Summary
Dieses Protokoll beschreibt die Verwendung von Mikro Siliziumcantilevern biegsam Kulturoberflächen zur Messung der Kontraktionskraft der Muskelzellen in vitro. Zellkontraktion bewirkt Cantilever Biege, die gemessen werden können, aufgezeichnet und umgerechnet in die Messwerte von Kraft und bietet eine nicht-invasive und skalierbaren System zur Messung Kontraktionsfunktion in vitro.
Abstract
Die Entwicklung von mehr vorausschauende und biologisch relevanten in-vitro-Tests liegt auf der Weiterentwicklung der vielseitigen Zellkultursysteme, die die funktionelle Beurteilung der gesetzten Zellen zu erleichtern sagt. Zu diesem Zweck bietet Mikrotechnik Ausleger eine Plattform, mit der die Funktionalität der Kontraktions einer Reihe von Zelltypen, einschließlich Skelett, Herz und Zellen der glatten Muskulatur zu messen, durch die Bewertung der Kontraktion induziert Substrat Biegen. Anwendung der gemultiplexten Auslegerarrays stellt die Mittel zur Entwicklung moderaten bis hohen Durchsatz Protokolle zur Beurteilung der Wirksamkeit von Medikamenten und Toxizität, Krankheits-Phänotyp und Progression sowie neuromuskuläre und andere Zell-Zell-Interaktionen. Diese Handschrift enthält die Details zur Herstellung zuverlässiger Cantilever-Arrays für diesen Zweck, und die erforderlich sind, um erfolgreich Kulturzellen auf diesen Flächen Methoden. Weitere Beschreibung über die notwendigen funktionalen anal führen Sie die Schritte vorgesehenlyse von kontraktilen Zelltypen auf solche Arrays mit einem neuartigen Laser-und Foto-Detektor-System gepflegt. Die repräsentativen Daten zur Verfügung gestellt Highlights die Präzision und reproduzierbare Art der Analyse der Kontraktionsfunktion möglich mit diesem System, sowie die breite Palette von Studien, denen solche Technologie kann angewandt werden. Erfolgreiche weit verbreitete Annahme dieses Systems konnten die Ermittler stellen die Mittel, um eine schnelle, kostengünstige funktionelle Studien in vitro durchzuführen, was zu genaueren Vorhersagen von Gewebe Leistung, die Entwicklung der Krankheit und der Reaktion auf neue therapeutische Behandlung.
Protocol
1. Freischwinger Chipfertigungs
Dargestellten Details der beschriebenen Herstellungsschritte sind in Figur 1 versehen.
- Platzieren Silicon-On-Insulator (SOI)-Wafer in einem Ofen gebacken und bei 125 ° C für 20 Minuten, um sie zu entwässern.
- Abscheidung einer 1,5 um dicken Schicht aus Siliziumoxid auf den Griff Schicht des entwässerten SOI Wafers unter Verwendung einer Plasma Enhanced Chemical Vapor Deposition (PECVD)-Tool.
- Platzieren des Wafers auf dem Spin-Coater Futter mit der Vorrichtungsschicht nach oben weist. Sicherzustellen Wafer zentriert Streifen 2 ml P20-Primer auf der Mitte des Wafers und Schleudern bei 3000 Upm für 60 sec bei einer Beschleunigung von 1000 Umdrehungen / sec. P20 Primer fördert die Haftung des Photoresist an der Vorrichtungsschicht.
- Während der Wafer weiterhin auf dem Spin-Coater Futter Streifen 2 ml S1818 Photoresist auf die Mitte des Wafers und Schleudern bei 3000 Upm für 60 sec bei einer Beschleunigung von 1000 Umdrehungen / Sek obtain eine 1,5 um dicke Schicht Photolack.
- Legen Sie die Wafer auf einer heißen Platte und führen Sie einen Soft backen bei 115 ° C für 1 min.
- Durchführen einer harten Kontakt UV Belichtung unter Verwendung einer Photolithographie-Kontaktmaskenausrichter, um das Muster von der Auslegermaske auf den Fotolack auf der Geräteschicht übertragen. Berechnung der Belichtungszeit auf der Grundlage einer Belichtungsenergie von 125 mJ / cm 2 für S1818 Photoresist.
- Entwicklung der Photolack durch Eintauchen der Wafer in einem Fotolack 726 MIF-Entwickler für 1 min unter leichtem Schütteln der Wafer hin und her.
- Spülen Sie die Wafer mit deionisiertem (DI) Wasser und trocknen Sie sie am besten mit einem Spin-rinse Trockner (SRD)-Tool.
- Entfernen des Photoresists von der Kante des Wafers (bis zu 5 mm von der Kante) mit einem Wattestäbchen in Aceton getaucht.
- Laden Sie die Wafer in einer tiefen Reactive Ion Etch (DRIE) Werkzeug, mit dem Photoresist Seite nach oben, und führen Sie ein Rezept, um die strukturierte Siliziumschicht durch die Devi ätzence-Schicht. Die vergrabene Oxidschicht dient als Ätzstopp, so führen eine Ätzung mit 50% bis 100% mehr Zyklen, als erwartet wird erforderlich zu sein, um ein vollständiges Ätzen zu gewährleisten.
- Platzieren des Wafers in einem heißen Bad Photoresistlösung für 20 min, um die Fotolackentfernung. Übertragen Sie die Wafer einem Eilgang-Rinser (QDR), um die Wafer mit DI-Wasser spülen. Nach der Fotolackentfernung, laden Sie die Wafer in einer SRD-Tool zu spülen und trocknen Wafer. Überprüfen Sie die Wafer unter dem Mikroskop, um sicherzustellen, der Ausleger Muster erscheint, wie erwartet.
- Abscheidung einer 1 um dicken Schicht von undotiertem Siliziumoxid auf der Bauteilschicht des Wafers unter Verwendung eines PECVD-Anlage. Diese Oxidschicht dient als Schutzschicht für die Ausleger während der weiteren Verarbeitungsschritte.
- Platzieren des Wafers auf dem Spin-Coater Spannfutter mit der Griffschicht nach oben, um die Verarbeitung von der Rückseite des Wafers beginnen. Sicherzustellen Wafer zentriert Streifen 2 ml P20-Primer auf der Mitte des Wafers und Schleudern bei 3000 UpMfür 60 Sekunden bei einer Beschleunigung von 1000 U / sec.
- Während der Wafer weiterhin auf dem Spin-Coater Futter Streifen 2 ml SPR220-4.5 Photoresist auf die Mitte des Wafers und Schleudern bei 2000 Upm für 45 sec bei einer Beschleunigung von 1000 Umdrehungen / sec, um eine 6,5 um dicke Schicht zu erhalten, Photoresist.
- Legen Sie die Wafer auf einer heißen Platte Nähe, um eine weiche backen bei 115 ° C für 2 min durchzuführen.
- Mit Hilfe eines Photolithographie Kontakt Ausrichter der Lage, vorne / hinten Ausrichtung, richten Sie die Rückseite Fenster Maske auf der Vorderseite freitragende Muster und führen Sie eine harte Kontakt UV-Exposition, um die Muster von der Rückseite Fenster Maske auf den Photolack auf dem Griff Schicht übertragen. Verwenden Sie eine Belichtungszeit, basierend auf Belichtungsenergiewert von 480 mJ / cm 2 für SPR220-4.5 Photolack berechnet.
- Nach der UV-Belichtung, lassen die Scheiben bleiben in einem dunklen Raum 30 Minuten lang vor dem nächsten Verarbeitungsschritt.
- Entwickeln des Photoresists durch Eintauchen des Wafers inein 726 MIF Photoresistentwickler für 2 min unter leichtem Schütteln der Wafer hin und her.
- Spülen Sie die Wafer mit deionisiertem (DI) Wasser und trocknen Sie sie am besten mit einem Spin-rinse Trockner (SRD)-Tool.
- Platzieren der Wafer in einem Ofen bei 90 ° C für 12 Stunden.
- Ätzen der Silizium-Oxid-Schicht auf der Rückseite des Wafers unter Verwendung eines RIE-System mit fluorierten Gasen und ein Rezept für das Ätzen umfaßt. Die strukturierte Oxid auf der Rückseite des Wafers wirkt als eine Ätzmaske für die weitere Verarbeitung. Untersuchen der Wafer unter dem Mikroskop, um zu gewährleisten, daß das Siliziumoxid in der freiliegenden Fenster vollständig geätzt.
- Entfernen des Photoresists auf dem Rand des Wafers (bis zu 5 mm von der Kante) mit einem Reinraum Tupfer in Aceton getaucht.
- Laden Sie die Wafer in einem DRIE Werkzeug mit und führen Sie ein Rezept, um die strukturierte Griffschicht bis zu einer Tiefe von 500 um mit der vergrabenen Oxidschicht, die als Ätzstopp ätzen. Aufgeteilt in mehrere dieses Etch läuft auf eine übermäßige Erwärmung des zu verhindernWafer, die im Widerspruch Ätzen des Silizium bewirkt. Dieser Ätzschritt entfernt das Silizium unter den Auslegern.
- Durchführen einer nassen Ätzschritt unter Verwendung von 25% verdünnte HF-Ätzmittel, um die vergrabene Oxidschicht unterhalb der Ausleger und die schützende Oxidschicht auf der Oberseite der Kragarme abzustreifen.
HINWEIS: Dieser Schritt setzt die untere Oberfläche der Siliziumausleger und öffnet ein Fenster unter einen Zugriff auf den Ausleger mit der Lasersonde ist. - Spülen der Wafer mit einer Reihe von Wasserbädern DI und sorgfältig mit Stickstoff trocken. Da die Ausleger sind nur an ihrer Basis unterstützt, verwenden Sie keine Sprays kraft DI-Wasser oder Inertgas direkt auf den Auslegern.
- Spalten die einzelnen Chips aus dem Wafer entlang der Schicht während der Griff Ätzschritt hergestellt spalten Linien.
2. Zellkultur
- Bereiten 13F Deckgläser nach bisher veröffentlichten Methoden 17.
HINWEIS: Wenn 13F Buchtrslips nicht verfügbar sind, kann jede beliebige hydrophobe Oberfläche mit einem Kontaktwinkel von über 95 ° verwendet werden. - Sterilisieren Cantilever-Chips und 13F Deckgläschen in einer 70% igen Ethanollösung und an der Luft trocknen in einem Flow-Haube.
- Zeigen einzelnen Cantilever-Chips auf der Oberseite der Deckgläser 13F in einem Standard-12-Well-Platte.
- Mantel die Ausleger mit dem Biopolymer oder Oberflächenmodifikation für die Zelltyp optimiert wird nach den Standard-Zellkulturprotokolle verwendet.
- Resuspendieren der Zellen in ihrer spezifischen Wachstumsmedium auf die gewünschte Konzentration.
HINWEIS: Dieses Protokoll wird bei einer erheblichen Anzahl von Zellen fallen durch die Fenster freitragende und nicht zu der gewünschten Auslegeroberfläche anhaftenden führen. Zellpräparate sollten daher 3-4x konzentrierter als für Standard-Deckglas Vorbereitungen getroffen werden. B. Aussäen von Rattenskelettmuskelsatellitenzellen wird typischerweise unter Verwendung einer Aussaatdichte von 500 bis 700 Zellen / mm ² durchgeführt 15,16Und sind mit Cantilever-Substrate bei 2.000 Zellen / mm ² eingesetzt. Optimierungsversuche sollte mit neuen Zellquellen durchgeführt werden, um eine geeignete Aussaatdichte zu ermitteln. - Je 200 ul der Zellsuspension auf dem Ausleger Chipoberfläche, wodurch die Blase des Mediums deckt die freitragende Fenster ganz. Wenn das Medium transportiert durch das Fenster und keine statische Ball oberhalb der Ausleger bilden ersetzen 13F Deckglas und erneut versuchen, die Beschichtung.
- Übertragen Sie die Platte mit den Chips in einen Inkubator und damit die Zellen für mindestens 1 Stunde (vorzugsweise 2-3 h) entsprechen.
- Nach diesem Zeitraum Beschichtung, sterile Pinzette, um den Chip zu einer sauberen und die Kultur mit 1 ml Wachstumsmedium zu übertragen, ohne Deckglas 13F und nachfüllen.
- Bringen Sie die Platte in den Inkubator.
- Pflegen Zellen nach ihren Standardprotokoll für die In-vitro-Wartung auf Deckgläsern. Für Skelettmuskelzellen,einen Schalter der Mediumzusammensetzung zu Myotuben Bildung zu induzieren, wenn Zellen konfluent erforderlich.
3. Einrichten von Hardware und Software für Cantileverauslenkung Analyse
- Legen Sie einen beheizten Kulturschale in die Stufe eines aufrechten Elektrophysiologie Mikroskop.
- 3 ml des Nährmediums werden die Zellen noch in (+ 10 mM HEPES) suspendiert, um die erhitzte Mikroskoptisch.
- Halterung aus Edelstahl-Elektroden auf der Innenseite der erhitzten Kulturschale in einem Abstand von 15 mm und sie an einen Impulsgenerator, fähig zur Herstellung von Feldstimulationsimpulse variierender Intensität, Frequenz und Wellenform, damit das System die Feldstimulation zu erzeugen von Zellen, wenn angemessen.
- Schraube eine Helium-Neon-Laser, auf XY Translationsstufen angebracht sind, die an der Unterseite des Mikroskoptisches und so einstellen, daß der Laserstrahl durch die Basis der erhitzten Kulturschale in einem Winkel von 30 ° gerichtet RelativE auf die Ebene des Auslegers.
- Schraube eine Quadranten-Photodetektormodul, auf XY Translations Stufen montiert, die an der Unterseite des Mikroskoptisches und die Position, so dass der reflektierte Laserstrahl landet in der Mitte der 4 Quadranten. Abbildung 2 gibt einen Überblick über die Hardware einrichten die für die Durchführung des beschriebenen Protokolls.
- Schreiben Sie ein Software-Programm, um die Linearantriebe, die über den Auslegern scannen steuern. Schreiben des Software-Programms mit Bezug auf das Flußdiagramm in Figur 3 versehen. Die für die Verwendung mit diesem System programmiert graphische Schnittstelle ist in Figur 4 vorgesehen.
4. Aufnahme Cantileverauslenkung Daten
- Schalten Sie den Freischwinger-Analyse-Hardware und der zugehörigen Software.
- Legen Sie die beheizten Bühne Thermistor in das Medium und warten, bis es 37 ° C zu lesen.
- Legen Sie die Cantilever-Chip in die Stufe mit der cantilevers in Richtung der rechten Seite der Bühne ausgerichtet.
- Schalten Sie das Mikroskop-Lichtquelle.
- Fokussieren Sie das Mikroskop, um die Kanten der Ausleger in den Blick zu bringen und mit dem Laser / Photodetektor Steuerungssoftware, um den Laserstrahl an der Spitze des Auslegers 1. HINWEIS Position: Unter der Annahme, die Ausleger sind auf der rechten Seite der Bühne, Freischwinger 1 ausgerichtet ist die in der oberen linken Ecke des Arrays positioniert und Zahlen laufen auf 16 in der unteren linken. Cantilever 17 ist in der oberen rechten Position und läuft bis 32 in der unteren rechten (5A).
- Drücken Sie "Play" auf der Recording-Software.
- Positionieren des Fotodetektors, so dass der Signalpegel "0" in sowohl x als auch y-Rahmen, indem die Schrittmotoren Steuerung des Photodetektors.
- Set Freischwinger 1 Position in der Laser / Photodetektor Steuersoftware (Abbildung 4).
- Bewegen Sie den Laser auf die Spitze des Auslegers 16, wiederholen Sie Schritt 4.7., Und legen cantilevER 16 Position in der Laser / Photodetektor Steuerungssoftware.
- Bewegen Sie den Laser auf die Spitze des Auslegers 32, wiederholen Sie Schritt 4.7., Und setzen Ausleger 32 Position in der Laser / Photodetektor Steuerungssoftware.
- Bewegen Sie den Laser auf die Spitze des Auslegers 17, wiederholen Sie Schritt 4.7., Und setzen Ausleger 17 Position in der Laser / Photodetektor Steuerungssoftware.
- Schalten Sie das Mikroskop Lichtquelle und das Deckenlicht im Labor.
- Drücken Sie auf "Record" auf der Recording-Software.
- Stellen Sie den Impulsgenerator Hardware bis 40 ms, 5 V Impulse mit einer Frequenz von 1 Hz, und schalten Sie das Gerät ein.
HINWEIS: Optional, beschäftigen optimierte Stimulationsprotokolle für bestimmte Zellquellen an dieser Stelle, die angegebenen Einstellungen sind Leitlinien auf der Basis gesammelter Daten mit Hilfe von Mensch und Nagetier-Zellquellen 12,13,15,16. - Mit dem Laser / Photodetektor Steuerungssoftware, setzen Sie die Hardware, um über die 32 Freischwinger Array scannen, Anhalten für 5 Sekunden bei jedem aufe.
- Wenn der Scan der 32 Ausleger abgeschlossen ist, schalten Sie den Stimulator, dann stoppen Sie die Aufnahme-Software und bringen Sie die Datendatei.
- Untersuchen Sie die aufgezeichneten Trace von jedem Ausleger zum Nachweis von Kontraktion. Notieren Sie jedes Frei mit positiven Antworten. Einer Kontraktion wird als Peak bezeichnet, wenn die Durchbiegung mindestens 0,1 V über der Basislinie.
- Entfernen Sie alle nicht mehr reagiert Ausleger aus der Scan-Protokoll auf der Laser / Photodetektor Steuerungssoftware.
- Die aktiven Ausleger können dann ohne Stimulation, um eine Lesung der spontanen Kontraktionsaktivität der Zelle erhalten erneut gescannt werden.
- Führen Scans mit oder ohne weites Feld elektrische Stimulation nach Zugabe einer therapeutischen Verbindung zu dem Medium, um ihre Wirkung auf die funktionelle Leistung der kultivierten Zellen zu beobachten.
- Zuführen Müdigkeit Einschätzungen von elektrischen Stimulation der Zellen über einen längeren Zeitraum und Scanebenen contr actility zu messen, wie lange es dauert, Spitzenkraft unter einen bestimmten Schwellenwert fällt.
- In Experimenten, in denen Motorneuronen in Co-Kultur mit Muskel gehalten wird, zu messen neuromuskulären Verbindungsbildung durch Behandlung von Motoneuronen-Myotuben Ausleger Co-Kulturen mit einem neuronalen Stimulans (wie Glutamat) oder synaptische Inhibitor (zB D-Tubocurarin) und Scannen und Zunahmen und Abnahmen der Spontanaktivität bzw. 16.
- Führen bestimmte Abtastungen, wie durch die Anforderungen der geplanten Experimenten bestimmt.
5. Analyse der Daten Cantileverauslenkung
- Verwendung modifizierter Stoney-Gleichungen 15 (siehe unten), um rohe Cantileverauslenkung Daten (in Volt) in eine Auslesung der Stress in der Zellschicht oder Myotube (in Pascal) und eine direkte Messung der zellulären Kontraktionskraft (in nano-Newton) zu konvertieren:
ad / 51866 / 51866eq1.jpg "/> Gleichung 1
Gleichung 2 - Wobei δ = Auslegerspitzenbiegung und Spannung durch die Myotuben hergestellt, σ c = Spannung, die durch die Myotuben hergestellt, unter der Annahme einer gleichförmigen dicken Film über die gesamte Breite des freitragenden, C = der Detektorsystem-spezifischen Koeffizienten in Bezug Spannung der Laserposition auf dem Foto -Detektor, θ = der Winkel der Laser und der Detektor relativ zu der Ebene des Auslegers, E Si = die Elastizitätsmoduls von Silizium, Si t = die Dicke des Auslegers, t f = Myotuben Dicke, V Si = Verhältnis Giftes Silizium, L = Länge Ausleger, P = Weglänge des Lasers von Cantileverspitze zu Detektor und w
- Angenommen, die Myotuben wird ein gleichmäßiger Film ist die Kraft in der Myotuben gleich der Kraft in dem Film, was zu Gleichung 3 durch Gleichsetzen der Berechnung der Kraft von Stress und die angenommene Zellquerschnittsfläche, die für die Anwendung der Stoney verwendet wurde Gleichung.
Gleichung 3 - Folgenden Funktionsdatenerfassung, beheben Cantilever-Chips für immunzytochemische Analyse oder nutzen Zellen für Proteine oder DNA-Analyse unter Verwendung von Standardverfahren.
- Optional liefern die Zellen in den Inkubator statt der Vorbereitung für die molekulare Analyse, um funktionale Leistung zu einem späteren Zeitpunkt, neu zu bewerten.
Gleichung 2 Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Erfolgreiche Kultur von kontraktilen Zellen Ausleger ist ein relativ einfaches Verfahren, unter Verwendung von Standard-Zellkulturtechniken (Abbildung 5). Der Anteil der Ausleger unterstützt Vertrags Zellen variiert je nach Zelltyp untersucht und spezifische Kulturtechnik beschäftigt. Verwendung von primären embryonalen Zellen aus Rattenhinterglieder abgeleitet wurden kontraktile Aktivität auf 12% der untersuchten Ausleger erfaßt wird (n = 4). Analyse der Kontraktionsfähigkeit unter Verwendung der beschriebenen Laser und Photodetektor-System liefert genaue Echtzeit-Daten, die zu der funktionalen Laufzeit der beimpften Zellen. Einsatz von Standard-Software kann dann elektrophysiologische aus Kulturen behandelt werden, um die Rohdaten zu analysieren, die Erleichterung Berechnung der jeweiligen funktionalen Eigenschaften, wie Maximalkraft, Zeit, Kraft-, und Zeit, um die Hälfte Entspannung, wie in Abbildung 7 dargestellt. Nachfolgende Datensammlung mit therapeutischen Verbindungen erlaubtVergleich der funktionellen Eigenschaften mit und ohne Wirkstoffzugabe, wodurch Beurteilung der Aktivität und anschließende Verbindung Vorhersage der in vivo-Antworten. Außerdem verlängert Stimulationsprotokolle stellen die Mittel, um Preise der Ermüdung in kultivierten Zellen zu beurteilen, wodurch die Verbreiterung der Ebene der physiologischen Daten, die aus diesem System (Abbildung 8).
Die freitragende Kultur kann modifiziert werden, um Motorneuronen im Kultursystem mit Skelettmuskel Myotuben 16 umfassen, um Beurteilung der neuromuskulären Synapse Formation in vitro (Abbildung 9) zu ermöglichen. In solchen Kulturen, die Rate von spontanen Kontraktionsaktivität auf Raten verglichen werden Kontraktion in Reaktion auf die Behandlung mit einem Neuron-spezifische Stimulans, wie Glutamat. Alle beobachteten Glutamat induzierte Zunahme der Kontraktionsraten empfehlen die Aktivierung von kultivierten Neuronen, was zu Acetylcholin-Freisetzung und anschließende MyoRohr-Aktivierung. Behandlung mit synaptischen Inhibitoren, wie Acetylcholin-Rezeptor-Blocker D-Tubocurarin, was zur Beendigung der Glutamat-induzierten Aktivität liefern einen weiteren Beweis für die Anwesenheit von funktionellen neuromuskulären Synapsen in diesen Kulturen 16.
Abbildung 1. Schematische Detaillierung Cantilever Herstellungsprozess fließen. Die im Flussdiagramm aufgeführten Zahlen korrelieren mit Protokollschritte im Methodenteil mit dem Titel "Freischwinger Chipherstellung." Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
Abbildung 2. HardwareDetails der Laser / Photodetektor-System verwendet, um zelluläre Kontraktion auf Ausleger zu bewerten. (A) Foto des modifizierten elektroMikroskop für Cantilever-Bewertung verwendet. Der Laser (i) und Photodetektor (ii) unter der Bühne auf XY Translationsstufen montiert. Eine transparente Kulturschale auf der Bühne (iii), die Laser-Durchgang auf den Ausleger Array durch die Unterseite der Bühne erlaubt (B) Schematische "top-down" Perspektive der Mikroskoptisch montiert.. XY-Translationsstufen eine Bewegung des Lasers und des Photodetektors in X und Y-Ebenen (rote Pfeile), erleichtert die Bewegung des Lasers, um jeden Ausleger in einem Array abzufragen. Cantilever-Chips (iii) sollten in die Stufe mit den Auslegern mit Blick nach rechts von der Bühne, um für das System korrekt arbeitet platziert werden. (C) Close up Foto des Lasers (i) undPhotodetektor (ii) angebracht unter dem Objekttisch. Der Laser wird in einem 30 ° Winkel relativ zu der Ebene des Auslegers Chip (θ) angeordnet ist. (D) in der Nähe Photographie der Kulturschale. Breitfeld elektrische Stimulation mittels eines Paares von Silberelektroden aufgebracht positioniert 15 mm voneinander entfernt (iv). Ein Heizelement (V) an der Unterseite der Schale angebracht ist, verwendet, um die Kultur bei 37 ° C während der Analyse zu halten. Temperaturregelung ist dynamisch, und durch einen Thermistor im Medium (nicht gezeigt) angeordnet geregelt. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
Abbildung 3. Flussdiagramm der Logik-Software, um die Kontrolle zu Grunde liegenden. Abtastung des Lasers und Photodetektors Zwei Software schleift die Steuerung der Bewegung: eine Hauptschleife für Benutzereingaben und eine Schleife, die die Scanbewegung steuert. Setup ausgeführt wird, während in der Hauptschleife, durch die Aktivierung der zweiten Schleife für mittlere bis hohe Durchsatzdatensammlung gefolgt. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
Abbildung 4. Grafische Benutzerschnittstelle der Software verwendet werden, um Laser-und Photodetektor Positionen während Cantilever Beurteilung steuern. (A), um manuell zu steuern Laser-und Photodetektor Positionen in X und Y-Ebene. (B) Die Bedienelemente zur manuellen Einstellung der Positionen der Ecke 4 Ausleger (1, 16, 17, und 32), wodurch die Software aufextrapolieren, die Positionen der übrigen Auslegern in der Anordnung. (c) die Kontrollen so dass Anwender auswählen, welche in jeder kragt gehören zu scannen. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
Abbildung 5. Bilder von einem speziell angefertigten Ausleger Chip für die Verwendung in diesem System, und repräsentative Bilder von Zellen auf Oberflächen ähnlich gehalten. (A) Fotografie einer einzigen, speziell angefertigten Auslegerchip. Jeder Chip enthält 32 Ausleger in 2 Reihen von 16 Freischwinger 1 angeordnet ist in der linken unteren Ecke des Bildes und Ausleger 32 in der oberen rechten positioniert. Cantilever-Chips sind 15 x (B) Phasenkontrastbild von primären Ratten-Skelettmuskelzellen 15 mm 2. Auf Cantilever gewachsens. Jeder Ausleger 750 um lang, 100 um breit und 4 um dick. (C) Immuncytochemische Fleck eines primären Myotuben Ratte auf einem Ausleger gehalten. Die Zellen wurden mit einem Antikörper-Sonde für Myosin Heavy Chain gefärbt. Beachten Sie die quergestreifte Aussehen des kultivierten Faser, was die Reifung des Kontraktions Maschinen. Freischwinger Kanten wurden künstlich in diesem Bild um eine Anzeige der Skala bieten hervorgehoben. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
Abbildung 6. Schematische Darstellung der in Stoney-Gleichungen für die Ableitung von Kraft Myotuben auf Ausleger produziert verwendeten Begriffe. Δ = Cantileverspitze Ablenkung und Stress durch die Myotuben, C hergestelltDetektor = die systemspezifischen Koeffizienten bezüglich Spannung an Laser Position auf dem Fotodetektor, θ = der Winkel der Laser und der Detektor relativ zu der Ebene des Auslegers, E Si = die Elastizitätsmoduls von Silizium, t Si = die Dicken der Ausleger, t f = Myotube Dicke, v Si = Verhältnis von Silizium Giftes, L = Auslegerlänge und P = Weglänge des Lasers von Cantileverspitze zum Detektor. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
Abbildung 7. Repräsentative Rohdaten und Analyse der Kontraktionsform, die die beschriebenen Freischwinger-System. (A) Beispiel einer Rohdaten Spur aus dem breiten Feld-elektrische Stimulation von primären Ratten-Myotuben auf Auslegern. Obere Spur = Laser Ablenkung (in Volt) in der x-Achse anzeigt Längsbelastung des Auslegers. Mittlere Spur = Laser Auslenkung (in Volt) in der y-Achse, was Torsionsspannung über der Ausleger. Untere Kurve = Anzeige der zeitlichen Lage von elektrischen Impulsen zur Kontraktion Myotube in diesem System zu entlocken. (B) Unter Verwendung von Standard-Elektrophysiologie-Software, ist es möglich, Spitzenkraft (PF) zu messen, die Zeit bis Kraft (TTP) und Zeit, um Halbwerts Entspannung (2.1 RT) aus den gesammelten Rohdaten. (C) Sortiert Kontraktion Daten (n = 11) von der Grundschule Rattenskelettmuskel Myotuben. Anwendung der Gleichung eine modifizierte Stoney ermöglicht die Berechnung des Auslegers Stress aus Rohdaten Messwerte in Volt. Aus diesen Daten kann eine direkte Berechnung der Kraft (in Newton) generiert werden. Veröffentlichten Daten nachgedruckt wit Genehmigung 13. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
Abbildung 8. Repräsentative Daten demonstrieren Analyse von Skelettmuskelermüdung in freitragender Kulturen. Rohdaten (in Volt) wurde einer Messung der Myotuben Kraft (in Nanonewton) und erneut aufgetragen umgewandelt. Daten veranschaulichen Größe des Myotube Kontraktionen auf Auslegern in Reaktion auf 1 Hz breiten Bereich elektrische Impulse nach 0 min (schwarze Kurve) und 120 min (graue Kurve) der kontinuierlichen Stimulation. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
Abbildung 9. Repräsentative Spuren von der Analyse eines Skelettmuskels Motoneuron-Co-Kultur auf Auslegern gehalten und zeigt die funktionellen Auswirkungen der Motoneuronenstimulation mit und ohne Zusatz eines neuromuskulärer Blocker. Rohdaten (in Volt) wurde einer Messung der Myotuben umgewandelt Kraft (in Nanonewton) und wieder aufgetragen. (A) Messung der spontanen Kontraktionen durch die kultivierten Myotuben ohne neuronale Stimulation. (B) Messung der Kontraktions Myotuben folgenden neuronalen Stimulation über die Zugabe von 200 uM Glutamat. (C) Messung der Myotube Kontraktion folgenden Glutamat und 12,5 um D-Tubocurarin Behandlung. Veröffentlichten Daten mit Genehmigung 16 abgedruckt. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
Die folgenden Tabellen zeigen die spezifischen Reagenzien zur Kultivierung von Zellen in den beschriebenen Validierungsexperimente verwendet, sowie die notwendige Ausrüstung, um den Ausleger Bewertung durchzuführen. Bitte beachten Sie, dass die Kultur verwendeten Reagenzien sind nicht notwendig, und dieses System leicht mit den Kulturprotokolle von jedem Labor Aufrechterhaltung kontraktilen Zellen in vitro zu integrieren. Die aufgeführten Reagenzien vorgesehen ist Forscher möchte die beschriebenen spezifischen experimentellen Ergebnisse zu wiederholen.
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Discussion
Die kritischen Schritte bei der Analyse von Mikrobiegebalken zum Nachweis der zellulären Kontraktion sind die Anordnung der Auslegerchip innerhalb des Mikroskoptisch, und die nachfolgende Ausrichtung des Lasers und Photodetektors mit der Spitze der Ecke Auskragungen in der Anordnung. Wenn dies nicht genau durchgeführt, dann wird die Software nicht in der Lage, die Positionen der übrigen Cantilever in der Anordnung zu extrapolieren, bei der Datensammlung potentiell zu einer Akkumulation von falschen Negativen führen. Die Betreiber sollten darauf achten, dass der Cantilever-Chip ist bündig mit dem Boden der Kulturschale vor dem Kalibrieren des Laser Positionen. Wenn der Chip sitzt in einem Winkel in der Schale, wird die Bahn des abgelenkten Laserstrahls zu verändern und zu verwirren Datenerfassung.
Eine funktionale Klimatabelle muss eingesetzt werden, um während der Datensammlung aufheben Hintergrund Vibrationen. Die geringe Dicke (ungefähr 4 um) der Ausleger in dieser Studie verwendet provides hohe Empfindlichkeit für kontraktile Aktivität, hat jedoch den Nebeneffekt einer erhöhten Empfindlichkeit gegenüber Schwingungen. Betreiber sollten darauf achten, um die Hardware so wenig wie möglich zu bewegen, während Daten aufgezeichnet, um Hintergrundwerte zu reduzieren. Schließlich, wenn Sie den Cantilever-Chip in der Bühne, kümmern sich um den Chip zu gewährleisten, nicht in Kontakt mit den anregenden Silberelektroden in der Kultur gut kommen. Anwendung der Breitfeldstimulation mit der Elektrode berührt der Chip den Strompfad zu verändern und sich negativ auf die Fähigkeit des Systems effektiv stimulieren die Zellkulturen beeinflussen.
Um genauere Messwerte der Kraftabgabe in der Skelettmuskulatur Myotuben zu erhalten, ist es sehr empfehlenswert, um die Immunfärbung der kultivierten Zellen einmal Funktionsanalyse abgeschlossen ist durchzuführen. Die aufgeführten Gleichungen erfordern Eingang eines Myotube Querschnittsfläche (CSA), um Kraft zu berechnen. Während einer angenommenen Wert kann auf Basis von p verwendet werdenrevious Daten, Mess von einer Myotube genaue CSA mittels konfokaler bildgebenden Verfahren wird eine genauere Schätzung des durch den Auftraggeber Myotube ausgeübte Kraft zu schaffen. Bezug rohen Kontraktion Daten zu den physikalischen Eigenschaften der betreffenden Zelle ist wertvoll bei der Normalisierung Ergebnisse über mehrere Ausleger und zwischen den experimentellen Bedingungen 15, und daher entscheidend für die Erzeugung genaue Vorhersagen der gesamten Gewebereaktionen auf Arzneimittelbehandlung oder Krankheit. Stoney Gleichungen annehmen, die untersucht Myotuben überspannen die gesamte Länge des Auslegers so dynamisch sollten nur Daten von Zellen, die mit dieser Annahme entsprechen, erhalten werden. Wenn dies nicht möglich ist, kann Finite-Elemente-Analyse verwendet werden, um eine genaue Messung der Kraft von kleiner Myotuben bereitzustellen, wie zuvor 15 veröffentlicht. Dieses Analyseverfahren ist wesentlich arbeitsintensiv und damit zu einer höheren Durchsatzanwendungen schlecht geeignet, kann aber erforderlich sein, wenn optimiertZellkulturen gemäß den Annahmen Stoney kann nicht erhalten werden.
Wie bereits erwähnt, kann die Kultur Parameter von der Standarddeck Zubereitungen überführt werden. Allerdings ist es ratsam, zu berücksichtigen, unter Verwendung von Serum-freien Medien Zusammensetzungen und nicht-biologische Substrate zur Verwendung des Systems in Arzneimittel-Screening-Anwendungen. Aufgrund der undefinierten Natur tierischen Seren, kann die Wirkung neuer Therapeutika durch die Aufnahme dieser Zusatzstoffe in dem Kulturmedium verwechselt werden. Serum-freien Medien-Formulierungen sind sowohl für Nager und menschliche Skelettmuskelkulturen 18-21 und eine besser gesteuerte, gut definierten Umgebung zum Ausführen Verbindung Beurteilung. Auch der Einsatz von biologischen Beschichtungen (Kollagen, Laminin, etc.) auf Auslegern führt Variabilität in den Zellpräparaten, die durch Anwendung von nicht-biologischen Substraten vermieden werden. Die Abscheidung von Silan selbstorganisierte Monoschichten auf Kulturflächen haben gezeigt exintensiv zu unterstützen, die Haftung und die Entwicklung von mehreren Zelltypen 16,18,20,22-31 und stellen die Mittel zur vollen definierten Flächen in einer zuverlässigen und wiederholbaren Art und Weise zu erzeugen.
Aufgrund der Reihe von kontraktilen Zellen in Säugetiersystemen vorhanden ist, ist die Anwendung dieses Modells für die in vitro-Assays relativ breit. Obwohl die Verwendung von Skelettmuskelzellen optimiert, ist das System möglicherweise für Muskelzellen und Kardiomyozyten glatt als gut, die Bereitstellung der Mittel, um die schnelle Beurteilung der Dosis Reaktionen auf das neue Arzneimittel in diesen Zellen in Echtzeit durchzuführen. Strom Cantilever-Chips bestehen aus einer Anordnung von Auslegern 32 (5A), können aber leicht geändert werden, um viele andere einschließen. Analyse solcher Arrays erzeugt eine erhebliche Anzahl von Datenpunkten aus einer einzigen Kultur, wodurch die statistische Aussagekraft der beobachteten Unterschiede stark erhöht. Wie in 8, kultiviert belegtin diesem System unterzogen Ermüdung im Laufe der Zeit als Reaktion auf kontinuierliche Breitfeldstimulation, das eine Bewertung der Wirkung von Medikamenten auf die Ausdauer Ebenen von Zellen in vitro. Zugabe von motorischen Neuronen innervieren dieses Kulturmodell ermöglicht auch Beurteilung der Synapsenbildung durch Messung der Muskel Kontraktion in Reaktion auf neuronale Stimulanzien (Abbildung 9). Während die Messung der Basislinie Funktionsparameter in einer Mehrfachanalyse (Figur 7) hat offensichtliche Vorteile gegenüber herkömmlichen molekularbiologischen Beurteilung der in vitro-Kulturen, die Fähigkeit, die neuromuskuläre Funktion und die Lebensdauer Kapazität ausgesäten Zellen beurteilen stark die Anwendbarkeit des Modells für Wirkstoff-Screening erhöht und Krankheit Modellierungsanwendungen. Die beschriebene Technik bietet Forschern die Mittel, um eine schnelle, kostengünstige funktionale Bewertung sowohl gesunden und kranken Muskelzellen in vitro durchzuführen. Die Vielseitigkeit des Kultursystems und der hoch Ebene der funktionellen Detail erhältlich aus der Analyse der Rohdaten, sollten genauere Vorhersagen der in vivo-Gewebereaktionen auf neue pathologische und chemische Herausforderungen zu produzieren.
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Acknowledgments
Diese Forschung wurde von National Institute of Health Zuschuss Zahlen R01NS050452 und R01EB009429 finanziert. Herstellung der Cantilever-Chips wurde von außen durch Mitarbeiter an der Nanofabrication Einrichtung an der Cornell University durchgeführt. Alle Geräte in der freitragenden Herstellungsprozess verwendet wurde in dieser Anlage entfernt. Besonderen Dank an Mandy Esch und Jean-Matthieu Prot für die Unterstützung bei freitragenden Mikrofabrikation. Video-Animation des Auslegers Funktionalität wurde von Charles Hughes, Alex und Eric Zelenin Imperiale aus dem synthetischen Reality Lab an der UCF erzeugt.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Primary rat muscle growth medium | |||
| Neurobasal medium | Life Technologies | 21103-049 | |
| B27 (50x) | Life Technologies | 17504044 | 1x |
| Glutamax (100x) | Life Technologies | 35050061 | 1x |
| G5 supplement | Life Technologies | 17503-012 | 1x |
| Glial-Derived Neurotrophic Factor | Cell sciences | CRG400B | 20 ng/ml |
| Brain-Derived Neurotrophic Factor | Cell sciences | CRB600B | 20 ng/ml |
| Ciliary Neurotrophic Factor | Cell sciences | CRC400A | 40 ng/ml |
| Neurotrophin-3 | Cell sciences | CRN500B | 20 ng/ml |
| Neurotrophin-4 | Cell sciences | CRN501B | 20 ng/ml |
| Acidic Fibroblast Growth Factor | Life Technologies | 13241-013 | 25 ng/ml |
| Cardiotrophin-1 | Cell sciences | CRC700B | 20 ng/ml |
| Heparin Sulphate | Sigma | D9809 | 100 ng/ml |
| Leukemia Inhibitory Factor | Sigma | L5158 | 20 ng/ml |
| Vitronectin | Sigma | V0132 | 100 ng/ml |
| Primary rat muscle differentiation medium | |||
| NB Activ 4 | Brain Bits LLC | NB4-500 | |
| Equipment | |||
| Class 2 red diode laser | Newport | ||
| Photo-detector | Noah Industries | ||
| Model 2100 Pulse stimulator | A-M systems | ||
| Multiclamp 700B Digitizer | Axon Instruments | ||
| Patch clamp microscope and stage | Olympus | ||
| Delta T4 culture dish controller | Bioptechs | ||
| Axoscope software | Molecular Devices | ||
| LabVIEW software | National Instruments | ||
| 37 oC, 5% CO2 incubator | NAPCO | ||
| Class 2 microbiological flow hood | Labconco | ||
| Pipettes and tips | Eppendorf |
References
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