Summary
يصف هذا البروتوكول استخدام الكابولي السيليكون الميكروسكيل والأسطح الثقافة طيعة لقياس انقباض خلايا العضلات في المختبر. انكماش الخلوي يسبب الانحناء ناتئ، والتي يمكن قياسها، وسجلت، وتحويلها إلى قراءات للقوة، وتوفير نظام غير الغازية وقابلة للقياس وظيفة مقلص في المختبر.
Abstract
ويعتمد تطوير في المختبر فحوصات أكثر التنبؤية ذات الصلة وبيولوجيا على النهوض أنظمة زراعة الخلايا تنوعا التي تسهل عملية التقييم الوظيفي للخلايا المصنفة. تحقيقا لهذه الغاية، والتكنولوجيا ناتئ الميكروسكيل تقدم منصة التي لقياس وظيفة مقلص من مجموعة من أنواع الخلايا، بما في ذلك الهيكل العظمي والقلب، وخلايا العضلات الملساء، من خلال تقييم الانكماش الناجم الركيزة الانحناء. تطبيق صفائف ناتئ المضاعفة يوفر وسيلة لتطوير بروتوكولات معتدلة إلى عالية الإنتاجية لتقييم نجاعة الأدوية وسمية، النمط الظاهري المرض والتقدم، وكذلك العصبية والعضلية وغيرها من خلية خلية التفاعلات. توفر هذه المخطوطة التفاصيل لافتعال صفائف ناتئ موثوقة لهذا الغرض، والأساليب المطلوبة لخلايا بنجاح الثقافة على هذه السطوح. ويرد وصف إضافي بشأن الخطوات اللازمة لأداء وظيفي الشرجysis من أنواع الخلايا مقلص الحفاظ على مثل هذه المصفوفات باستخدام الليزر الرواية ونظام الصور كاشف. البيانات المقدمة تمثيلية يسلط الضوء على الدقة وطبيعة استنساخه من تحليل وظيفة مقلص ممكنة باستخدام هذا النظام، فضلا عن مجموعة واسعة من الدراسات التي يمكن تطبيق هذه التكنولوجيا. اعتماد واسع النطاق الناجح لهذا النظام يمكن أن توفر المحققين مع وسائل لأداء والدراسات الوظيفية السريعة منخفضة التكلفة في المختبر، مما يؤدي إلى توقعات أكثر دقة لأداء الأنسجة، تطور المرض والاستجابة للعلاج علاجية جديدة.
Protocol
1. الكابولي تصنيع رقاقة
وقدمت تفاصيل مصورة من الخطوات تلفيق مبين في الشكل 1.
- وضع السيليكون على العازل (SOI) الرقائق في الفرن وتخبز على 125 درجة مئوية لمدة 20 دقيقة إلى يذوى منهم.
- إيداع 1.5 ميكرون طبقة سميكة من أكسيد السليكون على طبقة مقبض رقاقة SOI المجففة باستخدام البلازما تعزيز ترسيب الأبخرة الكيميائية (PECVD) الأداة.
- وضع رقاقة على تشوك تدور المغطي مع طبقة جهاز مواجهة. ضمان يتركز رقاقة، الاستغناء 2 مل من P20 التمهيدي في وسط الرقاقة، وتدور بسرعة 3000 دورة في الدقيقة لمدة 60 ثانية في تسارع من 1،000 دورة في الدقيقة / ثانية. P20 التمهيدي يعزز التصاق مقاوم الضوء على طبقة الجهاز.
- بينما الرقاقة لا يزال على تدور المغطي تشاك، الاستغناء 2 مل من S1818 مقاوم الضوء في وسط الرقاقة، وتدور بسرعة 3000 دورة في الدقيقة لمدة 60 ثانية في تسارع من 1،000 دورة في الدقيقة / ثانية إلى سbtain 1.5 ميكرون طبقة سميكة من مقاوم الضوء.
- وضع رقاقة على طبق ساخن وإجراء خبز لينة في 115 درجة مئوية لمدة 1 دقيقة.
- إجراء الصعب التعرض للأشعة فوق البنفسجية الاتصال باستخدام ضوئيه اتصال قناع اليجنر من أجل نقل نمط من قناع ناتئ إلى مقاوم الضوء على طبقة الجهاز. حساب زمن التعرض على أساس قيمة الطاقة تعرض 125 ميغا جول / سم 2 لS1818 مقاومة للضوء.
- تطوير مقاومة للضوء عن طريق غمر الرقاقة في 726 MIF مقاومة للضوء المطور لمدة 1 دقيقة في حين تهز بلطف الرقاقة ذهابا وإيابا.
- شطف الرقاقة مع دي المتأينة (DI) المياه وجففه، ويفضل استخدام أداة مجفف تدور شطف (SRD).
- إزالة مقاوم الضوء من حافة الرقاقة (حتى 5 مم من الحافة) باستخدام قطعة من القطن مغموسة في الأسيتون.
- تحميل الرقاقة في أعماق رد الفعل ايون إحفر (DRIE) أداة، مع الجانب مقاوم الضوء مواجها لها، وتشغيل وصفة لحفر طبقة السيليكون نمط من خلال ديفيطبقة م. وظائف طبقة أكسيد دفن كما توقف حفر، بحيث تؤدي إلى حفر مع 50٪ إلى 100٪ أكثر من دورات ومن المتوقع أن تكون ضرورية لضمان حفر كاملة.
- وضع رقاقة في حل حمام مقاوم الضوء الساخن لمدة 20 دقيقة لتجريد مقاومة للضوء. نقل الرقاقة إلى السريع تفريغ الشطاف (QDR) لشطف الرقاقة بالماء DI. بعد الشريط ضوء، تحميل الرقاقة في أداة SRD لشطف وتجفيف رقاقة. تفقد الرقاقة تحت المجهر لضمان ظهور نمط ناتئ كما هو متوقع.
- إيداع 1 ميكرون طبقة سميكة من أكسيد السيليكون مخدر الامم المتحدة على طبقة من جهاز الرقاقة باستخدام أداة PECVD. وظائف هذه الطبقة أكسيد كطبقة واقية للالكابولي خلال مزيد من خطوات المعالجة.
- وضع رقاقة على تشوك تدور المغطي مع طبقة مقبض مواجهة لبدء معالجة الجانب الخلفي من الرقاقة. ويتركز ضمان يفر، الاستغناء 2 مل من P20 التمهيدي في وسط الرقاقة، وتدور بسرعة 3،000 دورة في الدقيقةلمدة 60 ثانية في تسارع من 1،000 دورة في الدقيقة / ثانية.
- بينما الرقاقة لا يزال على تدور المغطي تشاك، الاستغناء 2 مل من SPR220-4.5 مقاوم الضوء على مركز الرقاقة، وتدور بسرعة 2000 دورة في الدقيقة لمدة 45 ثانية في تسارع من 1،000 دورة في الدقيقة / ثانية للحصول على 6.5 ميكرون طبقة سميكة من مقاومة للضوء.
- وضع رقاقة على لوحة القرب الساخنة لإجراء خبز لينة في 115 درجة مئوية لمدة 2 دقيقة.
- باستخدام اتصال اليجنر ضوئيه قادرة على الجبهة / محاذاة إلى الوراء، محاذاة قناع نافذة المؤخر إلى الجانب الأمامي نمط ناتئ وإجراء اتصال الصعب التعرض للأشعة فوق البنفسجية من أجل نقل نمط من قناع نافذة المؤخر لمقاوم الضوء على طبقة المقبض. استخدام وقت التعرض محسوبة على أساس قيمة الطاقة تعرض 480 ميغا جول / سم 2 لSPR220-4.5 مقاومة للضوء.
- بعد التعرض للأشعة فوق البنفسجية، دعونا لا تزال رقائق في منطقة مظلمة لمدة 30 دقيقة قبل الخطوة تجهيز المقبلة.
- تطوير مقاومة للضوء عن طريق غمر الرقاقة فيمطور 726 MIF مقاومة للضوء لمدة 2 دقيقة في حين تهز بلطف الرقاقة ذهابا وإيابا.
- شطف الرقاقة مع دي المتأينة (DI) المياه وجففه، ويفضل استخدام أداة مجفف تدور شطف (SRD).
- وضع الرقائق في الفرن على 90 درجة مئوية لمدة 12 ساعة.
- حفر طبقة أكسيد السيليكون على مساعدات من الرقاقة باستخدام نظام ري مع الغازات المفلورة وصفة لأكسيد الحفر. أكسيد نقوش على مساعدات من الرقاقة بمثابة قناع حفر لمزيد من المعالجة. تفقد رقائق تحت المجهر للتأكد من أن أكسيد السيليكون في الإطار يتعرض هو محفورا تماما.
- إزالة مقاوم الضوء على حافة الرقاقة (حتى 5 مم من الحافة) باستخدام مسحة غرفة نظيفة مغموسة في الأسيتون.
- تحميل الرقاقة في أداة DRIE مع وتشغيل وصفة لحفر طبقة نمط مقبض على عمق 500 ميكرون مع دفن عمل طبقة أكسيد كما توقف حفر. تقسيم هذا حفر في أشواط متعددة لمنع التدفئة المفرطة للويفر، الذي يسبب النقش يتعارض من السيليكون. هذه الخطوة حفر يزيل تماما السيليكون تحت الكابولي.
- إجراء خطوة الحفر الرطب باستخدام 25٪ مخفف HF منمش، لتجريد طبقة أكسيد دفن تحت الكابولي وطبقة واقية أكسيد على أعلى من الكابولي.
ملاحظة: هذه الخطوة النشرات السطح السفلي من الكابولي السيليكون ويفتح نافذة تحت لتوفير الوصول إلى سبر ناتئ مع الليزر أيضا. - شطف الرقاقة باستخدام سلسلة من حمامات المياه DI والجافة بعناية مع النيتروجين. منذ يتم دعم الكابولي فقط في قواعدهم، لا تستخدم البخاخات قوية من المياه DI أو غاز خامل مباشرة على الكابولي.
- يلتصق رقائق الفردية من الرقاقة على غرار يلتصق تنتج أثناء الخطوة مقبض طبقة حفر.
الثقافة 2. خلية
- إعداد 13F coverslips وفقا للأساليب المنشورة سابقا 17.
ملاحظة: إذا 13F كوفrslips غير متوفرة، أي سطح مسعور مع زاوية الاتصال فوق 95 درجة يمكن استخدامها. - تعقيم رقائق ناتئ و13F coverslips في محلول الإيثانول 70٪ والسماح للهواء الجاف في غطاء تدفق.
- وضع رقائق ناتئ الفردية على رأس 13F coverslips داخل القياسية 12 لوحة جيدا.
- معطف الكابولي مع البوليمر الحيوي أو تعديل سطح الأمثل لنوع من الخلايا المستخدمة وفقا لبروتوكولات الثقافة الخلية القياسية.
- إعادة تعليق الخلايا في المتوسط من نمو محددة إلى التركيز المطلوب.
ملاحظة: هذا البروتوكول ينتج عنه عدد كبير من الخلايا التي تقع من خلال النافذة ناتئ وعدم التزامها سطح ناتئ المطلوب. ولذلك ينبغي الاستعدادات خلية 3-4x أكثر تركيزا من الاستعدادات لساترة القياسية. على سبيل المثال، عادة ما يتم تنفيذ البذر الخلايا الأقمار الصناعية الفئران العضلات والهيكل العظمي من استخدام كثافة البذر من 500-700 خلية / ملم مربع 15،16، وتستخدم مع ركائز ناتئ في 2،000 خلية / ملم مربع. ينبغي إجراء تجارب الأمثل للخروج مع مصادر خلية جديدة للتأكد من كثافة البذر المناسبة. - ماصة 200 ميكرولتر من تعليق الخلية على سطح رقاقة ناتئ، وضمان فقاعة متوسطة تغطي النوافذ ناتئ تماما. إذا كان الفتائل المتوسطة من خلال النافذة ولا تشكل فقاعة ثابتة على رأس الكابولي استبدال ساترة 13F وreattempt الطلاء.
- نقل لوحة تحتوي على رقائق إلى حاضنة والسماح للخلايا الالتزام لمدة 1 ساعة على الأقل (يفضل 2-3 ساعة).
- بعد هذه الفترة والطلاء، واستخدام ملقط معقم لنقل الشريحة إلى بئر نظيفة، دون ساترة 13F، وأعلى حتى الثقافة مع 1 مل من وسط النمو.
- العودة إلى لوحة الحاضنة.
- الحفاظ على خلايا وفقا لبروتوكول بهم القياسية للصيانة في المختبر coverslips على. لخلايا عضلات الهيكل العظمي،تبديل التركيب المتوسط للحث على تشكيل myotube مرة واحدة سوف تصبح خلايا متكدسة يكون ضروريا.
3. الإعداد من الأجهزة والبرامج لتحليل الكابولي الإمالة
- وضع صحن الثقافة ساخنة في مرحلة مجهر تستقيم الكهربية.
- إضافة 3 مل من المتوسط التغذية وعلقت الخلايا حاليا في (+ 10 ملي HEPES) إلى مرحلة المجهر ساخنة.
- جبل الأقطاب الفولاذ المقاوم للصدأ من الداخل من صحن الثقافة ساخنة على مسافة فصل 15 ملم وربطها مولد النبض، قادرة على إنتاج البقول التحفيز مجال متفاوتة الشدة، والتردد، والموجي، للسماح للنظام التحفيز لإنتاج الحقل الخلايا عند الاقتضاء.
- الترباس ليزر الهليوم النيون، التي شنت على مراحل XY متعدية، على الجانب السفلي من الجدول المجهر وتعديله بحيث يتم توجيه شعاع الليزر من خلال قاعدة الطبق الثقافة ساخنة في اقاربهم 30 ° زاويةالبريد إلى الطائرة من ناتئ.
- ينشق وحدة نمطية الصور كاشف رباعي، التي شنت على مراحل XY متعدية، على الجانب السفلي للمرحلة المجهر وضبط الموقف بحيث ينعكس شعاع الليزر الأراضي في وسط ال 4 أجزاء. الشكل 2 لمحة عامة عن الأجهزة التي أنشئت اللازمة لتنفيذ بروتوكول صفها.
- كتابة برنامج برنامج للتحكم في المحركات الخطية التي تفحص عبر الكابولي. كتابة برنامج حاسوبي مع الإشارة إلى الرسم البياني الوارد في الشكل 3. يتم توفير واجهة رسومية برمجتها للاستخدام مع هذا النظام في الشكل 4.
4. تسجيل الكابولي انحراف البيانات
- تشغيل أجهزة تحليل ناتئ والبرمجيات المرتبطة بها.
- إدراج المرحلة الثرمستور ساخنة في الوسط وانتظر لقراءة 37 درجة مئوية.
- تضاف شرائح ناتئ إلى مرحلة مع cantileveRS موجهة نحو الجانب الأيمن من المسرح.
- بدوره على مصدر ضوء المجهر.
- التركيز المجهر لجعل حواف الكابولي في طريقة العرض واستخدام برنامج حاسوبي لمراقبة الليزر / الصور كاشف لوضع شعاع الليزر على طرف ناتئ 1. ملاحظة: إذا افترضنا أن الكابولي موجهة إلى يمين المسرح، ناتئ 1 هو واحد المتمركزة في أعلى يسار مجموعة وأرقام الجري إلى 16 في الجزء السفلي الأيسر. 17 ناتئ هو في المكان المناسب العلوي ويمتد إلى 32 في أسفل اليمين (الشكل 5A).
- اضغط على "اللعب" على برنامج تسجيل.
- ضع الصور كاشف بحيث يقرأ إشارة "0" في كل من س و ص إطارات من خلال تعديل المحركات السائر التحكم في الصور كاشف.
- تحديد موقف ناتئ 1 في برنامج حاسوبي لمراقبة الليزر / الصور كاشف (الشكل 4).
- نقل الليزر لطرف ناتئ 16، كرر الخطوة 4.7، ووضع cantilevإيه 16 وظيفة في برنامج حاسوبي لمراقبة الليزر / الصور كاشف.
- نقل الليزر لطرف ناتئ 32، كرر الخطوة 4.7، ووضع ناتئ 32 موقف في برنامج حاسوبي لمراقبة الليزر / الصور كاشف.
- نقل الليزر لطرف ناتئ 17، كرر الخطوة 4.7، ووضع ناتئ 17 موقف في برنامج حاسوبي لمراقبة الليزر / الصور كاشف.
- إيقاف مصدر ضوء المجهر وضوء النفقات العامة في المختبر.
- اضغط على "سجل" على برنامج تسجيل.
- تعيين الأجهزة مولد النبض إلى 40 ميللي ثانية، 5 V البقول على تردد 1 هرتز، وتحويل الجهاز على.
ملاحظة: اختياريا، وتوظيف بروتوكولات التحفيز الأمثل لمصادر معينة من الخلايا في هذه المرحلة، إعدادات المعلنة المبادئ التوجيهية استنادا إلى البيانات التي تم جمعها باستخدام مصادر بشرية وخلية القوارض 12،13،15،16. - باستخدام برنامج حاسوبي لمراقبة الليزر / الصور كاشف، تعيين الأجهزة لمسح عبر مجموعة 32 ناتئ، ووقف لمدة 5 ثانية في كل يومه.
- عند الفحص من 32 الكابولي كاملة، إيقاف المنبه، ثم وقف برنامج تسجيل وطرح ملف البيانات.
- دراسة أثر المسجلة من كل ناتئ عن أدلة على النشاط مقلص. تقديم مذكرة من كل ناتئ بردود فعل إيجابية. يتم تعريف الانكماش بمثابة الذروة إذا كان الانحراف هو 0.1 V على الأقل فوق خط الأساس.
- إزالة أي الكابولي عدم استجابة من بروتوكول المسح على برنامج حاسوبي لمراقبة الليزر / الصور كاشف.
- ويمكن بعد ذلك إعادة فحص والكابولي النشطة دون التحفيز من أجل الحصول على قراءة من النشاط العفوي مقلص الخلية.
- تشغيل المسح الضوئي مع أو بدون التحفيز الكهربائي مجال واسع، بعد إضافة مركب العلاجي إلى المتوسطة من أجل مراقبة تأثيره على الناتج الوظيفي للخلايا المستزرعة.
- إجراء تقييمات التعب من خلال تحفيز الخلايا كهربائيا لفترات طويلة ومستويات المسح الضوئي للمقاولات actility لقياس الزمن الذي يستغرقه لاستخدام القوة لإسقاط الذروة دون عتبة معينة.
- في التجارب حيث تتم المحافظة على الخلايا العصبية الحركية في ثقافة مشتركة مع العضلات، وقياس تشكيل تقاطع العصبي العضلي من خلال علاج العصبون الحركي-myotube ناتئ المشترك الثقافات مع المنشطات العصبية (مثل الصوديوم) أو مثبط متشابك (على سبيل المثال، D-توبوكورارين) والمسح الضوئي لل الزيادة والنقصان في النشاط العفوي على التوالي 16.
- القيام بمسح محددة وفقا لما تمليه احتياجات التجارب المخطط لها.
5. تحليل البيانات الكابولي الإمالة
- استخدام تعديل المعادلات ستوني في 15 (مفصلة أدناه) لتحويل البيانات ناتئ الخام انحراف (في فولت) في قراءات الضغط في طبقة الخلايا أو myotube (قراءة الضغط بمقياس الباسكال)، والقياس المباشر للقوة مقلص الخلوية (في نانو نيوتن):
إعلان / 51866 / 51866eq1.jpg "/> المعادلة 1
المعادلة 2 - حيث δ = طرف ناتئ انحراف والإجهاد التي تنتجها myotube، σ ج = الإجهاد التي تنتجها myotube، على افتراض فيلم سميكة موحد العرض الكامل للناتئ، C = كاشف معامل الخاصة بالنظام المتعلقة الجهد لوضع الليزر على الصورة -detector، θ = زاوية الليزر وكاشف نسبة إلى الطائرة من ناتئ، E سي = معامل مرونة من السيليكون، تي سي = سمك من ناتئ، ر و = سمك myotube، ضد سي = نسبة السم لل السيليكون، L = طول الكابولي، P = طول طريق الليزر من ناتئ تلميح إلى كاشف، وث
- على افتراض myotube هو فيلم موحدة، قوة في myotube تساوي القوة في الفيلم، مما يؤدي إلى المعادلة 3، عن طريق المساواة بين حساب القوة من الإجهاد ومنطقة يفترض عبر خلية المقطع الذي تم استخدامه لتطبيق في ستوني المعادلة.
المعادلة 3 - وبعد جمع البيانات وظيفية، إصلاح رقائق ناتئ لتحليل immunocytochemical أو استخدام الخلايا للبروتين أو تحليل DNA باستخدام التقنيات القياسية.
- اختياريا، والعودة إلى الخلايا الحاضنة بدلا من الاستعداد للتحليل الجزيئي من أجل إعادة تقييم الأداء الوظيفي في وقت لاحق نقطة.
المعادلة 2 Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
ثقافة ناجحة من خلايا مقلص على الكابولي هو إجراء بسيط نسبيا، وذلك باستخدام تقنيات زراعة الخلايا القياسية (الشكل 5). نسبة الكابولي دعم خلايا التعاقد سوف تختلف تبعا لنوع من الخلايا يجري بحثها وتقنية ثقافة معينة يعمل. استخدام الخلايا الجنينية الأولية المستمدة من الفئران أطرافه الخلفية، تم الكشف عن النشاط مقلص على 12٪ من الكابولي فحص (ن = 4). تحليل وظيفة مقلص باستخدام نظام الليزر والصور للكشف عن وصفها يوفر دقة البيانات في الوقت الحقيقي المتعلقة النضج الوظيفي للخلايا المصنفة. ويمكن بعد ذلك استخدام برامج الكهربية القياسية أن تستخدم لتحليل البيانات الخام، وتسهيل حساب الخصائص الفنية ذات الصلة، مثل القوة الذروة، وقت الذروة إلى القوة، والوقت لنصف الاسترخاء، كما هو موضح في الشكل 7. جمع البيانات اللاحقة من ثقافات تعامل مع المركبات العلاجية يسمح لالمقارنة بين الخصائص الفنية مع وبدون إدمان المخدرات، وبالتالي تمكين تقييم النشاط المجمع والتنبؤ لاحق من الاستجابات في الجسم الحي. وعلاوة على ذلك، توفر بروتوكولات التحفيز مدد سيلة لتقييم معدلات التعب في الخلايا المستزرعة، وبالتالي توسيع مستوى البيانات الفسيولوجية التي يمكن الحصول عليها من هذا النظام (الشكل 8).
يمكن تعديل ثقافة ناتئ لتشمل الخلايا العصبية الحركية في نظام الثقافة مع myotubes 16 الهيكل العظمي والعضلات، وذلك للسماح بتقييم تشكيل المشبك العصبي العضلي في المختبر (الشكل 9). وفي مثل هذه الثقافات، تتم مقارنة معدلات النشاط العفوي مقلص إلى معدلات انكماش في الاستجابة للعلاج مع المنشطات العصبية محددة، مثل الغلوتامات. أي الغلوتامات التي يسببها زيادة الملحوظة في معدلات انكماش تشير تفعيل الخلايا العصبية مثقف، مما يؤدي إلى إطلاق سراح أستيل وميو لاحقتفعيل أنبوب. العلاج مع مثبطات متشابك، مثل مستقبلات أستيل مانع D-توبوكورارين، مما أدى إلى وقف الغلوتامات التي يسببها النشاط توفر مزيدا من الأدلة على وجود المشابك العصبية والعضلية وظيفية في هذه الثقافات 16.
الرقم 1. تخطيطي تدفق عملية تلفيق تفاصيل ناتئ. الأرقام المذكورة في الرسم البياني لتدفق ترتبط الخطوات بروتوكول في قسم أساليب بعنوان "الكابولي رقاقة تلفيق." الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم.
الرقم 2. الأجهزةتفاصيل نظام الليزر / الصور كاشف المستخدمة لتقييم انكماش الخلوي على الكابولي. (A) صورة من المجهر الكهربية تعديل استخدامها لتقييم ناتئ. الليزر (ط) والصور كاشف (ب) هي التي شنت تحت المرحلة على مراحل XY متعدية. هي التي شنت طبق ثقافة الشفافية على المسرح (ج)، والذي يسمح بمرور الليزر إلى مجموعة ناتئ من خلال الجانب السفلي من المرحلة. (B) تخطيطي "من أعلى إلى أسفل" منظور المسرح المجهر. XY متعدية مراحل تسمح حركة الليزر والصور كاشف في كل من X و Y الطائرات (الأسهم الحمراء)، وتسهيل حركة الليزر لاستجواب كل ناتئ في صفيف. ينبغي أن توضع رقائق ناتئ (ج) في المسرح مع الكابولي تواجه نحو اليمين المرحلة من أجل نظام للعمل بشكل صحيح. (C) عن قرب صورة لليزر (ط) والصور كاشف (ب) شنت تحت المجهر المرحلة. يتم وضع الليزر على زاوية 30 درجة قريب لطائرة من رقاقة ناتئ (θ). (D) عن قرب صورة للصحن الثقافة. عريضة الحقل يتم تطبيق التحفيز الكهربائي عن طريق زوج من أقطاب الفضة وضع 15 مم وبصرف النظر (الرابع). ويستخدم عنصر التدفئة (ت) تعلق على الجانب السفلي من طبق للحفاظ على الثقافة عند 37 درجة مئوية خلال التحليل. السيطرة على درجة الحرارة الحيوية، وتنظم عن طريق وضعها في الثرمستور المتوسطة (لا يظهر). يرجى النقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم.
الرقم 3. مخطط تدفق المنطق وراء برنامج للسيطرة. مسح الليزر والصور للكشف عن اثنين من البرامج حلقات التحكم في الحركة: حلقة رئيسية لإدخال المستخدم وحلقة التي تسيطر على حركة المسح. يتم تنفيذ الإعداد بينما في الحلقة الرئيسية، تليها تفعيل حلقة الثانية للمتوسط إلى جمع البيانات الإنتاجية العالية. يرجى النقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم.
الرقم 4. اجهة المستخدم الرسومية من البرمجيات المستخدمة للسيطرة على المناصب الليزر والصور كاشف خلال تقييم ناتئ. (A) أزرار للتحكم يدويا مواقف الليزر والصور كاشف في كل من X و Y طائرات (B) ضوابط لتحديد مواقف الكابولي 4 الزاوية يدويا (1، 16، 17، و 32)، مما يسمح البرنامج لاستقراء مواقف الكابولي المتبقية في مجموعة (C) ضوابط تتيح للمستخدمين اختيار أي الكابولي أن تدرج في كل فحص. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم.
الرقم 5. صور من عرف بني ناتئ رقاقة لاستخدامها في هذا النظام، والصور التمثيلية للخلايا الحفاظ على السطوح مماثلة. (A) صورة لاحد، والعرف بنيت رقاقة ناتئ. كل رقاقة الكابولي يحتوي على 32 مرتبة في صفوف من 2 16. الكابولي 1 يتوضع في الجزء السفلي الأيسر من الصورة وناتئ 32 في أعلى الصفحة على اليمين. رقائق ناتئ هي 15 × 15 مم 2 (B) صورة النقيض من المرحلة الابتدائية الفئران خلايا عضلات الهيكل العظمي نمت على ناتئق. كل ناتئ هو 750 ميكرومتر طويلة، 100 ميكرون واسع و 4 ميكرون سميكة (C) وصمة عار Immunocytochemical من myotube الفئران الأساسي الحفاظ على ناتئ. تم صبغ الخلايا باستخدام مسبار الأجسام المضادة لسلسلة الميوسين الثقيلة. لاحظ ظهور مخططة من الألياف مثقف، مشيرا إلى نضوج آلية مقلص. تم حواف ناتئ أبرز مصطنع في هذه الصورة أن يقدم مؤشرا الحجم. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم.
الرقم 6. تخطيطي يوضح المصطلحات المستخدمة في المعادلات ستوني لاشتقاق القوة التي تنتجها myotubes على الكابولي. δ = طرف ناتئ انحراف والإجهاد التي تنتجها myotube، Cكاشف = معامل الخاصة بالنظام المتعلقة الجهد لوضع الليزر على الصور كاشف، θ = زاوية الليزر وكاشف نسبة إلى الطائرة من ناتئ، E سي = معامل مرونة من السيليكون، تي سي = سمك ل ناتئ، ر و = سمك myotube، ضد سي = نسبة السم من السيليكون، L = طول الكابولي، وطول P = طريق الليزر من ناتئ تلميح إلى كاشف. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم.
الرقم 7. البيانات الخام التمثيلية وتحليل شكل مقلص باستخدام نظام ناتئ وصفها. (أ) مثال على أثر البيانات الخام من التحفيز الكهربائي مجال واسع من myotubes الفئران أساسي على الكابولي. كبار أثر = انحراف الليزر (في فولت) في محور س، مشيرا بالطول الضغط على ناتئ. أثر المتوسطة = انحراف الليزر (في فولت) في المحور ص، مشيرا إلى سلالة التوائية عبر ناتئ. أثر القاع = بيان الموقف الزمني للنبضات الكهربائية المستخدمة لانتزاع myotube انكماش في هذا النظام. (B) عن طريق برنامج الكهربية القياسية، فمن الممكن لقياس قوة الذروة (PF)، والوقت ليصل إلى ذروته قوة (طالبان الباكستانية) والوقت إلى النصف الاسترخاء (1/2 RT) من البيانات الخام التي تم جمعها. (C) مقارنة البيانات انكماش (ن = 11) من الفئران الأساسي myotubes العضلات والهيكل العظمي. تطبيق المعادلة في ستوني تعديل يسمح حساب الإجهاد ناتئ من قراءات البيانات الخام في فولت. من هذه البيانات، كما يمكن إنشاء حساب مباشر للقوة (في نيوتن). البيانات المنشورة طبع ثإيث إذن 13. يرجى النقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم.
الرقم 8. البيانات التمثيلية يدل تحليل التعب العضلي العظمي في الثقافات ناتئ. تم تحويل البيانات الخام (في فولت) لقياس قوة myotube (في نانو نيوتن) وتآمر إعادة. توضح البيانات حجم تقلصات myotube على الكابولي ردا على 1 هرتز نطاق واسع مجال كهربائي البقول بعد 0 دقيقة (تتبع الأسود) و 120 دقيقة (تتبع الرمادي) من التحفيز المستمر. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم.
تم تحويل الرقم 9. آثار التمثيلية من تحليل والعضلات والهيكل العظمي العصبون الحركي شارك في ثقافة الحفاظ على الكابولي، مما يدل على الآثار الوظيفية لتحفيز العصبون الحركي مع وبدون إضافة مانع العصبية والعضلية. البيانات الخام (في فولت) إلى قياس myotube القوة (في نانو نيوتن) وإعادة تآمر. (A) قياس تقلصات عفوية من قبل myotubes مثقف دون التحفيز العصبية. (B) قياس myotube انكماش التالية تحفيز الخلايا العصبية عن طريق إضافة 200 ميكرومتر الغلوتامات. (C) قياس myotube انكماش التالية الغلوتامات و 12.5 ميكرومتر العلاج D-توبوكورارين. البيانات المنشورة أعيد طبعه بإذن 16. يرجى النقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم.
تسرد الجداول التالية الكواشف محددة تستخدم لخلايا الثقافة في تجارب التصديق وصفها، وكذلك المعدات اللازمة لإجراء تقييم ناتئ. يرجى ملاحظة أن ثقافة الكواشف المستخدمة ليست ضرورية وهذا النظام يجب أن تتكامل بسهولة مع بروتوكولات ثقافة أي مختبر الحفاظ على خلايا تقلص في المختبر، ويتم توفير الكواشف المدرجة يجب يرغب المحققون لتكرار النتائج التجريبية محددة وصفها.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
الخطوات الحاسمة في تحليل الكابولي الميكروسكيل عن أدلة على انكماش الخلوية هي وضع رقاقة ناتئ داخل المسرح المجهر، والمحاذاة لاحقة من الليزر والصور كاشف مع غيض من الكابولي الزاوية في الصفيف. إذا لم يتم ذلك بدقة، ثم لن تكون قادرة على استقراء مواقف الكابولي المتبقية في مجموعة، مما قد يؤدي إلى تراكم السلبيات كاذبة خلال جمع البيانات البرنامج. يجب على المشغلين أن تحرص على التأكد من أن شريحة ناتئ هو الكذب مطاردة مع الجزء السفلي من الطبق الثقافة قبل معايرة مواقف الليزر. إذا يجلس في زاوية رقاقة في طبق، فإنه سيتم تغيير مسار شعاع الليزر منحرف ونخلط جمع البيانات.
يجب أن توظف جدول الهواء وظيفية ليلغي الاهتزازات الخلفية أثناء جمع البيانات. سمك صغير (حوالي 4 ميكرون) من الكابولي المستخدمة في هذه الدراسة العلاقات العامةovides حساسية عالية النشاط مقلص، ولكن لديها الآثار الجانبية لزيادة الحساسية للاهتزازات. يجب على المشغلين أن تحرص على التحرك في جميع أنحاء الأجهزة بأقل قدر ممكن خلال تسجيل البيانات، للحد من القراءات الخلفية. أخيرا، عند وضع رقاقة ناتئ في المرحلة، ورعاية لضمان رقاقة لا تتلامس مع الأقطاب تحفيز الفضة في الثقافة أيضا. سيتم تطبيق التحفيز مجال واسع مع القطب لمس رقاقة يغير المسار الحالي ويؤثر سلبا على قدرة النظام على تحفيز الخلايا المستزرعة بشكل فعال.
من أجل الحصول على قراءات أكثر دقة من الناتج القوة في myotubes الهيكل العظمي والعضلات، فإنه يوصى بشدة لأداء المناعية من الخلايا المستزرعة التحليل مرة واحدة وظيفية كاملة. المعادلات المدرجة تتطلب مدخلات من منطقة لmyotube في مستعرضة (CSA) وذلك لحساب القوة. في حين أن القيمة المفترضة يمكن استخدامها على أساس عالبيانات revious، وقياس CSA المحدد لmyotube باستخدام تقنيات التصوير مبائر سيوفر تقدير أكثر دقة للقوة من جانب myotube التعاقد المبذولة. تتعلق البيانات انكماش الخام إلى الخصائص الفيزيائية للخلية في السؤال هو قيمة في النتائج تطبيع عبر الكابولي متعددة وبين الظروف التجريبية 15، وبالتالي حاسما لتوليد توقعات دقيقة بردود الأنسجة كلها إلى العلاج من تعاطي المخدرات أو المرض. تفترض المعادلات ستوني في myotubes فحص تمتد على طول ناتئ ذلك ينبغي بذل جهد لتضمين البيانات التي تم الحصول عليها من خلايا تتماشى مع هذا الافتراض فقط. إذا لم يكن ذلك ممكنا، وتحليل العناصر المحدودة يمكن استخدامها لتوفير على قياس دقيق للقوة من myotubes أصغر كما نشرت سابقا 15. هذا المنهج التحليلي هو أكثر بكثير كثيفة العمالة، وبالتالي غير مناسبة للتطبيقات إنتاجية أعلى، ولكن قد يكون ضروريا إذا الأمثللا يمكن الحصول على مزارع الخلايا مطابقة للافتراضات في ستوني.
كما سبق ذكره، يمكن نقل المعلمات الثقافة من الاستعدادات ساترة القياسية. ومع ذلك، ينصح أن تنظر في استخدام وسائل الاعلام تركيبة خالية من المصل وركائز غير البيولوجية لاستخدام هذا النظام في التطبيقات فحص المخدرات. نظرا للطبيعة غير محددة الأمصال الحيوانية، وتأثير علاجات جديدة يمكن مرتبك من قبل إدراج هذه الإضافات في مستنبت. متاحة لكل من القوارض والثقافات العضلات والهيكل العظمي الإنسان 18-21 وتوفير بيئة أكثر سيطرة واضحة المعالم لإجراء تقييم مجمع التركيبات وسائل الإعلام الحرة المصل. وبالمثل، فإن استخدام الطلاء البيولوجية (الكولاجين، laminin، الخ) على الكابولي يقدم التباين في الأعمال التحضيرية الخلية التي يتم تجنبها من خلال تطبيق ركائز غير البيولوجية. وقد ثبت ترسب الطبقات الوحيدة الذاتي تجميعها سيلاني على السطوح الثقافة السابقtensively لدعم الالتزام وتطوير أنواع خلايا متعددة 16،18،20،22-31، وتمثل وسيلة لتوليد السطوح المحددة بالكامل بطريقة موثوقة وقابلة للتكرار.
نظرا لنطاق الخلايا مقلص موجودة في أنظمة الثدييات، وتطبيق هذا النموذج لفحوصات في المختبر واسع نسبيا. على الرغم الأمثل باستخدام خلايا عضلات الهيكل العظمي، فإن هذا النظام ينطبق المحتمل لتسهيل خلايا العضلات والعضلية كذلك، وتوفير الوسائل اللازمة لإجراء تقييم سريع للردود الجرعة إلى علاجات جديدة في هذه الخلايا في الوقت الحقيقي. تتكون رقائق ناتئ الحالية للمجموعة من 32 الكابولي (الشكل 5A)، ولكن يمكن تعديلها بسهولة لتشمل أكثر من ذلك بكثير. تحليل هذه المصفوفات تنتج عددا كبيرا من نقاط البيانات من ثقافة واحدة، وبالتالي زيادة كبيرة في القدرة الإحصائية من أي خلافات لوحظ. كما يتضح في الشكل 8، الخلايا المستزرعةفي هذا النظام يخضع التعب مع مرور الوقت، ردا على التحفيز المستمر مجال واسع، مما يسمح بتقييم آثار المخدرات على مستويات التحمل من الخلايا في المختبر. إضافة الخلايا العصبية الحركية التعصيب لهذا النموذج الثقافة كما يسمح بتقييم تشكيل المشبك من خلال قياس العضلات انكماش ردا على المنبهات العصبية (الشكل 9). في حين أن قياس المعلمات وظيفية أساسية في مقايسة المضاعفة (الشكل 7) لديه مزايا واضحة على تقييم الجزيئية البيولوجية القياسية الثقافات في المختبر، والقدرة على تقييم الأداء الوظيفي العصبي العضلي والقدرة على التحمل من خلايا المصنف يزيد كثيرا من تطبيق هذا النموذج لفحص المخدرات وتطبيقات النمذجة المرض. تقنية الموضحة تقدم المحققين الوسائل لأداء وتكلفة منخفضة التقييم الوظيفي السريع في كل من خلايا العضلات السليمة والمريضة في المختبر. براعة النظام الثقافة، وحمستوى IGH من التفاصيل الفنية التي يمكن الحصول عليها من تحليل البيانات الأولية، يجب أن تنتج تنبؤات أكثر دقة من الأنسجة في الجسم الحي الاستجابات للتحديات المرضية والكيميائية الجديدة.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Acknowledgments
وقد تم تمويل هذا البحث من قبل المعهد الوطني للصحة الأرقام منحة R01NS050452 وR01EB009429. تم إجراء تصنيع رقائق ناتئ خارجيا من قبل المتعاونين في مرفق NanoFabrication يقع في جامعة كورنيل. وتقع جميع المعدات المستخدمة في عملية تصنيع ناتئ في هذا المرفق. شكر خاص لماندي إيش وجان ماتيو بروت لمساعدتهم مع ناتئ الصغيرة تلفيق. تم إنشاء الرسوم المتحركة الفيديو وظائف ناتئ من قبل تشارلز هيوز، أليكس Zelenin واريك إمبريل من مختبر الواقع الاصطناعية في UCF.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Primary rat muscle growth medium | |||
| Neurobasal medium | Life Technologies | 21103-049 | |
| B27 (50x) | Life Technologies | 17504044 | 1x |
| Glutamax (100x) | Life Technologies | 35050061 | 1x |
| G5 supplement | Life Technologies | 17503-012 | 1x |
| Glial-Derived Neurotrophic Factor | Cell sciences | CRG400B | 20 ng/ml |
| Brain-Derived Neurotrophic Factor | Cell sciences | CRB600B | 20 ng/ml |
| Ciliary Neurotrophic Factor | Cell sciences | CRC400A | 40 ng/ml |
| Neurotrophin-3 | Cell sciences | CRN500B | 20 ng/ml |
| Neurotrophin-4 | Cell sciences | CRN501B | 20 ng/ml |
| Acidic Fibroblast Growth Factor | Life Technologies | 13241-013 | 25 ng/ml |
| Cardiotrophin-1 | Cell sciences | CRC700B | 20 ng/ml |
| Heparin Sulphate | Sigma | D9809 | 100 ng/ml |
| Leukemia Inhibitory Factor | Sigma | L5158 | 20 ng/ml |
| Vitronectin | Sigma | V0132 | 100 ng/ml |
| Primary rat muscle differentiation medium | |||
| NB Activ 4 | Brain Bits LLC | NB4-500 | |
| Equipment | |||
| Class 2 red diode laser | Newport | ||
| Photo-detector | Noah Industries | ||
| Model 2100 Pulse stimulator | A-M systems | ||
| Multiclamp 700B Digitizer | Axon Instruments | ||
| Patch clamp microscope and stage | Olympus | ||
| Delta T4 culture dish controller | Bioptechs | ||
| Axoscope software | Molecular Devices | ||
| LabVIEW software | National Instruments | ||
| 37 oC, 5% CO2 incubator | NAPCO | ||
| Class 2 microbiological flow hood | Labconco | ||
| Pipettes and tips | Eppendorf |
References
- Bischoff, R. Enzymatic liberation of myogenic cells from adult rat muscle. Anat. Rec. 180, 645-661 (1974).
- Yasin, R., et al. A quantitative technique for growing human adult skeletal muscle in culture starting from mononucleated cells. J. Neurol. Sci. 32, 347-360 (1977).
- Dennis, R. G., Kosnik, P. E., 2nd, Excitability and isometric contractile properties of mammalian skeletal muscle constructs engineered in vitro. In Vitro Cell Dev. Biol. Anim. 36, 327-335 (2000).
- Khodabukus, A., Baar, K. Defined electrical stimulation emphasizing excitability for the development and testing of engineered skeletal muscle. Tissue Eng Part C Methods. 18, 349-357 (2012).
- Langelaan, M. L. P., et al. Advanced maturation by electrical stimulation: Differences in response between C2C12 and primary muscle progenitor cells. Journal of tissue engineering and regenerative medicine. 5, 529-539 (2011).
- Stephenson, G. M., O'Callaghan, A., Stephenson, D. G. Single-fiber study of contractile and biochemical properties of skeletal muscles in streptozotocin-induced diabetic rats. Diabetes. 43, 622-628 (1994).
- Harber, M., Trappe, S. Single muscle fiber contractile properties of young competitive distance runners. Journal of applied physiology (Bethesda, Md: 1985). 105, 629-636 (2008).
- Hvid, L. G., et al. Four days of muscle disuse impairs single fiber contractile function in young and old healthy men. Experimental gerontology. 48, 154-161 (2013).
- Edman, K. A.
- Krivickas, L. S., Walsh, R., Amato, A. A. Single muscle fiber contractile properties in adults with muscular dystrophy treated with MYO-029. Muscle Nerve. 39, 3-9 (2009).
- Sung, J. H., et al. Microfabricated mammalian organ systems and their integration into models of whole animals and humans. Lab on a chip. 13, 1201-1212 (2013).
- Wilson, K., Molnar, P., Hickman, J. J. Integration of functional myotubes with a Bio-MEMS device for non-invasive interrogation. Lab on a chip. 7, 920-922 (2007).
- Wilson, K., Das, M., Wahl, K. J., Colton, R. J., Hickman, J. Measurement of contractile stress generated by cultured rat muscle on silicon cantilevers for toxin detection and muscle performance enhancement. PLoS ONE. 5, (2010).
- Binnig, G., Quate, C. F., Gerber, C.
- Pirozzi, K. L., Long, C. J., McAleer, C. W., Smith, A. S., Hickman, J. J. Correlation of embryonic skeletal muscle myotube physical characteristics with contractile force generation on an atomic force microscope-based bio-microelectromechanical systems device. Applied physics letters. 103, 83108 (2013).
- Smith, A., Long, C., Pirozzi, K., Hickman, J. A functional system for high-content screening of neuromuscular junctions in vitro. Technology. 1, 37-48 (2013).
- Stenger, D. A., et al. Coplanar molecular assemblies of amino- and perfluorinated alkylsilanes: characterization and geometric definition of mammalian cell adhesion and growth. Journal of the American Chemical Society. 114, 8435-8442 (1992).
- Das, M., Rumsey, J. W., Bhargava, N., Stancescu, M., Hickman, J. J. A defined long-term in vitro tissue engineered model of neuromuscular junctions. Biomaterials. 31, 4880-4888 (2010).
- Rumsey, J. W., Das, M., Bhalkikar, A., Stancescu, M., Hickman, J. J. Tissue engineering the mechanosensory circuit of the stretch reflex arc: Sensory neuron innervation of intrafusal muscle fibers. Biomaterials. 31, 8218-8227 (2010).
- Das, M., Rumsey, J. W., Bhargava, N., Stancescu, M., Hickman, J. J. Skeletal muscle tissue engineering: A maturation model promoting long-term survival of myotubes, structural development of the excitation-contraction coupling apparatus and neonatal myosin heavy chain expression. Biomaterials. 30, 5392-5402 (2009).
- Das, M., et al. Developing a novel serum-free cell culture model of skeletal muscle differentiation by systematically studying the role of different growth factors in myotube formation. In Vitro Cell Dev Biol Anim. 45, 378-387 (2009).
- Stenger, D. A., Pike, C. J., Hickman, J. J., Cotman, C. W. Surface determinants of neuronal survival and growth on self-assembled monolayers in culture. Brain research. 630, 136-147 (1993).
- Hickman, J. J., et al. Rational pattern design for in vitro cellular networks using surface photochemistry. Journal of Vacuum Scienc., & Technology A: Vacuum, Surfaces, and Films. 12, 607-616 (1994).
- Das, M., Molnar, P., Devaraj, H., Poeta, M., Hickman, J. J. Electrophysiological and morphological characterization of rat embryonic motor neurons in a defined system. Biotechnology progress. 19, 1756-1761 (2003).
- Rumsey, J. W., et al. Node of Ranvier formation on motor neurons in vitro. Biomaterials. 30, 3567-3572 (2009).
- Murugan, R., Molnar, P., Rao, K. P., Hickman, J. J. Biomaterial Surface patterning of self assembled monolayers for controlling neuronal cell behavior. International journal of biomedical engineering and technology. 2, 104-134 (2009).
- Guo, X., Johe, K., Molnar, P., Davis, H., Hickman, J. Characterization of a human fetal spinal cord stem cell line, NSI-566RSC, and its induction to functional motoneurons. Journal of Tissue Engineering and Regenerative Medicine. 4, 181-193 (2010).
- Varghese, K., et al. A new target for amyloid beta toxicity validated by standard and high-throughput electrophysiology. PLoS ONE. 5, e8643 (2010).
- Natarajan, A., et al. Patterned cardiomyocytes on microelectrode arrays as a functional, high information content drug screening platform. Biomaterials. 32, 4267-4274 (2011).
- Davis, H., et al. Rat Cortical Oligodendrocyte-Embryonic Motoneuron Co-Culture: An Axon-Oligodendrocyte Interaction Model. Journal of biomaterials and tissue. 2, 206-214 (2012).
- Natarajan, A., DeMarse, T., Molnar, P., Hickman, J. Engineered In Vitro Feed-Forward Networks. J Biotechnol Biomater. 3, 2 (2013).
