Summary
Denne protokol beskriver anvendelsen af mikroskala silicium udkragninger som bøjelige kultur overflader til måling af kontraktilitet muskelceller in vitro. Cellulær sammentrækning forårsager cantilever bøjning, der kan måles, registreres og omregnes til udlæsninger af kraft, hvilket giver en non-invasiv og skalerbart system til måling af kontraktil funktion in vitro.
Abstract
Udviklingen af mere forudsigelige og biologisk relevante in vitro-assays er baseret på udviklingen af alsidige cellekultursystemer, som letter den funktionelle vurdering af de podede celler. Med henblik herpå mikroskala cantilever teknologi tilbyder en platform med at måle den kontraktile funktion af en række celletyper, herunder skelet, hjerte og glatte muskelceller, ved vurderingen af sammentrækning induceret substrat bøjning. Anvendelse af multiplexede cantilever arrays giver mulighed for at udvikle moderat til høj-throughput protokollerne for evaluering af lægemiddel effektivitet og toksicitet, sygdomsfænotype og progression, samt neuromuskulære og andre celle-celle-interaktioner. Dette håndskrift indeholder detaljerne for opdigte pålidelige cantilever arrays til dette formål, og de metoder, der er nødvendige for en vellykket kultur celler på disse overflader. Yderligere beskrivelse er tilvejebragt de nødvendige for at udføre funktionel anal skridtysis af kontraktile celletyper vedligeholdes på sådanne arrays ved brug af en ny laser og fotodetektor systemet. De repræsentative data fremhæver præcision og reproducerbar karakter af analysen af kontraktile funktion muligt ved hjælp af dette system, såvel som den brede vifte af undersøgelser, som en sådan teknologi kan anvendes. Vellykket udbredt anvendelse af dette system kunne give efterforskerne med midler til at udføre hurtige, billige funktionelle studier in vitro, hvilket fører til mere præcise forudsigelser af væv ydeevne, udvikling af sygdom og respons på ny terapeutisk behandling.
Protocol
1. Cantilever Chip Fabrication
Illustrerede detaljer af de beskrevne fremstillingstrin er tilvejebragt i figur 1.
- Placer Silicon-On-Insulator (SOI) wafers i en ovn og bages ved 125 ° C i 20 min for at dehydrere dem.
- Deponere en 1,5 um tykt lag af siliciumoxid på håndtaget lag af dehydreret SOI wafer ved anvendelse af en Plasma Enhanced Chemical Vapor Deposition værktøj (PECVD).
- Placer skiven på spin coater borepatron med enheden lag opad. Sikre skiven er centreret, dispensere 2 ml P20 primer på midten af skiven, og centrifugering ved 3.000 rpm i 60 sek ved en acceleration på 1.000 omdr / sek. P20 primer fremmer vedhæftningen af fotoresist til indretningen lag.
- Mens skiven er stadig på spin coater borepatron, dispensere 2 ml S1818 fotoresist på midten af skiven, og centrifugering ved 3.000 rpm i 60 sek ved en acceleration på 1.000 omdr / sek til obtain et 1,5 um tykt lag af fotoresist.
- Placer skiven på en varmeplade og udføre en blød bages ved 115 ° C i 1 min.
- Udfør en hård kontakt UV-eksponering ved hjælp af en fotolitografisk kontaktperson maske aligner med henblik på at overføre mønstret fra cantilever maske til fotoresist på enheden lag. Beregn eksponeringstiden baseret på eksponering energi værdi på 125 mJ / cm 2 for S1818 fotoresist.
- Develop fotoresisten ved neddypning af skiven i en 726 MIF fotoresist udvikler for 1 min under forsigtig omrystning skiven frem og tilbage.
- Skyl wafer med (DI) vand de-ioniseret og tør den, helst ved hjælp af et værktøj spin-skyl tørretumbler (SRD).
- Fjern fotoresist fra kanten af skiven (op til 5 mm fra kanten) ved hjælp af en vatpind dyppet i acetone.
- Indlæse wafer i et værktøj Deep reaktiv Ion Etch (DRIE) med fotoresist opad, og køre en opskrift at ætse det mønstrede silicium lag gennem device lag. De begravede oxid lag fungerer som en etch stop, så udføre en etch med 50% til 100% flere cykler end forventes at være nødvendige for at sikre en fuldstændig ætsning.
- Placer skiven i et varmt fotoresist bad løsning for 20 minutter til at strippe fotoresisten. Overfør skiven til en hurtig-dump-rinser (QDR) for at skylle wafer med DI-vand. Efter fotoresist strimler, læg skiven i en SRD værktøj til at skylle og tørre skiven. Undersøg wafer under et mikroskop for at sikre cantilever mønstret vises som forventet.
- Deponere en 1 um tykt lag af ikke-doteret siliciumoxid på enheden lag af skiven ved hjælp af en PECVD-værktøj. Dette oxid lag fungerer som et beskyttende lag for udkragninger under yderligere procestrin.
- Placer skiven på spin coater borepatron med håndtaget lag opad til at begynde behandlingen på bagsiden af skiven. Sikre skiven er centreret, dispensere 2 ml P20 primer på midten af skiven, og centrifugering ved 3.000 rpmi 60 sekunder ved en acceleration på 1.000 omdr / sek.
- Mens skiven er stadig på spin coater borepatron, dispensere 2 ml SPR220-4.5 fotoresist på midten af skiven, og centrifugering ved 2.000 rpm i 45 sekunder ved en acceleration på 1.000 omdr / sek for at opnå et 6,5 um tykt lag af fotoresist.
- Placer skiven på en nærhed varmeplade til at udføre en blød bages ved 115 ° C i 2 minutter.
- Ved hjælp af en fotolitografi kontakt aligner stand til front / ryg justering, tilslutter bagsiden vinduet maske på forsiden cantilever mønster og udføre en hård kontakt UV-eksponering med henblik på at overføre mønstret fra bagsiden vindue maske til fotoresist på håndtaget lag. Brug en eksponeringstid beregnet på baggrund af eksponering energi værdi på 480 mJ / cm 2 for SPR220-4.5 fotoresist.
- Efter UV-eksponering, lad vaflerne forbliver i et mørkt område i 30 minutter før det næste trin i forarbejdningen.
- Udvikle fotoresist ved at nedsænke skiven ien 726 MIF fotoresist udvikler i 2 minutter under forsigtig omrystning skiven frem og tilbage.
- Skyl wafer med (DI) vand de-ioniseret og tør den, helst ved hjælp af et værktøj spin-skyl tørretumbler (SRD).
- Placer skiver i en ovn ved 90 ° C i 12 timer.
- Etch siliciumoxidlag på bagsiden af skiven ved hjælp af en RIE-system med fluorholdige gasser og en opskrift på ætsning oxid. Den mønstrede oxid på bagsiden af skiven virker som en etch maske til videre forarbejdning. Undersøg vaflerne under et mikroskop for at sikre, at siliciumoxid i den udsatte vinduet er helt ætset.
- Fjern fotoresist på kanten af skiven (op til 5 mm fra kanten) ved hjælp af et rent værelse vatpind dyppet i acetone.
- Læg skiven i en DRIE værktøj og køre en opskrift at ætse det mønstrede håndtag lag til en dybde på 500 um med den begravede oxidlag, der fungerer som en etch stop. Split denne etch i flere kørsler for at forhindre overdreven opvarmning afskiven, som forårsager inkonsekvent ætsning af silicium. Denne etch trin helt fjerner silicium nedenunder støtteben.
- Udfør en våd ætsning trin ved anvendelse af 25% fortyndet HF-ætsemiddel, at fratage begravet oxidlag under støtteben og beskyttende oxidlag på toppen af støtteben.
BEMÆRK: Dette trin frigiver bundfladen af silicium støtteben og åbner også et vindue nedenunder for at tilvejebringe en adgang til sonde cantilever med laseren. - Skyl skiven ved hjælp af en række af DI vandbade og forsigtigt tør med nitrogen. Da udkragninger kun understøttes på deres baser, skal du ikke bruge kraftfulde spray DI vand eller inaktiv gas direkte på støtteben.
- Spalte de enkelte spåner fra skiven langs spalter linjer produceret under håndtaget lag etch trin.
2. Celledyrkning
- Forbered 13F dækglas ifølge tidligere offentliggjorte metoder 17.
BEMÆRK: Hvis 13F bugtrslips ikke er tilgængelige, kan enhver hydrofob overflade med en kontakt vinkel over 95 ° anvendes. - Steriliser cantilever chips og 13F dækglas i en 70% ethanol opløsning og lad dem lufttørre i et flow hætte.
- Placer individuelle cantilever chips på toppen af 13F dækglas i en standard 12-brønds plade.
- Coat støtteben med biopolymeren eller overfladebehandling optimeret til celletype, der anvendes i henhold til standard cellekultur protokoller.
- Genopslæmmes cellerne i deres specifikke vækstmedium til den ønskede koncentration.
BEMÆRK: Denne protokol vil resultere i et betydeligt antal celler, der falder gennem cantilever vinduet og ikke klæber til den ønskede cantilever overfladen. Cellepræparater bør derfor gøres 3-4x mere koncentreret end for standard dækglas præparater. For eksempel er udsåning af rotte Skeletmuskelsatellitceller udføres typisk ved hjælp af en podningstæthed på mellem 500 og 700 celler / kvadrat mm 15,16Og anvendes til cantilever substrater på 2.000 celler / kvadrat mm. Optimering forsøg skal udføres med nye cellekilder at fastslå en passende podningstæthed. - Pipettere 200 pi af cellesuspensionen på cantilever chipoverfladen sikre boblen medium omfatter cantilever vinduer helt. Hvis mediet væger gennem vinduet og udgør ikke en statisk boble på toppen af støtteben erstatte 13F dækglas og reattempt klædningen.
- Overfør plade indeholdende chips til en inkubator og tillade cellerne at adhærere i mindst 1 time (fortrinsvis 2-3 timer).
- Efter denne plating periode anvende steril pincet til at overføre chippen til en ren godt, uden en 13F dækglas, og top op kulturen med 1 ml vækstmedium.
- Retur pladen til inkubatoren.
- Oprethold celler ifølge deres standardprotokol for in vitro-vedligeholdelse på dækglas. For skeletmuskelceller,en switch medium sammensætning til at inducere myotube dannelse, når cellerne bliver sammenflydende vil være nødvendig.
3. Opsætning af hardware og software til Cantilever Nedbøjning Analyse
- Placer en opvarmet dyrkningsskål i den fase af en opretstående elektrofysiologi mikroskop.
- Tilsæt 3 ml fodring medium cellerne øjeblikket suspenderet i (+ 10 mM HEPES) til den opvarmede mikroskopbordet.
- Monter rustfrie elektroder på indersiden af den opvarmede dyrkningsskålen ved en afstand på 15 mm og forbinde dem til en impulsgenerator, der kan producere felt stimulationsimpulser af varierende intensitet, frekvens og bølgeform til at give systemet mulighed for at producere feltstimulering af celler, når det er hensigtsmæssigt.
- Bolt en helium-neon-laser, der er monteret på XY translationelle faser, til undersiden af mikroskopet bordet og justeres ind, således at laserstrålen rettes gennem bunden af den opvarmede dyrkningsskålen ved en vinkel på 30 ° relative med planet af cantilever.
- Bolt en kvadrant fotodetektor modul, monteret på XY translationelle etaper, til undersiden af mikroskopbordet og justere dens position, således at de reflekterede laserstråle lander i midten af de 4 kvadranter. Figur 2 giver et overblik over den hardware oprettet nødvendige for gennemførelsen af den beskrevne protokol.
- Skriv et program til at styre lineære aktuatorer, der scanner på tværs af støtteben. Skriv programmet med henvisning til rutediagrammet vist i figur 3. Den grafiske brugerflade programmeret til brug med denne er tilvejebragt i figur 4.
4. Optagelse Cantilever afbøjning af data
- Tænd cantilever analyse hardware og tilhørende software.
- Sæt den opvarmede etape termistor i mediet, og vent til det at læse 37 ° C.
- Sæt cantilever chip ind på scenen med cantilevers orienteret mod højre side af scenen.
- Tænd mikroskopet lyskilden.
- Fokus mikroskop for at bringe kanterne af støtteben til syne og bruge laser / fotodetektor kontrol software til at placere laserstrålen på spidsen af cantilever 1. BEMÆRK: Hvis man antager, at støtteben er orienteret til højre for scenen, cantilever 1 er den ene placeret i øverste venstre hjørne af array og tal løbe ned til 16 i nederste venstre. Cantilever 17 er i øverste højre position og kører til 32 i bunden til højre (figur 5A).
- Tryk på "play" på optagelse software.
- Placer fotodetektor så signalet lyder "0" i både x og y rammer ved at justere stepmotorer kontrollerer fotodetektor.
- Indstil fremspring 1 position i laser / fotodetektor styresoftware (figur 4).
- Flyt laseren til spidsen af fremspring 16, gentag trin 4.7. Og indstille cantilevER 16 position i laser / fotodetektor kontrol software.
- Flyt laseren til spidsen af fremspring 32, gentag trin 4.7. Og sæt fremspring 32 position i laser / fotodetektor styringssoftware.
- Flyt laseren til spidsen af fremspring 17, gentag trin 4.7. Og sæt fremspring 17 position i laser / fotodetektor styringssoftware.
- Sluk mikroskopet lyskilde og overhead lyset i laboratoriet.
- Tryk på "Record" på optagelse software.
- Indstil impulsgeneratorens hardware til 40 ms, 5 V impulser ved en frekvens på 1 Hz, og tænd for maskinen.
BEMÆRK: Eventuelt ansætte optimerede stimulations protokoller for specifikke cellekilder på dette tidspunkt, de angivne indstillinger er retningslinjer baseret på indsamlede data ved hjælp af menneskelige og gnaver cellekilder 12,13,15,16. - Ved hjælp af laser / fotodetektor kontrol software, indstille hardware til at scanne hele 32 cantilever array, stopper i 5 sekunder ved hver påe.
- Når scanningen af de 32 støtteben er færdig, skal du slukke for stimulatoren, så stoppe optagelsen software og opdrage datafilen.
- Undersøg indspillede spor fra hver cantilever for tegn på kontraktile aktivitet. Notér hver cantilever med positive svar. En sammentrækning er defineret som en top, hvis deformation er mindst 0,1 V over grundlinjen.
- Fjern eventuelle ikke-responsive udkragninger fra scanningen protokol på laser / fotodetektor kontrol software.
- De aktive støtteben kan derefter skannes påny uden stimulering for at få en læsning af cellens spontane kontraktile aktivitet.
- Kør scanninger med eller uden bredt felt elektrisk stimulation, efter tilsætning af en terapeutisk forbindelse til mediet for at observere dens effekt på den funktionelle produktion af de dyrkede celler.
- Udføre træthed vurderinger ved elektrisk at stimulere cellerne i længere perioder og scanning niveauer af contr actility til at måle, hvor lang tid det tager for spidskraften falder til under en bestemt tærskel.
- I forsøg, hvor motoriske neuroner holdes i co-kultur med muskler, måle neuromuskulære forbindelse dannelse gennem behandling af motoneuron-myotube cantilever co-kulturer med en neuronal stimulans (såsom glutamat), eller synaptiske hæmmer (fx D-tubocurarin) og scanning af stigninger og fald i spontan aktivitet henholdsvis 16.
- Udføre specifikke scanninger som dikteret af behovet hos de planlagte eksperimenter.
5. Analyse af Cantilever afbøjning data
- Brug modificeret Stoney ligninger 15 (beskrevet nedenfor) til at konvertere rå cantilever nedbøjning data (i volt) til en udlæsning af stress i cellelaget eller myotube (i Pascal), og en direkte måling af cellulær kontraktil kraft (i nano-Newton):
annonce / 51866 / 51866eq1.jpg "/> ligning 1
Ligning 2 - Når δ = cantilever spidsafbøjning og stress produceret af myotube, σ c = spænding produceret af myotube, under forudsætning af en ensartet tyk film fulde bredde af cantilever C detektor = systemet specifikke koefficienten spænding til laserposition på billedet -detector, θ = vinklen af laseren og detektoren i forhold til planet af cantilever E Si = elasticitetsmodul silicium, t Si = tykkelsen af fremspringet, t f = myotube tykkelse, v Si = gift forhold på silicium, L = cantilever længde, P = vejlængde på laser fra cantilever spids til detektor, og w
- Under forudsætning af at myotube er en ensartet film, kraften i myotube er lig med kraft i filmen, hvilket fører til ligning 3, ved at sidestille beregning af kraft fra stress og den forudsatte celle tværsnitsareal, der blev brugt for anvendelsen af Stoney ligning.
Ligning 3 - Efter funktionel dataindsamling, fix cantilever chips til immunocytokemisk analyse eller udnytte celler til protein eller DNA-analyse anvendelse af standard teknikker.
- Eventuelt returnere cellerne til inkubatoren i stedet for at forberede molekylær analyse med henblik på at revurdere funktionelle ydeevne på et senere tids-punkt.
Ligning 2 Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Vellykket dyrkning af kontraktile celler på støtteben er en relativt enkel procedure, ved brug af standard cellekulturteknikker (figur 5). Procentdelen af udkragninger støtter ordregivende celler vil variere afhængigt af celletype blive undersøgt og specifik kultur teknik anvendes. Brug primære embryonale celler afledt fra rotte bagben blev kontraktile aktivitet opdaget på 12% af udkragninger undersøgte (n = 4). Analyse af kontraktile funktion ved hjælp af laser og fotodetektor beskrevne giver præcise data i realtid vedrørende den funktionelle modenhed seedede celler. Anvendelse af standard elektrofysiologiske software kan derefter anvendes til at analysere de rå data, lette beregningen af relevante funktionelle egenskaber, såsom maksimal kraft, tid til maksimal kraft og tid til halvdelen afslapning, som illustreret i figur 7. Efterfølgende dataindsamling fra kulturer behandlet med terapeutiske forbindelser giver mulighed forsammenligning af funktionelle egenskaber med og uden narkotikamisbrug, hvorved vurdering af forbindelse aktivitet og efterfølgende forudsigelse af in vivo-responser. Endvidere udvidede stimuleringsprotokoller giver mulighed for at vurdere satser træthed i dyrkede celler, således at udvide omfanget af fysiologiske data, der kan opnås fra dette system (Figur 8).
Cantilever kultur kan ændres til at omfatte motoriske neuroner i kultur-system med skeletmuskulaturen myorør 16, således at vurderingen af neuromuskulær synapse dannelse in vitro (figur 9). I sådanne kulturer, er satserne for spontane kontraktile aktivitet sammenlignet med satserne for sammentrækning som svar på behandling med en neuron-specifik stimulans, såsom glutamat. Observerede glutamat inducerede stigninger i kontraktionshastigheder antyder aktivering af dyrkede neuroner, hvilket fører til frigivelse af acetylcholin og efterfølgende myorør aktivering. Behandling med synaptiske inhibitorer, såsom acetylcholinreceptoren blocker D-tubocurarin, hvilket fører til ophør af glutamat-induceret aktivitet giver yderligere beviser for tilstedeværelsen af funktionelle neuromuskulære synapser i disse kulturer 16.
Figur 1. Skematisk detaljering cantilever produktionsprocessen flow. Numrene i flowdiagrammet korrelerer til protokoltrin i metoder afsnittet "Cantilever chip opspind." Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 2. Hardwareoplysninger om laser / foto-detektor system, der anvendes til at vurdere cellulær sammentrækning på udkragninger. (A) fotografi af den modificerede elektrofysiologiske mikroskop cantilever vurdering. Laseren (i) og fotodetektor (ii) er monteret under den fase på XY translationelle faser. En transparent dyrkningsskål er monteret på scenen (iii), som tillader laseren passage til cantilever matrix gennem undersiden af scenen. (B) Skematisk "top-down" perspektiv mikroskopbordet. XY translationelle etaper tillade bevægelse af laseren og foto-detektor i både X-og Y-fly (røde pile), lette bevægelse af laser til at afhøre hver cantilever i et array. Cantilever chips (III) bør placeres i den fase med støtteben ind mod højre side af scenen, for at systemet kan fungere korrekt. (C) Luk op fotografi af laseren (i) ogfotodetektor (ii) monteret under mikroskop fase. Laseren er placeret i en vinkel på 30 ° i forhold til planet af cantilever chip (θ). (D) Luk op fotografi af dyrkningsskålen. Bredt felt elektrisk stimulation påføres ved hjælp af et par sølvelektroder placeret 15 mm fra hinanden (iv). Et element opvarmning (v) er fastgjort til undersiden af skålen anvendes til at opretholde kulturen ved 37 ° C under analysen. Temperaturkontrol er dynamisk, og reguleres ved hjælp af en termistor placeret i mediet (ikke vist). Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 3. Flow diagram af logikken software til kontrol. scanning af laser og fotodetektor To softwaren sløjfer kontrol bevægelse: en vigtigste loop til bruger input og en løkke, der styrer scanningen bevægelse. Opsætning udføres, mens i de vigtigste loop efterfulgt af aktivering af den anden sløjfe til middelstore og high-throughput dataindsamling. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 4. Grafisk brugergrænseflade software, der anvendes til at kontrollere laser og fotodetektor positioner under cantilever vurdering. (A) Knapper til manuelt at kontrollere laser og fotodetektor positioner i både X og Y fly. (B) Betjeningsanordninger til manuel indstilling af positionerne af de 4 hjørne støtteben (1, 16, 17, og 32), således at softwaren tilekstrapolere placeringen af de resterende udkragninger i array. (C) Kontrol giver brugerne mulighed for at vælge, hvilke støtteben skal inkluderes i hver scanning. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 5. Billeder af en specialbygget cantilever chip til brug i dette system, og som er repræsentative billeder af celler opretholdt på lignende overflader. (A) Fotografi af en enkelt, specialbygget cantilever chip. Hver chip indeholder 32 støtteben arrangeret i 2 rækker med 16 Cantilever 1 er placeret i nederste venstre hjørne af billedet og fremspring 32 i øverste højre. Cantilever chips er 15 x 15 mm 2. (B) Fase-kontrast billede af primær rotte skelet muskelceller dyrket på udliggersek. Hver cantilever er 750 um lang, 100 um brede og 4 um tyk. (C) Immunocytokemisk plet af en primær rotte myotube vedligeholdes på en cantilever. Celler blev farvet under anvendelse af et antistof probe til myosin tung kæde. Bemærk det stribede udseende af den dyrkede fibre, hvilket indikerer modningen af den kontraktile maskiner. Cantilever kanter er blevet kunstigt fremhævet i billedet for at give en indikation af skalaen. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 6. Skematisk illustrerer de anvendte termer i Stoney ligninger for at udlede kraft produceret af myorør på udkragninger. Δ = cantilever spids nedbøjning og stress produceret af myotube, Cdetektor = systemet specifikke koefficienten spænding laser position på fotodetektor, θ = vinklen af laseren og detektoren i forhold til planet af cantilever E Si = elasticitetsmodul silicium, t Si = tykkelsen af cantileveren, t f = myotube tykkelse, v Si = gift forhold på silicium, L = cantilever længde, og P = vejlængde på laser fra cantilever tip til detektoren. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 7. Repræsentative rådata og analyse af kontraktile formular ved hjælp cantilever, der er beskrevet. (A) Eksempel på en rå data spor fra den bredt felt elektrisk stimulering af primære rotte myorør på udkragninger. Øverste spor = laser nedbøjning (i volt) i x-aksen, hvilket indikerer længderetningen pres på cantilever. Midt spor = laser deformation (i volt) i y-aksen angiver vridningstræk tværs cantilever. Bund spor = Angivelse af den tidsmæssige placering af elektriske impulser, der anvendes til at fremkalde myotube sammentrækning i dette system. (B) Brug af standard elektrofysiologi software, er det muligt at måle maksimale kraft (PF), tid til peak kraft (TTP) og tid til halvdelen afslapning (1/2 RT) fra det indsamlede rådata. (C) Sorterede sammentrækning data (n = 11) fra primær rotte skeletmuskulaturen myorør. Anvendelse af en modificeret Stoney ligning giver mulighed for beregning af cantileverbelastning fra rå dataaflæsninger i volt. Ud fra disse data kan direkte beregning af kraft (i newton), også genereres. Publicerede data genoptrykt wed tilladelse. 13 Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 8. Repræsentative data, der viser analyse af skeletmuskulaturen træthed i cantilever kulturer. Rådata (i volt) blev omdannet til en måling af myotube kraft (i nano-Newton) og re-plottet. Data illustrerer omfanget af myotube sammentrækninger på udkragninger som svar på 1 Hz bredt felt elektriske impulser efter 0 min (sort trace) og 120 min (grå trace) kontinuerlig stimulering. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 9. Repræsentative spor fra analysen af en skeletmuskel-motoneuron co-kultur vedligeholdes på udkragninger, der viser de funktionelle effekter af motoneuron stimulering med og uden tilsætning af en neuromuskulær blokker. Rådata (i volt) blev omdannet til en måling af myotube kraft (i nano-Newton) og re-plottet. (A) Måling af spontane sammentrækninger af de dyrkede myorør uden neuronal stimulering. (B) Måling af myotube sammentrækning efter neuronal stimulering via tilsætning af 200 pM glutamat. (C) Måling af myotube sammentrækning efter glutamat og 12,5 pM D-tubocurarin behandling. Publicerede data genoptrykt med tilladelse. 16 Klik her for at se en større version af dette tal.
Følgende tabel viser de specifikke reagenser, der anvendes til dyrkning af celler i valideringen beskrevne eksperimenter, samt det nødvendige udstyr til at udføre cantilever vurdering. Bemærk venligst, at kultur anvendte reagenser er ikke nødvendig, og dette system skal være let integreres med kulturen protokollerne for enhver laboratorium opretholde kontraktile celler in vitro. De anførte reagenser leveres bør efterforskerne ønsker at gentage de specifikke eksperimentelle resultater, der er beskrevet.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
De kritiske trin i analysen mikroskala støtteben for tegn på cellulær sammentrækning er placeringen af cantilever chip inden mikroskopbordet og den efterfølgende justering af laser og fotodetektor med spidsen af hjørne støtteben i arrayet. Hvis dette ikke sker præcist, så softwaren vil være i stand til at ekstrapolere positionerne af de resterende udkragninger i array, der kan føre til ophobning af falske negative under dataindsamlingen. Bør drage omsorg for at sikre, at cantilever chippen er flugter med bunden af dyrkningsskålen før kalibrering laser positioner. Hvis chippen sidder i en vinkel i skålen, vil det ændre banen af den afbøjede laserstråle og forvirre dataindsamlingen.
En funktionel luft-tabel skal anvendes til at annullere ud baggrund vibrationer under dataindsamlingen. Den lille tykkelse (ca. 4 um) af udkragninger anvendt i denne undersøgelse provides høj følsomhed for kontraktile aktivitet, men har den bivirkning, øget følsomhed over for vibrationer. Operatører bør sørge for at bevæge sig rundt i hardwaren så lidt som muligt i løbet af dataregistrering, for at reducere baggrunden aflæsninger. Endelig, når placere cantilever chip i den fase, sørge for at sikre, at chippen ikke kommer i kontakt med de stimulerende sølvelektroder i kulturen godt. Anvendelse af bredt feltstimulering med elektroden røre chippen vil ændre strømvejen og negativ indflydelse på systemets evne til effektivt at stimulere de dyrkede celler.
For at opnå mere præcise målinger af force output i skeletmuskulatur myorør, er det stærkt anbefales at udføre immunfarvning af de dyrkede celler engang funktionelle analyse er færdig. Ligningerne opført kræver input fra en myotube s tværsnitsareal (CSA) for at beregne kraft. Mens en antaget værdi kan anvendes på basis af porrige data, måling af en myotube nøjagtige CSA hjælp konfokale billeddiagnostiske teknikker vil give en mere præcis vurdering af den kraft, der udøves af den ordregivende myotube. Vedrørende rå sammentrækning data til de fysiske egenskaber af den pågældende celle er værdifuldt i normalisere resultater på tværs af flere støtteben og mellem eksperimentelle betingelser 15, og derfor afgørende for at skabe præcise forudsigelser af hele vævsreaktioner til narkotikabehandling eller sygdom. Stoney ligninger antage de undersøgte myorør spænder over hele længden af cantilever så bør gøres til kun at omfatte data opnået fra celler, der er i overensstemmelse med denne antagelse. Hvis dette ikke er muligt, kan finite element analyse bruges til at give en nøjagtig måling af kraft fra mindre myorør som offentliggjort tidligere 15. Denne analysemetode er langt mere arbejdskrævende, og derfor ikke egnede til højere throughput applikationer, men kan være nødvendigt, hvis optimeretikke kan opnås cellekulturer i overensstemmelse med Stoney forudsætninger.
Som allerede nævnt, kan kultur parametre overføres fra standard dækglas præparater. Dog anbefales det at overveje at bruge serumfrie medier sammensætninger og ikke-biologiske substrater til anvendelse af dette system i lægemiddel screening applikationer. På grund af den udefinerede natur af animalsk sera, kan virkningen af hidtil ukendte terapeutiske midler blive forvirret af optagelse af sådanne tilsætningsstoffer i dyrkningsmediet. Serumfrie medier formuleringer er tilgængelige for både gnavere og skeletmuskulaturen kulturer menneskelige 18-21 og give en mere kontrolleret, veldefinerede miljø til at udføre sammensatte vurdering. Tilsvarende anvendelse af biologiske belægninger (kollagen, laminin, etc.) på udkragninger indfører variabilitet celle præparater, som undgås ved anvendelse af ikke-biologiske substrater. Aflejringen af silan selvsamlede monolag på kultur overflader har vist abflittigt for at støtte vedhæftningen og udvikling af multiple celletyper 16,18,20,22-31, og udgør et middel til at generere fuldt definerede overflader i en pålidelig og reproducerbar måde.
På grund af de mange forskellige kontraktile celler til stede i mammale systemer, anvendelse af denne model for in vitro-assays er relativt bredt. Selv optimeret ved hjælp af skeletmuskelceller systemet potentielt anvendes på glatte muskelceller og cardiomyocytter samt giver den mulighed for at foretage en hurtig vurdering af dosisreaktioner hidtil ukendte terapeutiske midler i disse celler i real-tid. Aktuelle cantilever chip består af en vifte af 32 støtteben (figur 5A), men kan nemt ændres til at omfatte mange flere. Analyse af sådanne arrays producerer en lang række af datapunkter fra en enkelt kultur, hvilket i høj grad øger den statistiske effekt af eventuelle konstaterede forskelle. Som det fremgår af figur 8, celler dyrketi dette system undergår træthed over tid, som reaktion på kontinuerlig bredt felt stimulation, hvilket man kan vurdere virkninger lægemiddel på udholdenhed niveauer af celler in vitro. Tilsætning af innerverer motoriske neuroner til denne kultur Modellen giver ligeledes vurdering af synapsedannelse gennem måling af muskel sammentrækning som svar på neuronale stimulanser (figur 9). Mens måling af baseline funktionelle parametre i en multiplex assay (figur 7) har indlysende fordele i forhold til standard biomolekylært vurdering af in vitro kulturer, evnen til at vurdere neuromuskulær funktionalitet og udholdenhed kapacitet seedede celler øger anvendeligheden af denne model for lægemiddel-screening og sygdom modellering applikationer. Den beskrevne teknik giver efterforskerne de midler til at udføre hurtig, lave omkostninger funktionel vurdering af både raske og syge muskelceller in vitro. Alsidigheden af kultur-systemet, og hIGH niveau af funktionel detalje opnås fra analyse af de rå data, skal producere mere præcise forudsigelser af in vivo væv reaktioner på nye patologiske og kemiske udfordringer.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Acknowledgments
Denne forskning blev finansieret af National Institute of Health tilskud numre R01NS050452 og R01EB009429. Fabrikation af cantilever chips blev udført eksternt af samarbejdspartnere på nanofabrikation anlæg beliggende ved Cornell University. Alt udstyr, der anvendes i cantilever produktionsprocessen blev placeret i denne facilitet. Særlig tak til Mandy Esch og Jean-Matthieu Prot for deres hjælp med cantilever mikro-fabrikation. Video animation af cantilever funktionalitet blev genereret af Charles Hughes, Alex Zelenin og Eric Imperiale fra Synthetic Reality Lab på UCF.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Primary rat muscle growth medium | |||
| Neurobasal medium | Life Technologies | 21103-049 | |
| B27 (50x) | Life Technologies | 17504044 | 1x |
| Glutamax (100x) | Life Technologies | 35050061 | 1x |
| G5 supplement | Life Technologies | 17503-012 | 1x |
| Glial-Derived Neurotrophic Factor | Cell sciences | CRG400B | 20 ng/ml |
| Brain-Derived Neurotrophic Factor | Cell sciences | CRB600B | 20 ng/ml |
| Ciliary Neurotrophic Factor | Cell sciences | CRC400A | 40 ng/ml |
| Neurotrophin-3 | Cell sciences | CRN500B | 20 ng/ml |
| Neurotrophin-4 | Cell sciences | CRN501B | 20 ng/ml |
| Acidic Fibroblast Growth Factor | Life Technologies | 13241-013 | 25 ng/ml |
| Cardiotrophin-1 | Cell sciences | CRC700B | 20 ng/ml |
| Heparin Sulphate | Sigma | D9809 | 100 ng/ml |
| Leukemia Inhibitory Factor | Sigma | L5158 | 20 ng/ml |
| Vitronectin | Sigma | V0132 | 100 ng/ml |
| Primary rat muscle differentiation medium | |||
| NB Activ 4 | Brain Bits LLC | NB4-500 | |
| Equipment | |||
| Class 2 red diode laser | Newport | ||
| Photo-detector | Noah Industries | ||
| Model 2100 Pulse stimulator | A-M systems | ||
| Multiclamp 700B Digitizer | Axon Instruments | ||
| Patch clamp microscope and stage | Olympus | ||
| Delta T4 culture dish controller | Bioptechs | ||
| Axoscope software | Molecular Devices | ||
| LabVIEW software | National Instruments | ||
| 37 oC, 5% CO2 incubator | NAPCO | ||
| Class 2 microbiological flow hood | Labconco | ||
| Pipettes and tips | Eppendorf |
References
- Bischoff, R. Enzymatic liberation of myogenic cells from adult rat muscle. Anat. Rec. 180, 645-661 (1974).
- Yasin, R., et al. A quantitative technique for growing human adult skeletal muscle in culture starting from mononucleated cells. J. Neurol. Sci. 32, 347-360 (1977).
- Dennis, R. G., Kosnik, P. E., 2nd, Excitability and isometric contractile properties of mammalian skeletal muscle constructs engineered in vitro. In Vitro Cell Dev. Biol. Anim. 36, 327-335 (2000).
- Khodabukus, A., Baar, K. Defined electrical stimulation emphasizing excitability for the development and testing of engineered skeletal muscle. Tissue Eng Part C Methods. 18, 349-357 (2012).
- Langelaan, M. L. P., et al. Advanced maturation by electrical stimulation: Differences in response between C2C12 and primary muscle progenitor cells. Journal of tissue engineering and regenerative medicine. 5, 529-539 (2011).
- Stephenson, G. M., O'Callaghan, A., Stephenson, D. G. Single-fiber study of contractile and biochemical properties of skeletal muscles in streptozotocin-induced diabetic rats. Diabetes. 43, 622-628 (1994).
- Harber, M., Trappe, S. Single muscle fiber contractile properties of young competitive distance runners. Journal of applied physiology (Bethesda, Md: 1985). 105, 629-636 (2008).
- Hvid, L. G., et al. Four days of muscle disuse impairs single fiber contractile function in young and old healthy men. Experimental gerontology. 48, 154-161 (2013).
- Edman, K. A.
- Krivickas, L. S., Walsh, R., Amato, A. A. Single muscle fiber contractile properties in adults with muscular dystrophy treated with MYO-029. Muscle Nerve. 39, 3-9 (2009).
- Sung, J. H., et al. Microfabricated mammalian organ systems and their integration into models of whole animals and humans. Lab on a chip. 13, 1201-1212 (2013).
- Wilson, K., Molnar, P., Hickman, J. J. Integration of functional myotubes with a Bio-MEMS device for non-invasive interrogation. Lab on a chip. 7, 920-922 (2007).
- Wilson, K., Das, M., Wahl, K. J., Colton, R. J., Hickman, J. Measurement of contractile stress generated by cultured rat muscle on silicon cantilevers for toxin detection and muscle performance enhancement. PLoS ONE. 5, (2010).
- Binnig, G., Quate, C. F., Gerber, C.
- Pirozzi, K. L., Long, C. J., McAleer, C. W., Smith, A. S., Hickman, J. J. Correlation of embryonic skeletal muscle myotube physical characteristics with contractile force generation on an atomic force microscope-based bio-microelectromechanical systems device. Applied physics letters. 103, 83108 (2013).
- Smith, A., Long, C., Pirozzi, K., Hickman, J. A functional system for high-content screening of neuromuscular junctions in vitro. Technology. 1, 37-48 (2013).
- Stenger, D. A., et al. Coplanar molecular assemblies of amino- and perfluorinated alkylsilanes: characterization and geometric definition of mammalian cell adhesion and growth. Journal of the American Chemical Society. 114, 8435-8442 (1992).
- Das, M., Rumsey, J. W., Bhargava, N., Stancescu, M., Hickman, J. J. A defined long-term in vitro tissue engineered model of neuromuscular junctions. Biomaterials. 31, 4880-4888 (2010).
- Rumsey, J. W., Das, M., Bhalkikar, A., Stancescu, M., Hickman, J. J. Tissue engineering the mechanosensory circuit of the stretch reflex arc: Sensory neuron innervation of intrafusal muscle fibers. Biomaterials. 31, 8218-8227 (2010).
- Das, M., Rumsey, J. W., Bhargava, N., Stancescu, M., Hickman, J. J. Skeletal muscle tissue engineering: A maturation model promoting long-term survival of myotubes, structural development of the excitation-contraction coupling apparatus and neonatal myosin heavy chain expression. Biomaterials. 30, 5392-5402 (2009).
- Das, M., et al. Developing a novel serum-free cell culture model of skeletal muscle differentiation by systematically studying the role of different growth factors in myotube formation. In Vitro Cell Dev Biol Anim. 45, 378-387 (2009).
- Stenger, D. A., Pike, C. J., Hickman, J. J., Cotman, C. W. Surface determinants of neuronal survival and growth on self-assembled monolayers in culture. Brain research. 630, 136-147 (1993).
- Hickman, J. J., et al. Rational pattern design for in vitro cellular networks using surface photochemistry. Journal of Vacuum Scienc., & Technology A: Vacuum, Surfaces, and Films. 12, 607-616 (1994).
- Das, M., Molnar, P., Devaraj, H., Poeta, M., Hickman, J. J. Electrophysiological and morphological characterization of rat embryonic motor neurons in a defined system. Biotechnology progress. 19, 1756-1761 (2003).
- Rumsey, J. W., et al. Node of Ranvier formation on motor neurons in vitro. Biomaterials. 30, 3567-3572 (2009).
- Murugan, R., Molnar, P., Rao, K. P., Hickman, J. J. Biomaterial Surface patterning of self assembled monolayers for controlling neuronal cell behavior. International journal of biomedical engineering and technology. 2, 104-134 (2009).
- Guo, X., Johe, K., Molnar, P., Davis, H., Hickman, J. Characterization of a human fetal spinal cord stem cell line, NSI-566RSC, and its induction to functional motoneurons. Journal of Tissue Engineering and Regenerative Medicine. 4, 181-193 (2010).
- Varghese, K., et al. A new target for amyloid beta toxicity validated by standard and high-throughput electrophysiology. PLoS ONE. 5, e8643 (2010).
- Natarajan, A., et al. Patterned cardiomyocytes on microelectrode arrays as a functional, high information content drug screening platform. Biomaterials. 32, 4267-4274 (2011).
- Davis, H., et al. Rat Cortical Oligodendrocyte-Embryonic Motoneuron Co-Culture: An Axon-Oligodendrocyte Interaction Model. Journal of biomaterials and tissue. 2, 206-214 (2012).
- Natarajan, A., DeMarse, T., Molnar, P., Hickman, J. Engineered In Vitro Feed-Forward Networks. J Biotechnol Biomater. 3, 2 (2013).
