के लिए (नीचे विस्तृत) संशोधित:
    विज्ञापन / 51866 / 51866eq1.jpg "/> 1 समीकरण
    2 समीकरण 2 समीकरण
  2. Δ = ब्रैकट टिप विक्षेपन और तनाव myotube द्वारा उत्पादित कहां, σ सी एक समान मोटी फिल्म ब्रैकट, सी डिटेक्टर की पूरी चौड़ाई संभालने myotube द्वारा उत्पादित = तनाव, = तस्वीर पर लेजर स्थिति के लिए वोल्टेज से संबंधित प्रणाली विशिष्ट गुणांक -detector, θ = ब्रैकट के विमान को लेजर डिटेक्टर और रिश्तेदार के कोण, ई सी सिलिकॉन की लोचदार मापांक =, टी सी ब्रैकट की मोटाई =, टी च = myotube मोटाई, वी सी = के जहर का अनुपात सिलिकॉन, एल = ब्रैकट लंबाई, डिटेक्टर को ब्रैकट टिप से लेजर के पी = पथ की लंबाई, और w चित्रा 6 में प्रदान की जाती है.
  3. एक वर्दी फिल्म myotube है मान लिया जाये, myotube में बल स्टोनी के आवेदन के लिए इस्तेमाल किया गया था कि तनाव से बल की गणना और ग्रहण सेल पार अनुभागीय क्षेत्र equating द्वारा, 3 समीकरण के लिए अग्रणी फिल्म में बल के बराबर है समीकरण.
    3 समीकरण 3 समीकरण
  4. कार्यात्मक डेटा संग्रह के बाद, immunocytochemical विश्लेषण के लिए ब्रैकट चिप्स ठीक है या मानक तकनीक का उपयोग प्रोटीन या डीएनए विश्लेषण के लिए कोशिकाओं का उपयोग.
  5. वैकल्पिक रूप से, एक बाद में समय बिंदु पर कार्यात्मक प्रदर्शन पुनर्मूल्यांकन के क्रम में इनक्यूबेटर के बजाय आणविक विश्लेषण के लिए तैयारी करने के लिए कोशिकाओं वापसी.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Cantilevers पर सिकुड़ा कोशिकाओं के सफल संस्कृति मानक सेल संस्कृति तकनीक (चित्रा 5) का उपयोग, एक अपेक्षाकृत सरल प्रक्रिया है. करार कोशिकाओं समर्थन cantilevers का प्रतिशत सेल प्रकार के आधार पर अलग अलग होंगे की जांच की और विशिष्ट संस्कृति तकनीक नियोजित किया जा रहा. चूहे हिंद अंग से व्युत्पन्न प्राथमिक भ्रूण कोशिकाओं का प्रयोग, सिकुड़ा गतिविधि की जांच की cantilevers के 12% पर पता चला था (n = 4). वर्णित लेजर और फोटो डिटेक्टर सिस्टम का उपयोग सिकुड़ा समारोह का विश्लेषण वरीयता प्राप्त कोशिकाओं के कार्यात्मक परिपक्वता से संबंधित सटीक वास्तविक समय डाटा प्रदान करता है. चित्रा 7 में सचित्र के रूप में मानक electrophysiological सॉफ्टवेयर के उपयोग तो, इस तरह के आधा विश्राम के लिए शिखर बल, बल चोटी करने के लिए समय है, और समय के रूप में प्रासंगिक कार्यात्मक संपत्तियों की गणना की सुविधा, कच्चे डेटा का विश्लेषण करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है. बाद डेटा संग्रह इलाज संस्कृतियों से चिकित्सकीय यौगिकों के साथ के लिए अनुमति देता हैसाथ और दवा अलावा बिना कार्यात्मक गुणों की तुलना, जिससे परिसर गतिविधि और इन विवो प्रतिक्रियाओं के बाद भविष्यवाणी के आकलन सक्षम करने से. इसके अलावा, बढ़ाया उत्तेजना प्रोटोकॉल इस प्रकार इस प्रणाली (8 चित्रा) से प्राप्य शारीरिक डेटा के स्तर को विस्तृत बनाने, संवर्धित कोशिकाओं में थकान की दरों का आकलन करने के लिए साधन उपलब्ध कराते हैं.

ब्रैकट संस्कृति विट्रो में neuromuscular synapse गठन (9 चित्रा) के मूल्यांकन की अनुमति के रूप में तो. ऐसी संस्कृतियों में, सहज सिकुड़ा गतिविधि की दरों की दरों की तुलना कर रहे हैं, कंकाल की मांसपेशी myotubes 16 के साथ संस्कृति प्रणाली में मोटर न्यूरॉन्स शामिल करने के लिए संशोधित किया जा सकता है ऐसे ग्लूटामेट के रूप में एक न्यूरॉन विशिष्ट उत्तेजक, के साथ उपचार के जवाब में संकुचन. संकुचन दरों में कोई मनाया ग्लूटामेट प्रेरित बढ़ जाती है acetylcholine रिहाई और बाद myo के लिए अग्रणी, सभ्य न्यूरॉन्स की सक्रियता का सुझावट्यूब सक्रियण. ग्लूटामेट प्रेरित गतिविधि की समाप्ति के लिए अग्रणी ऐसे acetylcholine रिसेप्टर अवरोधक डी tubocurarine रूप synaptic अवरोधकों,, के साथ इलाज इन संस्कृतियों 16 में कार्यात्मक neuromuscular synapses की उपस्थिति के लिए और सबूत प्रदान करते हैं.

चित्रा 1

चित्रा 1 योजनाबद्ध ब्यौरा ब्रैकट निर्माण की प्रक्रिया प्रवाह. प्रवाह आरेख में सूचीबद्ध संख्या शीर्षक तरीकों खंड में प्रोटोकॉल कदम को सहसंबंधी "ब्रैकट चिप निर्माण." इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें.

चित्रा 2
चित्रा 2 हार्डवेयरcantilevers पर सेलुलर संकुचन का आकलन करने के लिए इस्तेमाल किया लेजर / फोटो डिटेक्टर सिस्टम का ब्यौरा. ब्रैकट मूल्यांकन के लिए इस्तेमाल किया संशोधित electrophysiological माइक्रोस्कोप (ए) तस्वीर. लेजर (मैं) और फोटो डिटेक्टर (द्वितीय) XY translational चरणों पर मंच के नीचे रखा जाता है. एक पारदर्शी संस्कृति पकवान मंच के नीचे के माध्यम से ब्रैकट सरणी के लिए लेजर पारित होने की अनुमति देता है जो मंच (तीन), पर मुहिम शुरू की है. (बी) योजनाबद्ध "ऊपर से नीचे" खुर्दबीन मंच के परिप्रेक्ष्य. XY translational चरणों एक सरणी में प्रत्येक ब्रैकट पूछताछ के लिए लेजर के आंदोलन की सुविधा, एक्स और वाई विमानों (लाल तीर) दोनों में लेजर और फोटो डिटेक्टर की आवाजाही की अनुमति है. ब्रैकट चिप्स (iii) लेजर (मैं) की तस्वीर के ऊपर बंद (सी). सही ढंग से संचालित करने के लिए प्रणाली के लिए आदेश में मंच के दाहिने ओर का सामना करना पड़ cantilevers के साथ मंच में रखा जाना चाहिए औरफोटो डिटेक्टर (द्वितीय) खुर्दबीन मंच के नीचे रखा होगा. लेजर ब्रैकट चिप (θ) के विमान को एक 30 डिग्री कोण रिश्तेदार पर तैनात है. (डी) संस्कृति पकवान की तस्वीर के ऊपर बंद करें. बिजली की उत्तेजना चांदी इलेक्ट्रोड की एक जोड़ी के माध्यम से लागू किया जाता है व्यापक क्षेत्र के अलावा 15 मिमी तैनात (चतुर्थ). पकवान के नीचे से जुड़ी एक हीटिंग तत्व (वी) के विश्लेषण के दौरान 37 डिग्री सेल्सियस पर संस्कृति को बनाए रखने के लिए प्रयोग किया जाता है. तापमान नियंत्रण गतिशील, और मध्यम () नहीं दिखाया में रखा एक thermistor के माध्यम से नियंत्रित किया है. इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें.

चित्रा 3
नियंत्रण के लिए सॉफ्टवेयर अंतर्निहित तर्क की चित्रा 3 फ्लो चार्ट. उपयोगकर्ता इनपुट और स्कैनिंग गति को नियंत्रित करता है कि एक पाश के लिए एक मुख्य पाश: लेजर और फोटो डिटेक्टर दो सॉफ्टवेयर की स्कैनिंग नियंत्रण गति छोरों. मुख्य पाश में, उच्च throughput डेटा संग्रह करने के लिए मध्यम के लिए दूसरे लूप के सक्रियण द्वारा पीछा किया, जबकि सेटअप किया जाता है. इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें.

चित्रा 4
सॉफ्टवेयर की चित्रा 4 ग्राफिकल यूजर इंटरफेस ब्रैकट मूल्यांकन के दौरान लेजर और फोटो डिटेक्टर स्थिति को नियंत्रित करने के लिए प्रयोग किया जाता है. (ए) बटन मैन्युअल जिससे करने के लिए सॉफ्टवेयर की अनुमति, मैन्युअल 4 कोने cantilevers के पदों पर स्थापित करने के लिए नियंत्रण. (बी) एक्स और वाई विमानों दोनों में लेजर और फोटो डिटेक्टर स्थिति को नियंत्रित (1, 16, 17, और 32) कोसरणी में शेष cantilevers के पदों एक्सट्रपलेशन. (सी) नियंत्रण उपयोगकर्ताओं में शामिल करने के लिए cantilevers जो चुनने के लिए अनुमति प्रत्येक स्कैन. इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें.

चित्रा 5
इस प्रणाली में इस्तेमाल के लिए एक कस्टम बनाया ब्रैकट चिप के 5 छवियाँ चित्रा, और इसी तरह की सतहों पर बनाए रखा कोशिकाओं के प्रतिनिधि छवियों. एक एकल, कस्टम बनाया ब्रैकट चिप (ए) तस्वीर. प्रत्येक चिप शीर्ष सही में छवि और ब्रैकट 32 के नीचे बाएँ में तैनात है 16 ब्रैकट 1 से 2 पंक्तियों में व्यवस्थित 32 cantilevers शामिल हैं. ब्रैकट चिप्स 15 x 15 मिमी 2. प्राथमिक चूहे कंकाल की मांसपेशी कोशिकाओं (बी) चरण विपरीत छवि ब्रैकट पर हो रहे हैंएस. प्रत्येक ब्रैकट मोटी 750 100 माइक्रोन विस्तृत लंबे माइक्रोन, और 4 माइक्रोन. (सी) एक ब्रैकट पर बनाए रखा एक प्राथमिक चूहा myotube के Immunocytochemical दाग है. प्रकोष्ठों मायोसिन भारी श्रृंखला के लिए एक एंटीबॉडी जांच का उपयोग दाग रहे थे. सिकुड़ा मशीनरी की परिपक्वता का संकेत है, सुसंस्कृत फाइबर की धारीदार उपस्थिति ध्यान दें. ब्रैकट किनारों कृत्रिम पैमाने का एक संकेत प्रदान करने के लिए इस छवि में प्रकाश डाला गया है. इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें.

चित्रा 6
Cantilevers पर myotubes द्वारा उत्पादित बल पाने के लिए स्टोनी के समीकरण में प्रयुक्त शब्दों illustrating चित्रा 6 योजनाबद्ध. Myotube, सी द्वारा उत्पादित δ = ब्रैकट टिप विक्षेपन और तनावडिटेक्टर = तस्वीर डिटेक्टर पर लेजर स्थिति के लिए वोल्टेज से संबंधित प्रणाली विशिष्ट गुणांक, θ = ब्रैकट के विमान को लेजर डिटेक्टर और रिश्तेदार के कोण, ई सी सिलिकॉन की लोचदार मापांक =, टी सी की मोटाई = ब्रैकट, टी च = myotube मोटाई, वी सी = सिलिकॉन के जहर का अनुपात, एल = ब्रैकट लंबाई, और डिटेक्टर को ब्रैकट टिप से लेजर के पी = पथ की लंबाई. इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें.

चित्रा 7
7 चित्रा प्रतिनिधि कच्चे डेटा और वर्णित ब्रैकट प्रणाली का उपयोग सिकुड़ा फार्म का विश्लेषण. (ए) cantilevers पर प्राथमिक चूहा myotubes के व्यापक क्षेत्र बिजली की उत्तेजना से एक कच्चे डेटा का पता लगाने के उदाहरण. ब्रैकट पर तनाव लंबाई का संकेत ऊपर ट्रेस = एक्स अक्ष में (वोल्ट में) लेजर विक्षेपन,. ब्रैकट भर में मरोड़ तनाव का संकेत मध्य ट्रेस = वाई अक्ष में (वोल्ट में) लेजर विक्षेपन,. निचला ट्रेस = इस प्रणाली में myotube संकुचन को प्रकाश में लाना करने के लिए इस्तेमाल बिजली दालों के अस्थायी स्थिति का संकेत है. (बी) के मानक इलेक्ट्रोफिजियोलॉजी सॉफ्टवेयर का उपयोग करना, यह शिखर बल (पीएफ) को मापने के लिए संभव है, समय आधा करने के लिए बल (टीटीपी) और समय चोटी प्राथमिक चूहे कंकाल की मांसपेशी myotubes से एकत्र कच्चे डेटा से छूट (1/2 आरटी). (सी) collated संकुचन डेटा (n = 11). एक संशोधित स्टोनी के समीकरण के आवेदन वोल्ट में कच्चे डेटा रीडिंग से ब्रैकट तनाव की गणना की अनुमति देता है. इस डेटा से, (न्यूटन में) बल के प्रत्यक्ष गणना भी उत्पन्न हो सकता है. डब्ल्यू reprinted प्रकाशित डेटाith अनुमति 13. इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें.

चित्रा 8
चित्रा ब्रैकट संस्कृतियों में कंकाल की मांसपेशी थकान के विश्लेषण का प्रदर्शन 8 प्रतिनिधि डेटा. (वोल्ट में) कच्चे डेटा myotube (नैनो न्यूटन में) बल और फिर से साजिश रची का एक माप को परिवर्तित कर दिया गया. डाटा 0 मिनट (काला ट्रेस) और निरंतर उत्तेजना की 120 मिनट (ग्रे ट्रेस) के बाद 1 हर्ट्ज व्यापक क्षेत्र विद्युत दालों के जवाब में cantilevers पर myotube संकुचन की भयावहता को दिखाता है. इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें.

9 चित्रा साथ और एक neuromuscular अवरोधक के अलावा बिना motoneuron उत्तेजना के कार्यात्मक प्रभाव का प्रदर्शन, cantilevers पर बनाए रखा एक कंकाल की मांसपेशी-motoneuron सह संस्कृति के विश्लेषण से 9 चित्रा प्रतिनिधि निशान. (वोल्ट में) कच्चे डेटा myotube की एक माप को परिवर्तित कर दिया गया के बल और (नैनो न्यूटन में) फिर से साजिश रची है. न्यूरोनल उत्तेजना के बिना सभ्य myotubes द्वारा सहज संकुचन की (ए) मापन. 200 माइक्रोन ग्लूटामेट के अलावा के माध्यम से neuronal उत्तेजना निम्नलिखित myotube संकुचन (बी) मापन. (सी) मापन ग्लूटामेट और 12.5 माइक्रोन डी tubocurarine इलाज के बाद myotube संकुचन. अनुमति 16 के साथ reprinted प्रकाशित आंकड़ों. इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें.

निम्न तालिका ब्रैकट मूल्यांकन करने के लिए आवश्यक वर्णित सत्यापन प्रयोगों में संस्कृति कोशिकाओं को इस्तेमाल किया विशिष्ट अभिकर्मकों, साथ ही उपकरणों की सूची. इस्तेमाल किया संस्कृति अभिकर्मकों आवश्यक नहीं कर रहे हैं और इस प्रणाली को आसानी से इन विट्रो में सिकुड़ा कोशिकाओं को बनाए रखने के लिए किसी भी प्रयोगशाला की संस्कृति प्रोटोकॉल के साथ एकीकृत किया जाना चाहिए कि कृपया ध्यान दें. प्रदान की जाती हैं सूचीबद्ध अभिकर्मकों जांचकर्ताओं वर्णित विशिष्ट प्रयोगात्मक परिणामों को दोहराने की इच्छा चाहिए.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

सेलुलर संकुचन के सबूत के लिए microscale cantilevers का विश्लेषण करने में महत्वपूर्ण कदम खुर्दबीन मंच के भीतर ब्रैकट चिप की नियुक्ति, और सरणी में कोने cantilevers की नोक के साथ लेजर और फोटो डिटेक्टर के बाद संरेखण हैं. यह सही ढंग से नहीं किया जाता है, तो सॉफ्टवेयर संभावित डेटा संग्रह के दौरान झूठी नकारात्मक के संचय के लिए अग्रणी सरणी में शेष cantilevers के पदों एक्सट्रपलेशन करने में असमर्थ हो जाएगा. ऑपरेटर्स ब्रैकट चिप लेजर पदों औजार से पहले संस्कृति डिश के नीचे से भरा पड़ा हुआ है कि यह सुनिश्चित करने के लिए ध्यान रखना चाहिए. चिप पकवान में एक कोण पर बैठता है, यह सीधे रास्ते से फिर लेजर बीम के रास्ते में परिवर्तन और डेटा संग्रह उलझाना जाएगा.

एक कार्यात्मक एयर तालिका डेटा संग्रह के दौरान पृष्ठभूमि कंपन को रद्द करने के लिए नियोजित किया जाना चाहिए. इस अध्ययन जनसंपर्क में इस्तेमाल किया cantilevers के छोटे मोटाई (लगभग 4 माइक्रोन)ovides उच्च सिकुड़ा गतिविधि के प्रति संवेदनशीलता, लेकिन कंपन करने के लिए वृद्धि की संवेदनशीलता के पक्ष प्रभाव पड़ता है. ऑपरेटर्स पृष्ठभूमि रीडिंग कम करने के लिए, डेटा रिकॉर्डिंग के दौरान संभव के रूप में छोटे रूप में हार्डवेयर चारों ओर स्थानांतरित करने के लिए ध्यान रखना चाहिए. मंच में ब्रैकट चिप रखकर अंत में, जब अच्छी तरह से संस्कृति में उत्तेजक चांदी इलेक्ट्रोड के साथ संपर्क में नहीं आती चिप सुनिश्चित करने के लिए ध्यान रखना. चिप को छू इलेक्ट्रोड के साथ व्यापक क्षेत्र उत्तेजना के आवेदन मौजूदा मार्ग में परिवर्तन और नकारात्मक प्रभावी रूप से संवर्धित कोशिकाओं को उत्तेजित करने के लिए प्रणाली की क्षमता पर असर होगा.

कंकाल की मांसपेशी myotubes में बल उत्पादन की अधिक सटीक रीडिंग प्राप्त करने के लिए, यह अत्यधिक एक बार कार्यात्मक विश्लेषण पूरा हो गया है संवर्धित कोशिकाओं के immunostaining प्रदर्शन करने के लिए सिफारिश की है. सूचीबद्ध समीकरणों बल की गणना करने के क्रम में एक myotube के पार के अनुभागीय क्षेत्र (सीएसए) के निवेश की आवश्यकता होती है. एक ग्रहण मूल्य पी के आधार पर इस्तेमाल किया जा सकता हैछला डेटा, करार myotube द्वारा लगाए गए बल का एक और अधिक सटीक आकलन प्रदान करेगा confocal इमेजिंग तकनीक का उपयोग कर एक myotube सटीक सीएसए की माप. सवाल में सेल की शारीरिक विशेषताओं के लिए कच्चे संकुचन डेटा सम्बन्धित कई cantilevers भर में सामान्य परिणामों में बहुमूल्य और प्रयोगात्मक शर्तों के बीच 15, और दवा इलाज या बीमारी को पूरी ऊतक प्रतिक्रियाओं की सटीक भविष्यवाणी पैदा करने के लिए इसलिए महत्वपूर्ण है. स्टोनी के समीकरण जांच myotubes तो प्रयास ही इस धारणा के साथ पालन जो कोशिकाओं से प्राप्त आंकड़ों को शामिल करने के प्रयास किए जाने चाहिए ब्रैकट की पूरी लंबाई अवधि मान. यह संभव नहीं है, परिमित तत्व विश्लेषण पहले से 15 प्रकाशित ही छोटे myotubes से बल का सही माप प्रदान करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है. इस विश्लेषणात्मक विधि कहीं अधिक श्रम गहन है, और इसलिए उच्च throughput आवेदन करने के लिए बीमार अनुकूल है, लेकिन अनुकूलित यदि आवश्यक हो सकता हैस्टोनी की मान्यताओं के अनुरूप सेल संस्कृतियों प्राप्त नहीं किया जा सकता है.

पहले से ही कहा गया है, संस्कृति मापदंडों मानक coverslip तैयारी से स्थानांतरित किया जा सकता. हालांकि, यह दवा स्क्रीनिंग अनुप्रयोगों में इस प्रणाली के उपयोग के लिए सीरम मुक्त मीडिया रचनाओं और गैर जैविक substrates के उपयोग पर विचार करने की सलाह दी है. कारण पशु सीरा की अपरिभाषित प्रकृति के उपन्यास चिकित्सा विज्ञान के प्रभाव मध्यम संस्कृति में ऐसे additives के शामिल किए जाने से चकित किया जा सकता है. सीरम मुक्त मीडिया योगों कृंतक और मानव कंकाल की मांसपेशी संस्कृतियों 18-21 और यौगिक आकलन के प्रदर्शन के लिए एक अधिक नियंत्रित, अच्छी तरह से परिभाषित वातावरण प्रदान दोनों के लिए उपलब्ध हैं. इसी तरह, cantilevers पर जैविक कोटिंग्स (कोलेजन, laminin, आदि) का उपयोग गैर जैविक substrates के आवेदन से परहेज कर रहे हैं जो सेल की तैयारी करने के लिए परिवर्तनशीलता परिचय. संस्कृति सतहों पर silane आत्म इकट्ठे monolayers का बयान पूर्व दिखाया गया हैtensively कई प्रकार की कोशिकाओं 16,18,20,22-31 का पालन और विकास का समर्थन है, और एक विश्वसनीय और repeatable ढंग से पूरी तरह से परिभाषित सतहों उत्पन्न करने के लिए साधन का प्रतिनिधित्व करने के लिए.

कारण स्तनधारी सिस्टम में मौजूद सिकुड़ा कोशिकाओं की श्रृंखला के लिए, इन विट्रो assays के लिए इस मॉडल के आवेदन अपेक्षाकृत व्यापक है. कंकाल की मांसपेशी कोशिकाओं का उपयोग कर अनुकूलित हालांकि, प्रणाली वास्तविक समय में इन कोशिकाओं में उपन्यास चिकित्सा विज्ञान के लिए खुराक प्रतिक्रियाओं का तेजी से मूल्यांकन करने के लिए साधन उपलब्ध कराने, साथ ही मांसपेशियों की कोशिकाओं और cardiomyocytes सुचारू करने के लिए संभावित लागू है. वर्तमान ब्रैकट चिप्स 32 cantilevers (चित्रा 5A) की एक सरणी से मिलकर, लेकिन आसानी से कई और अधिक शामिल करने के लिए परिवर्तित किया जा सकता है. ऐसे सरणियों का विश्लेषण जिससे बहुत किसी भी मनाया मतभेद के सांख्यिकीय शक्ति में वृद्धि, एक ही संस्कृति से डेटा बिंदुओं की एक पर्याप्त संख्या पैदा करता है. चित्रा 8, कोशिकाओं सुसंस्कृत में सबूत के रूप मेंइस प्रणाली में इस संस्कृति मॉडल को innervating मोटर न्यूरॉन्स की इन विट्रो. इसके अलावा कोशिकाओं की सहनशीलता स्तर पर दवा प्रभाव के आकलन की अनुमति, सतत व्यापक क्षेत्र उत्तेजना के जवाब में, समय के साथ थकान से गुजरना भी मांसपेशियों की माप के माध्यम से synapse गठन के आकलन की अनुमति देता है न्यूरोनल उत्तेजक के जवाब में संकुचन (9 चित्रा). एक मल्टिप्लेक्स परख में आधारभूत कार्यात्मक मापदंडों का माप (चित्रा 7) इन विट्रो संस्कृतियों का मानक biomolecular आकलन से अधिक स्पष्ट फायदे हैं, neuromuscular कार्यक्षमता और वरीयता प्राप्त कोशिकाओं की सहनशीलता की क्षमता का आकलन करने की क्षमता बहुत दवा स्क्रीनिंग के लिए इस मॉडल की प्रयोज्यता बढ़ जाती है और रोग मॉडलिंग अनुप्रयोगों. वर्णित तकनीक जांचकर्ताओं इन विट्रो में स्वस्थ और रोगग्रस्त मांसपेशी कोशिकाओं दोनों के तेजी से, कम लागत कार्यात्मक मूल्यांकन करने के लिए साधन उपलब्ध कराता है. संस्कृति प्रणाली की बहुमुखी प्रतिभा, और जकच्चे डेटा के विश्लेषण से प्राप्य कार्यात्मक विस्तार की igh स्तर, उपन्यास, रोग और रासायनिक चुनौतियों का सामना करने में विवो ऊतक प्रतिक्रियाओं की अधिक सटीक भविष्यवाणी का उत्पादन करना चाहिए.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Acknowledgments

इस शोध स्वास्थ्य अनुदान संख्या R01NS050452 और R01EB009429 के राष्ट्रीय संस्थान द्वारा वित्त पोषित किया गया. ब्रैकट चिप्स का निर्माण कॉर्नेल विश्वविद्यालय में स्थित nanofabrication सुविधा में सहयोगियों द्वारा बाह्य प्रदर्शन किया गया था. ब्रैकट निर्माण की प्रक्रिया में इस्तेमाल सभी उपकरण इस सुविधा में स्थित था. ब्रैकट माइक्रो निर्माण के साथ उनकी सहायता के लिए मैंडी Esch और जीन Matthieu प्रॉट के लिए विशेष धन्यवाद. ब्रैकट कार्यक्षमता का वीडियो एनिमेशन UCF पर सिंथेटिक हकीकत लैब से चार्ल्स ह्यूजेस, एलेक्स Zelenin और एरिक Imperiale द्वारा उत्पन्न किया गया.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Primary rat muscle growth medium
Neurobasal medium Life Technologies 21103-049
B27 (50x) Life Technologies 17504044 1x
Glutamax (100x) Life Technologies 35050061 1x
G5 supplement Life Technologies 17503-012 1x
Glial-Derived Neurotrophic Factor Cell sciences CRG400B 20 ng/ml
Brain-Derived Neurotrophic Factor Cell sciences CRB600B 20 ng/ml
Ciliary Neurotrophic Factor Cell sciences CRC400A 40 ng/ml
Neurotrophin-3 Cell sciences CRN500B 20 ng/ml
Neurotrophin-4 Cell sciences CRN501B 20 ng/ml
Acidic Fibroblast Growth Factor Life Technologies 13241-013  25 ng/ml
Cardiotrophin-1 Cell sciences CRC700B 20 ng/ml
Heparin Sulphate Sigma D9809  100 ng/ml
Leukemia Inhibitory Factor Sigma L5158  20 ng/ml
Vitronectin Sigma V0132 100 ng/ml
Primary rat muscle differentiation medium
NB Activ 4 Brain Bits LLC NB4-500
Equipment
Class 2 red diode laser Newport
Photo-detector Noah Industries
Model 2100 Pulse stimulator A-M systems
Multiclamp 700B Digitizer Axon Instruments
Patch clamp microscope and stage Olympus
Delta T4 culture dish controller Bioptechs
Axoscope software Molecular Devices
LabVIEW software National Instruments
37 oC, 5% CO2 incubator NAPCO
Class 2 microbiological flow hood Labconco
Pipettes and tips Eppendorf

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Bischoff, R. Enzymatic liberation of myogenic cells from adult rat muscle. Anat. Rec. 180, 645-661 (1974).
  2. Yasin, R., et al. A quantitative technique for growing human adult skeletal muscle in culture starting from mononucleated cells. J. Neurol. Sci. 32, 347-360 (1977).
  3. Dennis, R. G., Kosnik, P. E., 2nd, Excitability and isometric contractile properties of mammalian skeletal muscle constructs engineered in vitro. In Vitro Cell Dev. Biol. Anim. 36, 327-335 (2000).
  4. Khodabukus, A., Baar, K. Defined electrical stimulation emphasizing excitability for the development and testing of engineered skeletal muscle. Tissue Eng Part C Methods. 18, 349-357 (2012).
  5. Langelaan, M. L. P., et al. Advanced maturation by electrical stimulation: Differences in response between C2C12 and primary muscle progenitor cells. Journal of tissue engineering and regenerative medicine. 5, 529-539 (2011).
  6. Stephenson, G. M., O'Callaghan, A., Stephenson, D. G. Single-fiber study of contractile and biochemical properties of skeletal muscles in streptozotocin-induced diabetic rats. Diabetes. 43, 622-628 (1994).
  7. Harber, M., Trappe, S. Single muscle fiber contractile properties of young competitive distance runners. Journal of applied physiology (Bethesda, Md: 1985). 105, 629-636 (2008).
  8. Hvid, L. G., et al. Four days of muscle disuse impairs single fiber contractile function in young and old healthy men. Experimental gerontology. 48, 154-161 (2013).
  9. Edman, K. A. Contractile performance of striated muscle. Advances in experimental medicine and biology. 682, 7-40 (2010).
  10. Krivickas, L. S., Walsh, R., Amato, A. A. Single muscle fiber contractile properties in adults with muscular dystrophy treated with MYO-029. Muscle Nerve. 39, 3-9 (2009).
  11. Sung, J. H., et al. Microfabricated mammalian organ systems and their integration into models of whole animals and humans. Lab on a chip. 13, 1201-1212 (2013).
  12. Wilson, K., Molnar, P., Hickman, J. J. Integration of functional myotubes with a Bio-MEMS device for non-invasive interrogation. Lab on a chip. 7, 920-922 (2007).
  13. Wilson, K., Das, M., Wahl, K. J., Colton, R. J., Hickman, J. Measurement of contractile stress generated by cultured rat muscle on silicon cantilevers for toxin detection and muscle performance enhancement. PLoS ONE. 5, (2010).
  14. Binnig, G., Quate, C. F., Gerber, C. Atomic Force Microscope. Physical Review Letters. 56, 930-933 (1986).
  15. Pirozzi, K. L., Long, C. J., McAleer, C. W., Smith, A. S., Hickman, J. J. Correlation of embryonic skeletal muscle myotube physical characteristics with contractile force generation on an atomic force microscope-based bio-microelectromechanical systems device. Applied physics letters. 103, 83108 (2013).
  16. Smith, A., Long, C., Pirozzi, K., Hickman, J. A functional system for high-content screening of neuromuscular junctions in vitro. Technology. 1, 37-48 (2013).
  17. Stenger, D. A., et al. Coplanar molecular assemblies of amino- and perfluorinated alkylsilanes: characterization and geometric definition of mammalian cell adhesion and growth. Journal of the American Chemical Society. 114, 8435-8442 (1992).
  18. Das, M., Rumsey, J. W., Bhargava, N., Stancescu, M., Hickman, J. J. A defined long-term in vitro tissue engineered model of neuromuscular junctions. Biomaterials. 31, 4880-4888 (2010).
  19. Rumsey, J. W., Das, M., Bhalkikar, A., Stancescu, M., Hickman, J. J. Tissue engineering the mechanosensory circuit of the stretch reflex arc: Sensory neuron innervation of intrafusal muscle fibers. Biomaterials. 31, 8218-8227 (2010).
  20. Das, M., Rumsey, J. W., Bhargava, N., Stancescu, M., Hickman, J. J. Skeletal muscle tissue engineering: A maturation model promoting long-term survival of myotubes, structural development of the excitation-contraction coupling apparatus and neonatal myosin heavy chain expression. Biomaterials. 30, 5392-5402 (2009).
  21. Das, M., et al. Developing a novel serum-free cell culture model of skeletal muscle differentiation by systematically studying the role of different growth factors in myotube formation. In Vitro Cell Dev Biol Anim. 45, 378-387 (2009).
  22. Stenger, D. A., Pike, C. J., Hickman, J. J., Cotman, C. W. Surface determinants of neuronal survival and growth on self-assembled monolayers in culture. Brain research. 630, 136-147 (1993).
  23. Hickman, J. J., et al. Rational pattern design for in vitro cellular networks using surface photochemistry. Journal of Vacuum Scienc., & Technology A: Vacuum, Surfaces, and Films. 12, 607-616 (1994).
  24. Das, M., Molnar, P., Devaraj, H., Poeta, M., Hickman, J. J. Electrophysiological and morphological characterization of rat embryonic motor neurons in a defined system. Biotechnology progress. 19, 1756-1761 (2003).
  25. Rumsey, J. W., et al. Node of Ranvier formation on motor neurons in vitro. Biomaterials. 30, 3567-3572 (2009).
  26. Murugan, R., Molnar, P., Rao, K. P., Hickman, J. J. Biomaterial Surface patterning of self assembled monolayers for controlling neuronal cell behavior. International journal of biomedical engineering and technology. 2, 104-134 (2009).
  27. Guo, X., Johe, K., Molnar, P., Davis, H., Hickman, J. Characterization of a human fetal spinal cord stem cell line, NSI-566RSC, and its induction to functional motoneurons. Journal of Tissue Engineering and Regenerative Medicine. 4, 181-193 (2010).
  28. Varghese, K., et al. A new target for amyloid beta toxicity validated by standard and high-throughput electrophysiology. PLoS ONE. 5, e8643 (2010).
  29. Natarajan, A., et al. Patterned cardiomyocytes on microelectrode arrays as a functional, high information content drug screening platform. Biomaterials. 32, 4267-4274 (2011).
  30. Davis, H., et al. Rat Cortical Oligodendrocyte-Embryonic Motoneuron Co-Culture: An Axon-Oligodendrocyte Interaction Model. Journal of biomaterials and tissue. 2, 206-214 (2012).
  31. Natarajan, A., DeMarse, T., Molnar, P., Hickman, J. Engineered In Vitro Feed-Forward Networks. J Biotechnol Biomater. 3, 2 (2013).

Tags

जैव अभियांत्रिकी अंक 92 ब्रैकट, संकुचन कंकाल की मांसपेशी NMJ cardiomyocytes कार्यात्मक
Microscale सिलिकॉन cantilevers का उपयोग सेलुलर सिकुड़ा समारोह का आकलन करने के लिए<em&gt; इन विट्रो</em
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Smith, A. S. T., Long, C. J.,… More

Smith, A. S. T., Long, C. J., McAleer, C., Bobbitt, N., Srinivasan, B., Hickman, J. J. Utilization of Microscale Silicon Cantilevers to Assess Cellular Contractile Function In Vitro. J. Vis. Exp. (92), e51866, doi:10.3791/51866 (2014).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter