Summary
Dit protocol beschrijft het gebruik van microschaal silicium consoles als buigzaam cultuur oppervlakken voor het meten van de contractiliteit van spiercellen in vitro. Cellular samentrekking cantilever buigen, die kan worden gemeten, geregistreerd en omgezet in uitlezingen van kracht, die een non-invasieve en schaalbaar systeem voor het meten contractiele functie in vitro.
Abstract
De ontwikkeling van meer voorspellende en biologisch relevante in vitro testen is gebaseerd op de vooruitgang van de veelzijdige celkweek systemen die de functionele beoordeling van de gezaaide cellen te vergemakkelijken. Daartoe microschaal cantilever technologie biedt een platform waarmee de contractiele functie van verschillende celtypen, waaronder skelet, hart en gladde spiercellen meet, door beoordeling van de contractie geïnduceerd substraat buigen. Toepassing van gemultiplexte cantilever arrays verschaft de middelen matige tot hoge doorvoer protocollen voor het beoordelen van geneesmiddel-effectiviteit en toxiciteit, ziekte fenotype en progressie, alsmede neuromusculaire en andere cel-cel interacties te ontwikkelen. Het manuscript geeft de informatie voor het vervaardigen betrouwbare cantilever arrays hiervoor en de vereiste om succesvol kweek cellen op die oppervlakken methoden. Verdere beschrijving wordt geleverd over de stappen die nodig zijn om functionele anal voerenlyse van contractiele celtypen gehandhaafd op dergelijke arrays met behulp van een nieuwe laser-en foto-detector systeem. De representatieve gegevens wat de nauwkeurigheid en reproduceerbare aard van de analyse van contractiele functie mogelijk met dit systeem, alsmede de diverse studies waaraan dergelijke technologie kunnen worden toegepast. Succesvolle brede invoering van dit systeem zou kunnen bieden onderzoekers de middelen om snelle, goedkope functionele studies uitgevoerd in vitro, wat leidt tot nauwkeurigere voorspellingen weefsel prestaties, ontwikkeling ziekte en de reactie op nieuwe therapeutische behandeling.
Protocol
1 cantilever Chip Fabrication
Geïllustreerde data van de beschreven vervaardigingsstappen worden voorzien in figuur 1.
- Plaats Silicon-On-Insulator (SOI) wafers in een oven en bak op 125 ° C gedurende 20 minuten om ze uitdrogen.
- Stort een 1,5 micrometer dikke laag siliciumoxide op het handvat laag van de vochtarme SOI wafer met een Plasma Enhanced Chemical Vapor Deposition (PECVD) tool.
- Plaats de wafer op de spin coater boorkop met de inrichting laag naar boven. Zorg wafer gecentreerd afzien 2 ml P20 primer op het midden van de wafel, en centrifugeren op 3000 rpm gedurende 60 seconden bij een versnelling van 1000 rpm / sec. P20 primer bevordert hechting van fotolak de inrichting laag.
- Terwijl de wafer nog op de spin coater boorkop afzien 2 ml S1818 fotolak op het midden van de wafel, en centrifugeren op 3000 rpm gedurende 60 seconden bij een versnelling van 1000 rpm / sec tot obtain een 1,5 urn dikke laag fotoresist.
- Plaats de wafer op een hete plaat en uitvoeren van een zachte bakken bij 115 ° C gedurende 1 minuut.
- Voer een harde contactlenzen UV blootstelling door fotolithografie contact mask aligner om het patroon brengen van de cantilever masker om de fotoresist op het apparaat laag. Bereken de belichtingstijd gebaseerd op de energetische waarde van 125 mJ / cm 2 voor S1818 fotolak.
- Ontwikkel de fotoresist door onderdompeling van de wafer in een 726 MIF fotoresist ontwikkelaar voor 1 min onder zachtjes schudden van de wafer heen en weer.
- Spoel de wafer met-de geïoniseerd (DI) water en droog het, bij voorkeur met behulp van een spin spoelen droger (SRD) tool.
- Verwijder de fotolak van de rand van de wafel (tot 5 mm van de rand) met een wattenstaafje aceton.
- Laad de wafer in een Deep Reactive Ion Etch (DRIE) tool, met de fotolak kant naar boven, en uitvoeren van een recept om het patroon siliciumlaag etsen door de device laag. De ingegraven oxidelaag fungeert als etsstop, dus moet een ets met 50% tot 100% meer cycli dan verwacht noodzakelijk om een volledige etch waarborgen.
- Plaats de wafer in een warm bad fotoresist oplossing gedurende 20 min aan de fotolak te strippen. Breng de wafer een quick-dump-rinser (QDR) van de wafer met DI-water afspoelen. Naar aanleiding van de fotolak strip, laadt de wafer in een SRD hulpmiddel om te spoelen en drogen van de wafel. Inspecteer de wafer onder een microscoop om te zorgen voor de cantilever patroon weergegeven zoals verwacht.
- Stort een 1 micrometer dikke laag-un gedopeerd silicium oxide op het apparaat laag van de wafel met een PECVD tool. Deze oxidelaag werkt als een beschermende laag voor de cantilevers in verdere bewerkingsstappen.
- Plaats de wafer op de spin coater boorkop met de handgreep laag naar boven begint verwerking van de achterzijde van de wafel. Zorg wafer gecentreerd afzien 2 ml P20 primer op het midden van de wafel, en centrifugeren op 3000 tpmgedurende 60 sec bij een versnelling van 1000 rpm / sec.
- Terwijl de wafer nog op de spin coater boorkop afzien 2 ml SPR220-4.5 fotoresist op het midden van de wafel, en centrifugeren bij 2000 rpm gedurende 45 seconden bij een versnelling van 1000 rpm / sec tot een 6,5 urn dikke laag te vinden fotolak.
- Plaats de wafer op een afstand hete plaat om zacht bakken uitgevoerd bij 115 ° C gedurende 2 minuten.
- Met behulp van een fotolithografie contact aligner staat voor / achter uitlijning Zet de achterzijde raam masker de voorzijde cantilever patroon en een harde contactlenzen UV belichting uitgevoerd om het patroon van het zitvlak raam masker overdragen aan de fotolak op het handvat laag. Gebruik een belichtingstijd berekend op basis van de blootstelling energetische waarde van 480 mJ / cm 2 voor SPR220-4.5 fotolak.
- Na blootstelling aan UV, laat de wafers blijven in een donkere ruimte voor 30 min voor de volgende bewerkingsstap.
- Ontwikkelen van de fotolak door onderdompeling van de wafer ineen 726 MIF fotoresist ontwikkelaar voor 2 minuten onder voorzichtig schudden de wafer heen en weer.
- Spoel de wafer met-de geïoniseerd (DI) water en droog het, bij voorkeur met behulp van een spin spoelen droger (SRD) tool.
- Plaats de wafers in een oven bij 90 ° C gedurende 12 uur.
- Ets silicium oxide laag op de achterzijde van de wafel met een RIE-systeem met gefluoreerde gassen en een recept voor etsen oxide. De gevormde oxide op de achterkant van de wafel werkt als een etsmasker voor verdere verwerking. Inspecteer de wafers onder een microscoop dat de siliciumoxide in de blootgestelde venster volledig geëtst.
- Verwijder het fotoresist aan de rand van de wafel (tot 5 mm van de rand) en een schone kamer wattenstaafje gedrenkt in aceton.
- Laad de wafer in een DRIE tool en uitvoeren van een recept om de gevormde handgreep laag te etsen tot een diepte van 500 pm met de ingegraven oxidelaag functioneren als een etsstop. Splits deze ets in meerdere runs van overmatige verhitting van de voorkoming vanwafer, die onverenigbaar etsen van het silicium veroorzaakt. Deze ets stap verwijdert volledig het silicium onder de uitkragingen.
- Voer een natte etsstap met 25% verdund HF etsmiddel, de ingegraven oxidelaag onder de uitkragingen en de beschermende oxidelaag bovenop de cantilevers strip.
Opmerking: Deze stap brengt het onderoppervlak van de silicium cantilevers en opent ook een venster eronder om een toegang tot de cantilever met de laser sonde verschaffen. - Spoel de wafer met behulp van een reeks DI-water baden en voorzichtig droog met stikstof. Omdat de uitkragingen alleen worden ondersteund bij hun bases, niet krachtig sprays DI water of inert gas te gebruiken direct op de uitkragingen.
- Klieven individuele chips uit de wafel langs de lijnen die splitsen bij het handvat laag etsstap.
2 Celkweek
- Bereid 13F dekglaasjes volgens eerder gepubliceerde werkwijzen 17.
OPMERKING: Als 13F coverslips niet beschikbaar zijn, kan elk hydrofoob oppervlak met een contact hoek boven 95 ° worden gebruikt. - Steriliseren cantilever chips en 13F dekglaasjes in een 70% ethanol oplossing en laat aan de lucht drogen in een zuurkast.
- Plaats individuele cantilever chips bovenop 13F dekglaasjes in een standaard 12 wells plaat.
- Coat de uitkragingen met het biopolymeer of oppervlaktemodificatie geoptimaliseerd voor het celtype wordt gebruikt volgens de standaard celkweek protocollen.
- Resuspendeer de cellen in hun specifieke groeimedium tot de gewenste concentratie.
OPMERKING: Dit protocol zal resulteren in een substantieel aantal cellen vallen door de cantilever raam en niet vast te houden aan de gewenste cantilever oppervlak. Celbereidingen moet daarom 3-4x worden meer geconcentreerd dan voor standaard dekglaasje voorbereidingen. Bijvoorbeeld wordt zaaien rat skeletspier satellietcellen gewoonlijk uitgevoerd met een zaaidichtheid van 500 tot 700 cellen / mm square 15,16, En worden met cantilever substraten bij 2000 cellen / vierkante mm. Optimalisatie experimenten dient nieuwe cel bronnen worden naar een geschikte zaaidichtheid nagegaan. - Pipetteer 200 ul van de celsuspensie op de cantilever chipoppervlak, waardoor de bel drager omvat de cantilever ramen volledig. Als het medium transporteert door het raam en vormt geen statische zeepbel op de top van de uitkragingen vervang de 13F dekglaasje en probeer het nog eens plating.
- Breng de plaat met de chips een incubator en laat de cellen hechten gedurende tenminste 1 uur (bij voorkeur 2-3 uur).
- Na deze periode plating, steriel pincet om de chip te brengen naar een schone goed, zonder 13F dekglaasje en bijvullen cultuur 1 ml groeimedium.
- Zet de plaat in de incubator.
- Aanvullen cellen volgens hun standaard protocol voor in vitro onderhoud op dekglaasjes. Voor skeletale spiercellen,een schakelaar drager samenstelling myotube induceren wanneer cellen confluent nodig.
3 Installatie van hardware en software voor cantilever doorbuiging Analyse
- Plaats een verwarmde kweekschaal in het stadium van een rechtopstaande elektrofysiologie microscoop.
- Voeg 3 ml van het medium voeden de cellen zijn op dit moment in (+ 10 mM HEPES) opgeschort tot het verwarmde microscoop podium.
- Monteer roestvrijstalen elektroden aan de binnenzijde van de verwarmde kweekschaal met een scheidingsafstand van 15 mm en sluit ze met een pulsgenerator, kan produceren gebied stimulatiepulsen van variërende intensiteit, frequentie en golfvorm, zodat het systeem veldstimulatie produceren van cellen, indien nodig.
- Schroef een Helium-Neon laser, gemonteerd op XY translationeel podia aan de onderzijde van de microscoop tafel en afstellen, zodat de laserbundel wordt via de bodem van de verwarmde kweekschaal bij een 30 ° hoek relative op het vlak van de cantilever.
- Schroef een kwadrant fotodetector module, gemonteerd op XY translationeel podia aan de onderzijde van de microscoop podium en pas de positie, zodat de gereflecteerde laserbundel landt in het midden van de 4 kwadranten. Figuur 2 geeft een overzicht van de opstelling hardware noodzakelijk zijn voor de uitvoering van het protocol beschreven.
- Schrijf een software programma om de lineaire actuatoren die scannen via de uitkragingen beheersen. Voeg het softwareprogramma met verwijzing naar het stroomschema verschaft in Figuur 3. De grafische interface geprogrammeerd voor gebruik met dit systeem wordt verschaft in Figuur 4.
4 Opname cantilever doorbuiging Gegevens
- Zet de cantilever analyse hardware en bijbehorende software.
- Plaats de verwarmde podium thermistor in het medium en wachten tot het te lezen 37 ° C.
- Steek de cantilever chip in het podium met de cantilevers georiënteerd naar de rechterkant van het podium.
- Zet de microscoop lichtbron.
- Focus de microscoop om de randen van de cantilevers in beeld brengen en gebruiken de laser / fotodetector control software om de laserstraal positioneren op het punt van cantilever 1 Opmerking: Uitgaande van de cantilevers georiënteerd rechts van het podium, cantilever 1 is degene gepositioneerd in de linkerbovenhoek van de array en nummers lopen tot 16 in de linkeronderhoek. Cantilever 17 is in de rechter positie en loopt tot en met 32 in de rechterbenedenhoek (figuur 5A).
- Druk op "play" van de opnamesoftware.
- Plaats de fotodetector zodat het signaal leest "0" in zowel x en y frames door aanpassing van de stappenmotoren regelen van de fotodetector.
- Set cantilever 1 positie in de laser / fotodetector control software (figuur 4).
- Verplaats de laser om het topje van cantilever 16, herhaal stap 4.7., En stel cantileveh 16 positie in de laser / fotodetector besturingssoftware.
- Verplaats de laser aan de punt van cantilever 32 Herhaal stap 4.7. En stel cantilever 32 positie in de laser / fotodetector control software.
- Verplaats de laser aan de punt van cantilever 17 Herhaal stap 4.7. En stel cantilever 17 positie in de laser / fotodetector control software.
- Schakel de microscoop lichtbron en de overhead licht in het laboratorium.
- Druk op "opnemen" van de opnamesoftware.
- Stel de pulsgenerator hardware tot 40 msec, 5 V pulsen met een frequentie van 1 Hz, en zet het apparaat aan.
OPMERKING: Optioneel dienst geoptimaliseerd stimulatie protocollen voor specifieke cel bronnen op dit punt, de aangegeven instellingen zijn richtlijnen op basis van verzamelde gegevens met menselijke en knaagdieren cel bronnen 12,13,15,16. - Met behulp van de laser / fotodetector besturingssoftware, stelt de hardware te scannen via de 32 cantilever array, stoppen voor 5 sec bij elkaar ope.
- Wanneer de scan van de 32 uitkragingen is voltooid, schakelt u de stimulator, dan stopt de opname-software en brengen het databestand.
- Onderzoeken de opgenomen sporen van elke cantilever voor bewijs van contractiele activiteit. Noteer elke cantilever met positieve reacties. Samentrekking wordt gedefinieerd als een piek als de afbuiging ten minste 0,1 V boven de basislijn.
- Verwijder alle niet-reagerende uitkragingen van de scan-protocol op de laser / fotodetector besturingssoftware.
- De actieve cantilevers kan vervolgens worden gescand zonder stimulatie om een lezing van spontane contractiele activiteit van de cel te krijgen.
- Run scans met of zonder brede gebied elektrische stimulering, na toevoeging van een therapeutische verbinding aan het medium om het effect zien van de functionele output van de gekweekte cellen.
- Voeren vermoeidheid evaluaties door het elektrisch stimuleren van de cellen voor langere tijd en scannen niveaus van contr actility om te meten hoe lang het duurt voor de piek van kracht te laten vallen onder een bepaalde drempel.
- In experimenten waarbij motorneuronen worden gehandhaafd co-kweek met spier-, meet neuromusculaire junctie vorming door behandeling van motoneuronen-myotube cantilever co-kweken met een neuronaal stimulerend middel (zoals glutamaat) of synaptic inhibitor (bijvoorbeeld D-tubocurarine) en scannen voor respectievelijk 16 stijgt en daalt in spontane activiteit.
- Voer specifieke scans zoals gedicteerd door de behoeften van de beoogde experimenten.
5 Analyse van de cantilever doorbuiging gegevens
- Gebruik gemodificeerde Stoney vergelijkingen 15 (hieronder) voor ruwe cantilever doorbuiging data (in Volt) omzetten in een indicatie van stress in de cellaag of myotube (in Pascal) en een directe meting van cellulaire contractiekracht (in nano-Newton):
ad / 51866 / 51866eq1.jpg "/> Vergelijking 1
Vergelijking 2 - Wanneer δ = cantilever tip doorbuiging en spanning door de myotube, σ c = spanning geproduceerd door de myotube, uitgaande van een uniform dikke film de volle breedte van de cantilever, C detector = het systeemspecifieke coëfficiënt voor spanning laserpositie op de foto -detector, θ = de hoek van de laser en de detector ten opzichte van het vlak van de cantilever, E Si = de elastische modulus van silicium Si t = de dikte van de cantilever, t f = myotube dikte v Si = verhouding van vergif silicium, L = cantilever lengte, P = weglengte van laser uit cantilever tip om detector, en w
- Uitgaande van de myotube wordt een gelijkmatige film, de kracht in de myotube gelijk aan de kracht in de film, waardoor Vergelijking 3, door verevening van het berekenen van kracht van stress en de veronderstelde cel dwarsdoorsnede die werd gebruikt voor de toepassing van Stoney's vergelijking.
Vergelijking 3 - Volgende functionele dataverzameling, fix cantilever chips voor immunocytochemische analyse of gebruik maken van cellen voor eiwit of DNA-analyse met behulp van standaard technieken.
- Optioneel kan de terugkeer van de cellen naar de couveuse in plaats van de voorbereiding voor moleculaire analyse met het oog op de functionele prestaties herwaarderen op een later tijdstip-punt.
Vergelijking 2 Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Succesvolle kweek van contractiele cellen op cantilevers is een relatief eenvoudige procedure, gebruik standaard celkweek technieken (figuur 5). Het percentage van de uitkragingen ondersteunende aanbestedende cellen zullen variëren afhankelijk van het type cel wordt onderzocht en specifieke cultuur toegepaste techniek. Primaire embryonale cellen afkomstig van ratten achterpoten werd contractiele activiteit waargenomen op 12% van de cantilevers onderzocht (n = 4). Analyse van de contractiele functie met behulp van de laser en de foto-detector systeem beschreven biedt nauwkeurige real-time gegevens over de functionele volwassenheid van de gezaaide cellen. Het gebruik van standaard elektrofysiologische software kan vervolgens worden gebruikt om de ruwe data te analyseren, makkelijker te kunnen berekenen relevante functionele eigenschappen, zoals piekkracht, tijd tot piek kracht en tijd om half rust, zie figuur 7. Latere gegevensverzameling uit kweken behandeld met therapeutische verbindingen maaktvergelijking van functionele eigenschappen met en zonder drugsverslaving, waardoor het mogelijk maken de verbinding de activiteit en de daaropvolgende voorspelling van in vivo responsen. Verder verlengde stimulatieprotocollen de middelen om de tarieven vermoeidheid beoordelen gekweekte cellen, waardoor verbreden het niveau van fysiologische gegevens verkregen uit dit systeem (Figuur 8).
De cantilever cultuur kan worden aangepast aan motorische neuronen in het kweeksysteem met skeletspier myotubes 16 bevatten om te kunnen nagaan of neuromusculaire synapsvorming in vitro (figuur 9) toelaten. In deze culturen percentages spontane contractiele activiteit vergeleken met percentages contractie in respons met een neuron-specifieke stimulant, zoals glutamaat. Alle waargenomen glutamaat geïnduceerde toenamen in contractie tarieven suggereren de activering van gekweekte neuronen, waardoor acetylcholine afgifte en daaropvolgende myotube activatie. Behandeling met synaptische remmers, zoals acetylcholine receptor blocker D-tubocurarine, leidt tot beëindiging van glutamaat geïnduceerde activiteit verder bewijs voor de aanwezigheid van functionele neuromusculaire synapsen in deze kweken 16.
Figuur 1 Schematische detaillering cantilever fabricageproces flow. De nummers in het stroomschema opgenomen correleren met protocol stappen in de sectie methoden getiteld "cantilever chip fabricage." Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.
Figuur 2 Hardwarede details van de laser / fotodetector systeem gebruikt om cellulaire contractie beoordelen op uitkragingen. (A) Foto van de gewijzigde elektrofysiologische microscoop gebruikt voor cantilever assessment. De laser (i) en fotodetector (ii) zijn onder het toneel XY translationele podia gemonteerd. Een transparante kweekschaal wordt aan de trap (iii), die laser doorgang toelaat de cantilever matrix door de onderkant van de trap. (B) Schematische "top-down" perspectief van de microscoop podium. XY translatie stadia toe bewegen van de laser en fotodetector zowel X en Y vlakken (rode pijlen), vergemakkelijkt beweging van de laser elke cantilever ondervragen in een array. Cantilever chips (iii) moeten met het oog op het podium met de uitkragingen gericht naar de rechterkant van het podium worden geplaatst voor het systeem te kunnen bedienen. (C) Close-up foto van de laser (i) enfotodetector (ii) gemonteerd onder de microscoop podium. De laser wordt op een 30 ° hoek ten opzichte van het vlak van de cantilever chip (θ). (D) Sluit foto van de kweekschaal. Broad-veld elektrische stimulatie gebeurt door een paar zilveren aangebrachte elektroden geplaatst 15 millimeter (iv). Een aan de onderzijde van de schotel element verwarming (v) wordt gebruikt om de kweek bij 37 ° C tijdens de analyse behouden. Temperatuurregeling is dynamisch, en geregeld door middel van een thermistor geplaatst in het medium (niet getoond). Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.
Figuur 3 Stroomdiagram van de logica die ten grondslag liggen software om controle. scannen van de laser en de fotodetector Twee software loops controle beweging: een main lus voor input van de gebruiker en een lus die de scanning motion controls. Setup wordt uitgevoerd, terwijl in de grote lus, gevolgd door activering van de tweede lus voor middelgrote tot high-throughput het verzamelen van gegevens. Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.
Figuur 4 Grafische gebruikersinterface van de software die wordt gebruikt voor laser-en foto-detector posities controle tijdens cantilever assessment. (A) knoppen om handmatig laser en fotodetector posities in zowel de X-en Y-vliegtuigen te besturen. (B) De bediening voor het handmatig instellen van de positie van de 4 hoeken uitkragingen (1, 16, 17, en 32), waardoor de software aanextrapoleren van de posities van de resterende uitkragingen in de array. (C) Controls kunnen gebruikers selecteren welke uitkragingen in te nemen elke scan. Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.
Figuur 5 Images of een custom built cantilever chip voor gebruik in dit systeem, en representatieve beelden van cellen die zijn aangehouden op soortgelijke oppervlakken. (A) Foto van een enkele, custom built cantilever chip. Elke chip bevat 32 uitkragingen gerangschikt in 2 rijen van 16 Cantilever 1 is gepositioneerd in de linkerbenedenhoek van het beeld en de cantilever 32 in de rechterbovenhoek. Cantilever chips zijn (B) Fase-contrast beeld van primaire rat skeletspiercellen 15 x 15 mm 2. Geteeld op cantilevers. Elke cantilever is 750 micrometer lang, 100 micrometer breed en 4 micrometer dik. (C) Immunocytochemische vlek van een primaire rat myotube gehandhaafd op een cantilever. Cellen werden gekleurd met een antilichaam probe voor myosine heavy chain. Let op de gestreepte weergave van de gekweekte vezel vermelding rijping van de contractiele machines. Cantilever randen zijn kunstmatig benadrukt in dit beeld tot een vermelding van de schaal te verstrekken. Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.
Figuur 6 Schematische illustratie van de termen die in Stoney's vergelijkingen voor het afleiden van kracht geproduceerd door myotubes op uitkragingen. Δ = cantilever tip doorbuiging en stress geproduceerd door de myotube, Cdetector = het systeemspecifieke coëfficiënt voor spanning laser positie op de fotodetector, θ = de hoek van de laser en de detector ten opzichte van het vlak van de cantilever, E Si = de elastische modulus van silicium Si t = de dikte van de cantilever, t f = myotube dikte, v Si = verhouding van silicium gif's, L = cantilever lengte, en P = weglengte van laser uit cantilever tip detector uit. Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.
Figuur 7 Representatieve ruwe gegevens en analyse van contractiele vorm volgens de cantilever systeem beschreven. (A) Voorbeeld van een ruwe data trace van het brede veld elektrische stimulatie van primaire rat myotubes op consoles. Top trace = laserafbuigmotoren (in Volt) in de x-as aangegeven lengte belasting van de cantilever. Midden trace = laserafbuigmotoren (in Volt) in de y-as geeft aan torsiespanning in de cantilever. Bodemspoor = Vermelding van de temporele positie van elektrische pulsen aan myotube krimp wekken in dit systeem. (B) Met behulp van standaard elektrofysiologie software, is het mogelijk piekkracht (PF) meten tijd kracht (TTP) en piek tijd helft ontspanning (1/2 RT) van de verzamelde ruwe data. (C) Sets samentrekking gegevens (n = 11) van de primaire rat skeletspieren myotubes. Toepassing van vergelijking van een gewijzigde Stoney's maakt berekening van cantilever spanning uit ruwe data lezingen in Volt. Uit deze gegevens kan de directe berekening van de kracht (in Newton) ook worden gegenereerd. Gepubliceerde gegevens herdrukt wet toestemming 13. Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.
Figuur 8 Representatieve gegevens die aantonen analyse van skeletspieren vermoeidheid in cantilever culturen. Ruwe data (in Volt) in de in een meting van myotube kracht (in nano-Newton) en opnieuw uitgezet. Gegevens illustreert de omvang van myotube contracties op uitkragingen in reactie op 1 Hz brede veld van elektrische pulsen na 0 min (zwart trace) en 120 min (grijze spoor) van continue stimulatie. Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.
Figuur 9 Representatieve sporen uit de analyse van een skeletspier-motorisch neuron co-kweek gehandhaafd op cantilevers, waaruit de functionele effecten van motoneuronen stimulatie met en zonder toevoeging van een neuromusculaire blokker. Ruwe data (in Volt) in de in een meting van myotube kracht (in nano-Newton) en opnieuw uitgezet. (A) Meting van spontane contracties van de gekweekte myotubes zonder neuronale stimulatie. (B) Meting van myotube krimp na neuronale stimulatie via de toevoeging van 200 pM glutamaat. (C) Meting van myotube samentrekking volgende glutamaat en 12,5 uM D-tubocurarine behandeling. Gepubliceerde gegevens met toestemming 16. Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.
In de volgende tabellen worden de specifieke reagentia gebruikt om cellen in kweek validatie experimenten beschreven, alsmede de nodige voorzieningen voor de cantilever beoordeling uit te voeren. Let kweek gebruikte reagentia niet nodig en dit systeem eenvoudig worden geïntegreerd met de kweek protocollen van elke lab handhaven contractiele cellen in vitro. De genoemde reagentia worden voorzien moeten onderzoekers wens de beschreven specifieke experimentele resultaten herhaald.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
De kritische stappen in de analyse microschaal cantilevers op tekenen van cellulaire contractie zijn de plaatsing van de cantilever chip binnen de microscoop fase en de daaropvolgende uitlijning van de laser en de fotodetector met de punt van de hoek cantilevers in de array. Als dit niet correct gebeurt, dan zal de software in staat om de posities van de resterende cantilevers extrapoleren in de array, kan leiden tot ophoping van valse negatieven tijdens gegevensverzameling. Exploitanten moeten erop toezien dat de cantilever chip ligt gelijk met de onderkant van de cultuur schotel voor het kalibreren van de laser posities. Als de chip zit schuin in de schaal, zal het pad van de afgebogen laserbundel veranderen en verwarren gegevensverzameling.
Een functionele lucht-tabel moet worden gebruikt om de achtergrond trillingen te annuleren tijdens het verzamelen van gegevens. De geringe dikte (ongeveer 4 um) van de cantilevers die in deze studie provides hoge gevoeligheid voor contractiele activiteit, maar heeft de bijwerking van verhoogde gevoeligheid voor trillingen. Exploitanten moeten zorgen om te bewegen rond de hardware zo weinig mogelijk tijdens het opnemen van gegevens, naar de achtergrond lezingen te verminderen. Tenslotte, bij het plaatsen van de cantilever chip in de fase zelf zorgen de chip niet in contact met de zilveren stimulerende elektroden in de kweek zijn goed. Toepassing van breed-veld stimulatie met de elektrode raken de chip een actuele pad veranderen en tot gevolg hebben dat het systeem effectief stimuleren van de gekweekte cellen.
Om meer nauwkeurige metingen van kracht uitgang in skeletspieren myotubes te verkrijgen, is het sterk aanbevolen om immunokleuring van de gekweekte cellen eenmaal functionele analyse is voltooid voeren. De genoemde vergelijkingen vereisen ingang van een myotube cross-sectional area (CSA) om te berekenen kracht. Terwijl een aangenomen waarde kan gebruikt worden op basis van pet bestaan van gegevens, het meten van een myotube exacte CSA met behulp van confocale beeldvormende technieken zal een meer nauwkeurige schatting van de kracht uitgeoefend door de aanbestedende myotube bieden. Bijpassende ruwe contractie gegevens aan de fysieke kenmerken van de betreffende cel is waardevol in normaliseren results meerdere cantilevers en tussen experimentele omstandigheden 15 en derhalve cruciaal voor het genereren nauwkeurige voorspellingen van hele weefsel reacties op medicatie of ziekte. Stoney's vergelijkingen aannemen dat de onderzochte myotubes overspannen de gehele lengte van de cantilever, zodat het werk moet worden gesteld om alleen gegevens die zijn verkregen uit cellen die voldoen aan deze veronderstelling. Indien dit niet mogelijk is, kan eindige elementenanalyse worden gebruikt om een nauwkeurige meting van de werking bieden tegen kleinere myotubes zoals eerder gepubliceerd 15. Deze analysemethode is veel arbeidsintensiever en dus ongeschikt hogere throughput toepassingen, maar kan noodzakelijk zijn indien geoptimaliseerdcelkweken volgens Stoney aannames niet worden verkregen.
Zoals gezegd kan cultuur parameters worden overgedragen van standaard dekglaasje preparaten. Echter, is het raadzaam om te overwegen gebruik te maken van serum-vrij medium composities en niet-biologische substraten voor het gebruik van dit systeem in drug screening toepassingen. Vanwege de onbepaald dierlijke sera, kan het effect van nieuwe therapieën worden verstoord door het opnemen van dergelijke additieven in het kweekmedium. Serumvrije media formuleringen voor zowel knaagdier en menselijke skeletspier culturen 18-21 en een meer gecontroleerde, goed gedefinieerde omgeving voor het uitvoeren compound beoordeling. Ook het gebruik van biologische coatings (collageen, laminine, etc.) op cantilevers introduceert variabiliteit aan de cel preparaten die worden vermeden door toepassing van niet-biologische substraten. De afzetting van silaan monolaag op cultuur oppervlakken zijn getoond extrekvaste ter ondersteuning van de hechting en de ontwikkeling van verschillende celtypen 16,18,20,22-31 en vormen de middelen om volledig gedefinieerde oppervlakken op betrouwbare en herhaalbare wijze genereren.
Door het traject van contractiele cellen aanwezig in zoogdiersystemen, de toepassing van dit model voor in vitro assays relatief breed. Hoewel geoptimaliseerd met behulp skeletspiercellen, systeem potentieel voor spiercellen en hartspiercellen glad ook, die het mogelijk snelle beoordeling van dosis respons voeren om nieuwe geneesmiddelen in deze cellen in real-time. Voor cantilever chips uit een array van 32 consoles (figuur 5A), maar kan gemakkelijk worden aangepast om veel meer omvatten. Analyse van dergelijke arrays produceert een groot aantal gegevenspunten uit een enkele cultuur, sterk verbeterd de statistische kracht van elke waargenomen verschillen. Zoals blijkt uit figuur 8, cellen gekweektin dit systeem vermoeidheid ondergaan in de tijd, in antwoord op continue brede veldstimulatie, dat een evaluatie van de effecten van geneesmiddelen op het uithoudingsvermogen van cellen in vitro. Toevoeging van innerveren motorneuronen deze cultuurmodel maakt ook evaluatie van synapsvorming door het meten van spier contractie in respons op neuronale stimulerende (figuur 9). Terwijl het meten van basislijn functionele parameters gemultiplexed assay (figuur 7) heeft duidelijke voordelen ten opzichte van standaard biomoleculaire evaluatie van in vitro kweken, het vermogen om neuromusculaire functie en uithoudingsvermogen van gezaaide cellen beoordelen verhoogt de toepasbaarheid van dit model voor drug screening en ziektemodel toepassingen. De beschreven techniek biedt onderzoekers de middelen om snelle, goedkope functionele beoordeling van zowel gezonde als zieke spiercellen in vitro uitgevoerd. De veelzijdigheid van de cultuur-systeem, en de hIGH gehalte aan functionele detail verkrijgbaar uit de analyse van de ruwe gegevens, die meer nauwkeurige voorspelling van in vivo weefselreacties op nieuwe pathologische en chemische problemen veroorzaken.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Acknowledgments
Dit onderzoek werd gefinancierd door het National Institute of Health subsidie nummers R01NS050452 en R01EB009429. Fabricage van de cantilever chips is extern uitgevoerd door medewerkers van de nanofabricage faciliteit gelegen aan de Cornell University. Alle in de cantilever fabricageproces apparatuur werd in deze faciliteit. Speciale dank aan Mandy Esch en Jean-Matthieu Prot voor hun hulp met cantilever micro-fabricage. Video animatie van cantilever functionaliteit werd gegenereerd door Charles Hughes, Alex Zelenin en Eric Imperiale van de Synthetic Reality Lab van UCF.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Primary rat muscle growth medium | |||
| Neurobasal medium | Life Technologies | 21103-049 | |
| B27 (50x) | Life Technologies | 17504044 | 1x |
| Glutamax (100x) | Life Technologies | 35050061 | 1x |
| G5 supplement | Life Technologies | 17503-012 | 1x |
| Glial-Derived Neurotrophic Factor | Cell sciences | CRG400B | 20 ng/ml |
| Brain-Derived Neurotrophic Factor | Cell sciences | CRB600B | 20 ng/ml |
| Ciliary Neurotrophic Factor | Cell sciences | CRC400A | 40 ng/ml |
| Neurotrophin-3 | Cell sciences | CRN500B | 20 ng/ml |
| Neurotrophin-4 | Cell sciences | CRN501B | 20 ng/ml |
| Acidic Fibroblast Growth Factor | Life Technologies | 13241-013 | 25 ng/ml |
| Cardiotrophin-1 | Cell sciences | CRC700B | 20 ng/ml |
| Heparin Sulphate | Sigma | D9809 | 100 ng/ml |
| Leukemia Inhibitory Factor | Sigma | L5158 | 20 ng/ml |
| Vitronectin | Sigma | V0132 | 100 ng/ml |
| Primary rat muscle differentiation medium | |||
| NB Activ 4 | Brain Bits LLC | NB4-500 | |
| Equipment | |||
| Class 2 red diode laser | Newport | ||
| Photo-detector | Noah Industries | ||
| Model 2100 Pulse stimulator | A-M systems | ||
| Multiclamp 700B Digitizer | Axon Instruments | ||
| Patch clamp microscope and stage | Olympus | ||
| Delta T4 culture dish controller | Bioptechs | ||
| Axoscope software | Molecular Devices | ||
| LabVIEW software | National Instruments | ||
| 37 oC, 5% CO2 incubator | NAPCO | ||
| Class 2 microbiological flow hood | Labconco | ||
| Pipettes and tips | Eppendorf |
References
- Bischoff, R. Enzymatic liberation of myogenic cells from adult rat muscle. Anat. Rec. 180, 645-661 (1974).
- Yasin, R., et al. A quantitative technique for growing human adult skeletal muscle in culture starting from mononucleated cells. J. Neurol. Sci. 32, 347-360 (1977).
- Dennis, R. G., Kosnik, P. E., 2nd, Excitability and isometric contractile properties of mammalian skeletal muscle constructs engineered in vitro. In Vitro Cell Dev. Biol. Anim. 36, 327-335 (2000).
- Khodabukus, A., Baar, K. Defined electrical stimulation emphasizing excitability for the development and testing of engineered skeletal muscle. Tissue Eng Part C Methods. 18, 349-357 (2012).
- Langelaan, M. L. P., et al. Advanced maturation by electrical stimulation: Differences in response between C2C12 and primary muscle progenitor cells. Journal of tissue engineering and regenerative medicine. 5, 529-539 (2011).
- Stephenson, G. M., O'Callaghan, A., Stephenson, D. G. Single-fiber study of contractile and biochemical properties of skeletal muscles in streptozotocin-induced diabetic rats. Diabetes. 43, 622-628 (1994).
- Harber, M., Trappe, S. Single muscle fiber contractile properties of young competitive distance runners. Journal of applied physiology (Bethesda, Md: 1985). 105, 629-636 (2008).
- Hvid, L. G., et al. Four days of muscle disuse impairs single fiber contractile function in young and old healthy men. Experimental gerontology. 48, 154-161 (2013).
- Edman, K. A. Contractile performance of striated muscle. Advances in experimental medicine and biology. 682, 7-40 (2010).
- Krivickas, L. S., Walsh, R., Amato, A. A. Single muscle fiber contractile properties in adults with muscular dystrophy treated with MYO-029. Muscle Nerve. 39, 3-9 (2009).
- Sung, J. H., et al. Microfabricated mammalian organ systems and their integration into models of whole animals and humans. Lab on a chip. 13, 1201-1212 (2013).
- Wilson, K., Molnar, P., Hickman, J. J. Integration of functional myotubes with a Bio-MEMS device for non-invasive interrogation. Lab on a chip. 7, 920-922 (2007).
- Wilson, K., Das, M., Wahl, K. J., Colton, R. J., Hickman, J. Measurement of contractile stress generated by cultured rat muscle on silicon cantilevers for toxin detection and muscle performance enhancement. PLoS ONE. 5, (2010).
- Binnig, G., Quate, C. F., Gerber, C. Atomic Force Microscope. Physical Review Letters. 56, 930-933 (1986).
- Pirozzi, K. L., Long, C. J., McAleer, C. W., Smith, A. S., Hickman, J. J. Correlation of embryonic skeletal muscle myotube physical characteristics with contractile force generation on an atomic force microscope-based bio-microelectromechanical systems device. Applied physics letters. 103, 83108 (2013).
- Smith, A., Long, C., Pirozzi, K., Hickman, J. A functional system for high-content screening of neuromuscular junctions in vitro. Technology. 1, 37-48 (2013).
- Stenger, D. A., et al. Coplanar molecular assemblies of amino- and perfluorinated alkylsilanes: characterization and geometric definition of mammalian cell adhesion and growth. Journal of the American Chemical Society. 114, 8435-8442 (1992).
- Das, M., Rumsey, J. W., Bhargava, N., Stancescu, M., Hickman, J. J. A defined long-term in vitro tissue engineered model of neuromuscular junctions. Biomaterials. 31, 4880-4888 (2010).
- Rumsey, J. W., Das, M., Bhalkikar, A., Stancescu, M., Hickman, J. J. Tissue engineering the mechanosensory circuit of the stretch reflex arc: Sensory neuron innervation of intrafusal muscle fibers. Biomaterials. 31, 8218-8227 (2010).
- Das, M., Rumsey, J. W., Bhargava, N., Stancescu, M., Hickman, J. J. Skeletal muscle tissue engineering: A maturation model promoting long-term survival of myotubes, structural development of the excitation-contraction coupling apparatus and neonatal myosin heavy chain expression. Biomaterials. 30, 5392-5402 (2009).
- Das, M., et al. Developing a novel serum-free cell culture model of skeletal muscle differentiation by systematically studying the role of different growth factors in myotube formation. In Vitro Cell Dev Biol Anim. 45, 378-387 (2009).
- Stenger, D. A., Pike, C. J., Hickman, J. J., Cotman, C. W. Surface determinants of neuronal survival and growth on self-assembled monolayers in culture. Brain research. 630, 136-147 (1993).
- Hickman, J. J., et al. Rational pattern design for in vitro cellular networks using surface photochemistry. Journal of Vacuum Scienc., & Technology A: Vacuum, Surfaces, and Films. 12, 607-616 (1994).
- Das, M., Molnar, P., Devaraj, H., Poeta, M., Hickman, J. J. Electrophysiological and morphological characterization of rat embryonic motor neurons in a defined system. Biotechnology progress. 19, 1756-1761 (2003).
- Rumsey, J. W., et al. Node of Ranvier formation on motor neurons in vitro. Biomaterials. 30, 3567-3572 (2009).
- Murugan, R., Molnar, P., Rao, K. P., Hickman, J. J. Biomaterial Surface patterning of self assembled monolayers for controlling neuronal cell behavior. International journal of biomedical engineering and technology. 2, 104-134 (2009).
- Guo, X., Johe, K., Molnar, P., Davis, H., Hickman, J. Characterization of a human fetal spinal cord stem cell line, NSI-566RSC, and its induction to functional motoneurons. Journal of Tissue Engineering and Regenerative Medicine. 4, 181-193 (2010).
- Varghese, K., et al. A new target for amyloid beta toxicity validated by standard and high-throughput electrophysiology. PLoS ONE. 5, e8643 (2010).
- Natarajan, A., et al. Patterned cardiomyocytes on microelectrode arrays as a functional, high information content drug screening platform. Biomaterials. 32, 4267-4274 (2011).
- Davis, H., et al. Rat Cortical Oligodendrocyte-Embryonic Motoneuron Co-Culture: An Axon-Oligodendrocyte Interaction Model. Journal of biomaterials and tissue. 2, 206-214 (2012).
- Natarajan, A., DeMarse, T., Molnar, P., Hickman, J. Engineered In Vitro Feed-Forward Networks. J Biotechnol Biomater. 3, 2 (2013).
