Summary
פרוטוקול זה מתאר את השימוש בזיזי סיליקון microscale כמשטחי תרבות גמישים למדידת ההתכווצות של תאי שריר במבחנה. התכווצות סלולרית גורמת לכיפוף שלוחה, הניתן למדידה, נרשם, והוסב לקריאות כוח, מתן מערכת לא פולשנית וניתן להרחבה למדידת תפקוד התכווצות במבחנה.
Abstract
הפיתוח של מבחני חוץ גופייה יותר חזוי ורלוונטיים מבחינה ביולוגית מתבסס על קידום מערכות תרבית תאים צדדי המאפשרות הערכה התפקודית של תאי זרע. לשם כך, טכנולוגית שלוחה microscale מציעה פלטפורמה שבה למדוד את הפונקציונליות ההתכווצות של מגוון רחב של סוגי תאים, כוללים שלד, לב, ותאי שריר חלק, דרך הערכת מצע התכווצות מושרה כיפוף. יישום של מערכי שלוחה ריבוב מספק את האמצעים לפיתוח מתון לפרוטוקולי תפוקה גבוהה להערכת יעילות תרופה ורעילות, פנוטיפ מחלה והתקדמות, כמו גם יחסי גומלין תוקפת ותאי תאים אחרים. כתב יד זה מספק פרטים עבור בודה מערכי שלוחה אמינות למטרה זו, ושיטות הנדרשות להצלחת תאי תרבות על משטחים אלה. תיאור נוסף מסופק על הצעדים דרושים כדי לבצע אנאלי פונקציונלייסיס של סוגי תאי התכווצות שמר על מערכים כאלה באמצעות מערכת פוטו וגלאי לייזר ורומן. נתוני הנציג סיפקו רגעי שיא הדיוק והטבע לשחזור של הניתוח של פונקצית התכווצות אפשרית באמצעות מערכת זו, כמו גם מגוון הרחב של מחקרים שלטכנולוגיה כזו יכולה להיות מיושמת. אימוץ נרחב מוצלח של מערכת זו יכול לספק לחוקרים את האמצעים לבצע מחקרים תפקודיים מהירים, עלות נמוכה במבחנה, שמוביל לתחזיות מדויקות יותר של ביצועי רקמות, התפתחות מחלה ותגובה לטיפול טיפולי חדשני.
Protocol
ייצור .1 צ'יפ קונסוליים
פרטים בתמונות של שלבי הייצור המתוארים ניתנים באיור 1.
- הנח הסיליקון על מבודד (SOI) הוופלים בתנור ואופה ב125 ° C עבור 20 דקות לייבש אותם.
- להפקיד 1.5 מיקרומטר שכבה עבה של תחמוצת סיליקון על גבי שכבת הידית של רקיק SOI מיובש באמצעות פלזמה משופרת כימי החמקן הפקדת כלי (PECVD).
- מניחים את פרוסות על צ'אק coater הספין עם שכבת המכשיר פונה כלפי מעלה. ודא רקיק מרוכז, לוותר 2 מ"ל של פריימר P20 במרכז של פרוסות סיליקון, והספין ב3,000 סל"ד 60 שניות בהאצה של 1,000 סל"ד / sec. פריימר P20 מקדם את ההידבקות של photoresist לשכבת המכשיר.
- בעוד ופל עדיין על צ'אק coater הספין, לוותר 2 מ"ל של photoresist S1818 על המרכז של פרוסות סיליקון, וספין ב3,000 סל"ד 60 שניות בהאצה של 1,000 סל"ד / sec לobtain 1.5 מיקרומטר שכבה עבה של photoresist.
- מניחים את פרוסות על פלטה חשמלית ולבצע לאפות רך ב115 מעלות צלזיוס במשך דקות 1.
- לבצע חשיפה לקרינת UV המגע קשה באמצעות aligner מסכת קשר photolithography כדי להעביר את התבנית ממסכת שלוחה לphotoresist על שכבת המכשיר. לחשב את זמן חשיפה המבוסס על ערך אנרגיית חשיפה של 125 mJ / 2 סנטימטר לphotoresist S1818.
- לפתח את photoresist ידי טבילת הרקיק במפתח photoresist MIF 726 ל1 דקות בזמן שרעד בעדינות הרקיק הלוך ושוב.
- יש לשטוף את הרקיק עם מים מיוננים דה (DI) ולייבש אותו, רצוי בעזרת כלי מייבש שטיפת ספין (SRD).
- הסר את photoresist מהקצה של פרוסות סיליקון (עד 5 מ"מ מהקצה) באמצעות מקלון צמר גפן טבול באצטון.
- טען את הרקיק בכלי עמוק הריאקטיבי יון Etch (DRIE), עם צד photoresist פונה כלפי מעלה, ולהפעיל מתכון כדי לחרוט את שכבת סיליקון בדוגמת דרך דווישכבת ce. פונקציות שכבת תחמוצת נקברו כתחנה לחרוט, כך לבצע לחרוט עם 50% ל100% יותר מחזורים מאשר צפויה להיות נחוץ כדי להבטיח לחרוט מלא.
- מניחים את פרוסות בפתרון אמבטיה photoresist חם עבור 20 דקות להפשיט photoresist. העבר את פרוסות ל- dump-rinser מהיר (QDR) כדי לשטוף את הרקיק עם מים די. בעקבות רצועת photoresist, לטעון את הרקיק בכלי SRD לשטוף ולייבש את פרוסות סיליקון. בדוק את הרקיק תחת מיקרוסקופ כדי להבטיח את דפוס שלוחה מופיע כצפוי.
- להפקיד שכבה עבה 1 מיקרומטר תחמוצת סיליקון מסומם האו"ם על שכבת המכשיר של פרוסות סיליקון באמצעות כלי PECVD. פונקציות שכבת תחמוצת זו כשכבת הגנה לזיזים בשלבי עיבוד נוספים.
- מניחים את פרוסות על צ'אק coater הספין עם שכבת הידית כלפי מעלה כדי להתחיל עיבוד של הצד האחורי של פרוסות סיליקון. ודא רקיק מרוכז, לוותר 2 מ"ל של פריימר P20 במרכז של פרוסות סיליקון, וספין ב3,000 סל"דל60 שניות בהאצה של 1,000 סל"ד / sec.
- בעוד ופל עדיין על צ'אק coater הספין, לוותר 2 מ"ל של photoresist SPR220-4.5 על המרכז של פרוסות סיליקון, והספין ב2,000 סל"ד 45 שניות בהאצה של 1,000 סל"ד / sec להשיג 6.5 מיקרומטר שכבה עבה של photoresist.
- מניחים את פרוסות על צלחת חמה קרבה לבצע לאפות רך ב115 מעלות צלזיוס למשך 2 דקות.
- באמצעות aligner קשר photolithography מסוגל קדמי / אחורי יישור, ליישר את מסכת החלון האחורי לדפוס שלוחה הצד הקדמי ולבצע חשיפה לקרינת UV מגע קשה כדי להעביר את התבנית מהחלון האחורי המסכה photoresist על שכבת הידית. השתמש בזמן חשיפה מחושב על בסיס ערך אנרגיית חשיפה של 480 mJ / 2 סנטימטר לphotoresist SPR220-4.5.
- לאחר חשיפה לקרינת UV, בואו הוופלים להישאר באזור חשוך למשך 30 דקות לפני שלב העיבוד הבא.
- לפתח את photoresist ידי טבילת הרקיק ביזם 726 photoresist MIF למשך 2 דקות תוך טלטול הרקיק בעדינות קדימה ואחורה.
- יש לשטוף את הרקיק עם מים מיוננים דה (DI) ולייבש אותו, רצוי בעזרת כלי מייבש שטיפת ספין (SRD).
- מניחים את הפרוסות בתנור על 90 מעלות צלזיוס במשך שעה 12.
- לחרוט את שכבת תחמוצת סיליקון בישבן של הרקיק באמצעות מערכת ורי עם גזי פלואור ומתכון לתחריט תחמוצת. תחמוצת הדוגמת על הישבן של פרוסות סיליקון פועלת כמסכה לחרוט לעיבוד נוסף. בדוק את הוופלים תחת מיקרוסקופ כדי להבטיח שתחמוצת סיליקון בחלון החשוף היא חרוטה לחלוטין.
- הסר את photoresist על קצה הרקיק (עד 5 מ"מ מהקצה) באמצעות ספוגית חדר נקייה הטבולה באצטון.
- טען את הרקיק בכלי DRIE עם ולהפעיל מתכון כדי לחרוט את שכבת ידית בדוגמת לעומק של 500 מיקרומטר עם תפקוד שכבת תחמוצת נקבר כתחנה לחרוט. פיצול לחרוט זה לריצות מרובות כדי למנוע חימום יתר שלרקיק, מה שגורם לתחריט עולה בקנה אחד של סיליקון. צעד לחרוט זה מסיר לחלוטין את הסיליקון שמתחת הזיזים.
- לבצע צעד תחריט רטוב באמצעות 25% etchant HF לדלל, להפשיט את שכבת תחמוצת נקברה מתחת לזיזים ושכבת תחמוצת המגן על גבי הזיזים.
הערה: שלב זה משחרר את המשטח התחתון של זיזי סיליקון וגם פותח חלון מתחת לספק גישה לחקור שלוחה עם הלייזר. - יש לשטוף את הרקיק באמצעות סדרה של אמבטיות מים די ויבשה בזהירות עם חנקן. מאז הזיזים נתמכים רק בבסיסים שלהם, לא משתמש בתרסיסים בכוח של מים די או גז אינרטי ישירות על הזיזים.
- קליב השבבים הבודדים מהרקיק לאורך הקווים ידבקו הופקו במהלך השלב לחרוט שכבת ידית.
תרבות .2 סלולארי
- הכן 13F coverslips על פי שיטות שפורסמו בעבר 17.
הערה: אם מפרצון 13Frslips אינו זמין, ניתן להשתמש בכל משטח הידרופובי עם זווית מגע מעל 95 מעלות. - לעקר שבבי שלוחה ו13F coverslips בפתרון אתנול 70% ולאפשר לאוויר יבש בזרימה מכסה המנוע.
- הנח שבבי שלוחה בודדים על גבי 13F coverslips בתוך צלחת יפה סטנדרטית 12.
- מעיל הזיזים עם שינוי biopolymer או משטח מותאם לסוג התא בשימוש על פי פרוטוקולי תרבית תאים סטנדרטיים.
- מחדש להשעות את התאים במדיום הגידול הספציפי שלהם לריכוז הרצוי.
הערה: פרוטוקול זה יגרום למספר לא מבוטל של תאים נופלים דרך חלון שלוחה ולא שמירה על פני השטח שלוחה הרצויות. הכנות תא לכן צריכים להיעשות 3-4x מרוכזת יותר מאשר להכנות coverslip סטנדרטיים. לדוגמא, זריעה של תאי לווין בשרירי שלד חולדה מתבצעת בדרך כלל באמצעות צפיפות זריעה של 500-700 תאים / כיכר מ"מ 15,16, ונמצא בשימוש במצעי שלוחה ב2,000 תאים / מ"מ מרובע. צריכים להתבצע ניסויי אופטימיזציה עם מקורות סלולריים חדשים כדי לוודא צפיפות זריעה מתאימה. - פיפטה 200 μl של ההשעיה התא על גבי משטח שבב שלוחה, הבטחת הבועה של מדיום מכסה את חלונות שלוחה לחלוטין. אם מדיום פתילות דרך החלון ולא ליצור בועת סטטי על גבי הזיזים להחליף coverslip 13F וreattempt הציפוי.
- העבר את הצלחת המכילה את השבבים לחממה ולאפשר לתאים לדבוק במשך שעה לפחות 1 (רצוי 2-3 hr).
- לאחר תקופה ציפוי זה, להשתמש במלקחיים סטריליות להעביר את השבב ולנקי, ללא coverslip 13F, ועליון את התרבות עם 1 מ"ל של מדיום גידול.
- להחזיר את הצלחת לחממה.
- שמור על תאים על פי הפרוטוקול הסטנדרטי שלהם לתחזוקה במבחנה על coverslips. לתאים שרירי שלד,מתג של הרכב בינוני לגרום להיווצרות myotube פעם התאים הופכים מחוברות תהיה צורך.
.3 התקנה של חומרה ותוכנה לניתוח תומכת הסטה
- מניחים צלחת תרבות מחוממת לבמה של מיקרוסקופ אלקטרופיזיולוגיה זקוף.
- הוסף 3 מ"ל של מדיום האכלת התאים כרגע מושעים ב( + 10 HEPES מ"מ) לבמה מיקרוסקופ המחוממת.
- הר אלקטרודות נירוסטה בחלק הפנימי של צלחת התרבות המחוממת במרחק הפרדת 15 מ"מ ולחבר אותם לגנרטור דופק, מסוגל לייצר פולסים גירוי תחום העצמה משתנות, תדירות, וצורת הגל, כדי לאפשר למערכת כדי לייצר גירוי שדה של תאים בעת צורך.
- בורג לייזר הליום ניאון, רכוב על שלבי translational XY, לחלק התחתון של טבלת מיקרוסקופ ולהתאים אותו כך שקרן הלייזר מכוונת דרך הבסיס של המנה התרבות המחוממת בrelativ 30 מעלות זוויתדואר למטוס של שלוחה.
- בורג מודול צילום גלאי רבע, רכוב על שלבי translational XY, לחלק התחתון של הבמה מיקרוסקופ ולהתאים את המיקום, כך שאדמות קרן הלייזר משתקפות במרכז 4 הרביעים. איור 2 מספק סקירה של החומרה להגדיר הכרחי ליישום הפרוטוקול המתואר.
- לכתוב תוכנה כדי לשלוט על המפעילים ליניארי שלסרוק פני הזיזים. לכתוב תוכנה תוך התייחסות לתרשים הזרימה הניתן באיור 3. הממשק הגרפי המתוכנתים לשימוש עם מערכת זו מסופק באיור 4.
.4 הקלטת תומכת הסטת נתונים
- הפעל את חומרת ניתוח שלוחה והתוכנה נלווית.
- הכנס את תרמיסטור הבמה המחומם לתוך המדיום ולחכות שזה לקרוא 37 מעלות צלזיוס.
- הכנס את שבב שלוחה לבמה עם cantilevers אוריינטציה לכיוון הצד הימני של הבמה.
- הפעל את מקור מיקרוסקופ האור.
- פוקוס מיקרוסקופ כדי להביא את הקצוות של הזיזים לעין ולהשתמש בתוכנת שליטת לייזר / צילום גלאי למצב את קרן הלייזר על קצה הערה 1 שלוחה: בהנחת הזיזים מכוונת לזכותו של השלב, שלוחה 1 הוא אחד ממוקם בפינה השמאלית העליונה של המערך ומספרים לרוץ למטה ל16 בפינה השמאלית התחתונה. שלוחה 17 היא בעמדה הימנית העליונה ופועלת ל32 בפינה הימנית תחתונה (איור 5 א).
- לחץ על "לשחק" בתוכנת הצריבה.
- מקם את התמונה-הגלאי כך שהאות כתוב "0" בשני x ומסגרות y על ידי התאמת מנועי צעד השליטה צילום הגלאי.
- עמדה להגדיר שלוחה 1 בתוכנת שליטת לייזר / צילום גלאי (איור 4).
- הזז את הלייזר לקצה שלוחה 16, חזור על שלב 4.7., ולהגדיר cantilevאה 16 עמדה בתוכנת שליטת לייזר / צילום גלאי.
- הזז את הלייזר לקצה שלוחה 32, חזור על שלב 4.7., ומיקום שנקבע שלוחה 32 בתוכנת שליטת לייזר / צילום גלאי.
- הזז את הלייזר לקצה שלוחה 17, חזור על שלב 4.7., ומיקום שנקבע שלוחה 17 בתוכנת שליטת לייזר / צילום גלאי.
- כבה את מקור מיקרוסקופ אור ואת האור במעבדה.
- "שיא" לחץ על תוכנת הצריבה.
- הגדר את מחולל דופק חומרת 40 אלפיות שניים, 5 V פולסים בתדר של 1 הרץ, והדלק את המכשיר.
הערה: לחלופין, להעסיק פרוטוקולי גירוי מותאמים למקורות תא מסוימים בשלב זה, את ההגדרות האמורות הן הנחיות מבוססות על נתונים שנאספו באמצעות מקורות 12,13,15,16 אדם ותא מכרסמים. - שימוש בתוכנת שליטת לייזר / צילום גלאי, להגדיר את החומרה כדי לסרוק פני מערך 32 שלוחה, לעצור למשך 5 שניות בכל אחד עלדואר.
- כאשר הסריקה של 32 הזיזים היא מלאה, לכבות את ממריץ, אז לעצור את תוכנת ההקלטה ולהעלות את קובץ הנתונים.
- לבחון את העקבות שנרשמו מכל שלוחה לראיות לפעילות התכווצות. רשום לעצמך כל שלוחה עם תגובות חיוביות. התכווצות מוגדרת כשיא אם הסטייה היא לפחות 0.1 V מעל קו הבסיס.
- הסר את כל זיזים שאינם מגיבים מפרוטוקול הסריקה בתוכנת שליטת לייזר / צילום גלאי.
- אז יכולים להיות ייסרקו הזיזים הפעילים ללא גירוי כדי לקבל קריאה של פעילות ההתכווצות הספונטנית של התא.
- הפעל סריקות עם או בלי גירוי חשמלי שדה רחב, הבאים תוספת של מתחם טיפולי למדיום כדי לצפות את השפעתה על הפלט הפונקציונלי של התאים בתרבית.
- לבצע הערכות עייפות על ידי גירוי חשמלי של התאים לפרקי זמן ארוכים ורמות סריקה של contr actility למדוד כמה זמן לוקח לשיא כוח לרדת מתחת לסף מסוים.
- בניסויים שבם הנוירונים מוטוריים נשמרים בשיתוף התרבות עם שרירים, למדוד היווצרות neuromuscular צומת דרך טיפול של שיתוף תרבויות שלוחה motoneuron-myotube עם ממריץ עצבי (כגון גלוטמט) או מעכב הסינפטי (למשל, D-tubocurarine) וסריקה ל עליות וירידות בפעילות ספונטנית בהתאמה 16.
- לבצע סריקות ספציפיות כפי שהוכתב על ידי הצרכים של הניסויים המתוכננים.
.5 ניתוח של תומכת הסטת נתונים
- השימוש הותאם המשוואות של Stoney 15 (שתפורטנה להלן) כדי להמיר את נתוני סטיית שלוחה גלם (בוולט) לקריאה של מתח בשכבת התאים או myotube (בפסקל), ומדידה ישירה של כוח התכווצות סלולארי (בננו ניוטון):
מודעה / 51,866 / 51866eq1.jpg "/> משוואת 1
משוואה 2 - איפה δ = סטיית קצה שלוחה ולחץ המיוצרים על ידי myotube, σ c = מיוצר על ידי myotube לחץ, בהנחת סרט עבה אחיד לכל הרוחב של שלוחה, גלאי C = מקדם המערכת ספציפית הנוגעים במתח לעמדת לייזר על התמונה -detector, θ = הזווית של הלייזר וגלאי ביחס למישור של שלוחה, E Si = מודולוס האלסטיות של סיליקון, Si t = העובי של שלוחה, ד = עובי myotube, Si v = היחס של הרעל של סיליקון, L = אורך שלוחה, אורך P = דרכו של לייזר מקצה שלוחה לגלאי, וw
- בהנחת myotube הוא סרט אחיד, הכוח בmyotube שווה לכח בסרט, שמוביל למשוואת 3, על ידי שהשווה את החישוב של כוח מלחץ ואזור חתך רוחב תא להניח ששימש ליישום של Stoney של משוואה.
משוואה 3 - בעקבות איסוף נתונים תפקודי, לתקן שבבי שלוחה לניתוח immunocytochemical או לנצל תאים לניתוח חלבונים או DNA תוך שימוש בטכניקות סטנדרטית.
- לחלופין, להחזיר את התאים לחממה במקום להתכונן לניתוח מולקולרי כדי להעריך מחדש את הביצועים פונקציונליים בנקודת זמן מאוחרת יותר.
משוואה 2 Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
תרבות המוצלחת של תאי התכווצות בזיזים היא הליך פשוט יחסית, תוך שימוש בטכניקות תרבית תאים סטנדרטיים (איור 5). אחוז זיזי תמיכה תאי הידבקות ישתנה בהתאם לסוג תא שנבחן וטכניקת תרבות מסוימת המועסקת. שימוש בתאים עובריים ראשוניים נבעו מגפיים אחוריות עכברוש, פעילות ההתכווצות התגלתה ביום 12 ב% מזיזים שנבדקו (n = 4). ניתוח של פונקצית התכווצות באמצעות מערכת הלייזר וצילום גלאי תיארה מספק נתונים בזמן אמת מדויקים הנוגעים לבגרות התפקודית של תאי זרע. שימוש בתוכנת אלקטרו סטנדרטי לאחר מכן ניתן להשתמש כדי לנתח את הנתונים הגולמיים, מאפשר חישוב של תכונות פונקציונליות רלוונטיות, כגון שיא כוח, זמן להגיע לשיא כוח, וזמן מחצית ההרפיה, כפי שמודגם באיור 7. איסוף נתונים לאחר מתרבויות שטופלו עם תרכובות טיפוליות מאפשרתהשוואה של מאפיינים פונקציונליים עם וללא תוספת תרופה, ובכך מאפשרת הערכה של פעילות מתחם וחיזוי עתידי של תגובות in vivo. יתר על כן, פרוטוקולי גירוי מורחבים מספקים את האמצעים כדי להעריך את השיעורים של עייפות בתאים בתרבית, ובכך להרחיב את הרמה של נתונים פיסיולוגיים זמינים ממערכת זו (איור 8).
תרבות שלוחה יכולה להיות שונה כדי לכלול הנוירונים מוטוריים במערכת התרבות עם myotubes שריר שלד 16, כדי לאפשר הערכה של היווצרות סינפסה נוירו שרירית במבחנה (איור 9). בתרבויות כגון, שיעורי פעילות התכווצות ספונטנית הם בהשוואה לשיעורים התכווצות בתגובה לטיפול עם ממריץ נוירון הספציפי, כגון גלוטמט. כל עליות גלוטמט מושרה נצפו בשיעורי התכווצות מציעות הפעלה של נוירונים בתרבית, שהובילו לשחרור אצטילכולין ומיו שלאחר מכןהפעלת צינור. טיפול במעכבים הסינפטי, כגון D-tubocurarine חוסם קולטן האצטילכולין, שהובילו להפסקת פעילות גלוטמט מושרה מספקים עדות נוספת לנוכחות של סינפסות תוקפת הפונקציונלית בתרבויות אלה 16.
זרימת תהליך ייצור שלוחה המפרטת איור 1 סכמטי. המספרים המופיעים בתרשים הזרימה כדי לתאם צעדי פרוטוקול בסעיף השיטות שכותרתו "ייצור שבבי שלוחה." אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.
חומרת .2 איורפרטים של מערכת לייזר / צילום גלאים המשמשת להערכת התכווצות סלולרית בזיזים. צילום (א) למיקרוסקופ אלקטרו שונה המשמש להערכת שלוחה. הלייזר (i) וצילום הגלאי (ii) הם רכובים מתחת לבמה בשלבי translational XY. מנה תרבות שקופה היא רכובה על הבמה (iii), אשר מאפשרת מעבר לייזר למערך שלוחה דרך החלק התחתון של הבמה. (B) סכמטי "מלמעלה למטה" נקודת מבט של הבמה מיקרוסקופ. שלבי translational XY יאפשר תנועה של הלייזר וצילום הגלאי הוא X ומטוסי Y (חצים אדומים), המאפשר תנועה של הלייזר לחקור את כל שלוחה במערך. שבבי שלוחה (iii) צריכים להיות ממוקמים לבמה עם הזיזים פונים לכיוון הימני של הבמה על מנת שהמערכת לפעול בצורה נכונה. (C) סגרו את התצלום של הלייזר (i) וצילום גלאי (ii) רכוב מתחת לבמת מיקרוסקופ. הלייזר ממוקם ב30 מעלות זווית ביחס למישור של שבב שלוחה (θ). (ד ') סגור את תצלום של צלחת התרבות. רחב שדה גירוי חשמלי מיושם באמצעות זוג אלקטרודות כסף ממוקם 15 מ"מ זה מזה (iv). גוף חימום (v) מחובר לחלק התחתון של המנה משמש כדי לשמור על התרבות על 37 מעלות צלזיוס במהלך ניתוח. בקרת טמפרטורה היא דינמית, והוסדר באמצעות תרמיסטור להציב הבינוני (לא מוצג). אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.
תרשים זרימת איור 3 של היגיון שמאחורי תוכנה לשליטה. סריקה של לייזר וצילום גלאי התוכנה שתי לולאות תנועת שליטה: לולאה העיקרית לקלט ממשתמש ולולאה השולטת בתנועת הסריקה. התקנה מתבצעת תוך בלולאה הראשית, ואחריו הפעלה של הלולאה השנייה לבינוני לאוסף נתונים תפוקה גבוהה. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.
.4 ממשק משתמש גרפי איור של תוכנה המשמש לשליטה עמדות לייזר וצילום גלאי במהלך הערכת שלוחה. לחצנים () כדי לשלוט באופן ידני עמדות לייזר וצילום גלאי הוא X ומטוסי Y. (B) שולט לקביעה ידנית את עמדותיהם של זיזי 4 פינה (1, 16, 17, ו32), ובכך לאפשר את התוכנה כדילהסיק את עמדותיהם של הזיזים שנותרו במערך. בקרה (C) המאפשרת למשתמשים לבחור את הזיזים לכלול בכל אחד לסרוק. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.
איור 5 תמונות של שבב שלוחה מותאמת אישית שנבנה לשימוש במערכת זו, ותמונות נציג של תאים נשמרו על משטחים דומים. צילום (א) ל, שבב שלוחה נבנה מותאם אישית בודד. כל שבב מכיל 32 זיזים מסודרים ב2 שורות של 16. תומכה 1 ממוקם בפינה השמאלית התחתונה של התמונה והשלוחה 32 בפינה הימנית העליונה. שבבי שלוחה 15 x 15 מ"מ 2. תמונת שלב ניגודיות (B) של תאי שרירי שלד חולדה העיקרית גדלו על שלוחהים. כל שלוחה היא 750 מיקרומטר ארוך, רחב 100 מיקרומטר ו4 מיקרומטר עבה. (C) כתם Immunocytochemical של myotube עכברוש עיקרי נשמר על שלוחה. תאים היו מוכתמים באמצעות בדיקה נוגדנים לשרשרת שרירן כבד. שים לב למראה המפוספס של הסיבים התרבותיים, המצביע על התבגרות של מכונות ההתכווצות. קצות שלוחה כבר הדגישו באופן מלאכותי בתמונה זו כדי לספק אינדיקציה לגודל. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.
איור 6 סכמטי הממחיש את המונחים המקובלים במשוואות של Stoney להפקת כוח הנוצר על ידי myotubes על זיזים. Δ = סטיית שלוחה קצה ולחץ המיוצר על ידי myotube, Cגלאי = מקדם המערכת ספציפית הנוגעים במתח לעמדת לייזר על התמונה-הגלאי, θ = הזווית של הלייזר וגלאי ביחס למישור של שלוחה, E Si = מודולוס האלסטיות של סיליקון, Si t = העובי של שלוחה, f t = עובי myotube, נ 'Si = היחס של הרעל של סיליקון, אורך L = שלוחה, ואורך P = דרכו של לייזר מקצה שלוחה לגלאי. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.
.7 נתוני איור נציג גלם וניתוח של צורת התכווצות באמצעות מערכת שלוחה תיארה. () דוגמא של עקבות נתונים גולמיים מהגירוי החשמלי רחב תחום myotubes עכברוש העיקרי בזיזים. עקבות עליונה = סטיית לייזר (בוולט) בציר x, המצביעות על אורכו עומס על שלוחה. עקבות התיכונה = סטיית לייזר (בוולט) בציר y, המצביעות על מתח torsional על פני שלוחה. עקבות תחתונה = הוריה של העמדה הזמנית של פולסים חשמליים המשמשים כדי לעורר התכווצות myotube במערכת זו. (ב) שימוש בתוכנת אלקטרופיזיולוגיה סטנדרטית, ניתן למדוד כוח שיא (PF), הזמן להגיע לשיא כוח (TTP) וזמן למחצית הרפיה (1/2 RT) מהנתונים הגולמיים שנאספו. (C) אסופת נתונים התכווצות (n = 11) מmyotubes שרירי שלד החולדה העיקרית. יישום של המשוואה של Stoney שונה מאפשר חישוב של מתח שלוחה מקריאות נתונים גולמיים בוולט. מנתונים אלה, חישוב ישיר של כוח (בניוטונים) יכול גם להיות שנוצר. נתונים שפורסמו הודפסו מחדש with רשות 13. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.
.8 נציגי נתונים מדגימים ניתוח של עייפות שרירי שלד בתרבויות שלוחה איור. הנתונים גולמיים (בוולט) הוסב למדידה של כוח myotube (בננו ניוטון) ו- זמם מחדש. הנתונים ממחיש עוצמה של התכווצויות myotube על זיזים בתגובה לפולסים רחבי שדה חשמלי 1 הרץ אחרי 0 דקות (זכר שחור) ו120 דקות (זכר אפור) של גירוי מתמשך. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.
איור 9 עקבות נציג מהניתוח של תרבות משותפת שריר motoneuron שלד נשמר על זיזים, הממחיש את ההשפעות התפקודיות של גירוי motoneuron עם ובלי תוספת של חוסם תוקפת. נתונים גולמיים (בוולט) הוסבה למדידת myotube מדידת כוח (בננו ניוטון) ומחדש זמם-. () מדידה של התכווצויות ספונטניות של myotubes בתרבית, ללא גירוי עצבי. מדידה (ב ') של התכווצות myotube בעקבות גירוי עצבי באמצעות התוספת של 200 מיקרומטר גלוטמט. (C) של התכווצות myotube הבא גלוטמט וטיפול D-tubocurarine 12.5 מיקרומטר. נתונים שפורסמו הודפסו מחדש באישור 16. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.
הטבלאות הבאות מפרטות את חומרים כימיים מסוימים המשמשים לתאי תרבות בניסויי האימות שתוארו, כמו גם את הציוד דרוש כדי לבצע את הערכת שלוחה. אנא שים לב כי ריאגנטים התרבות אין הם אינם נדרשים ומערכת זו צריכה להיות משולבת בקלות עם פרוטוקולי התרבות של כל מעבדה שמירה על תאי התכווצות במבחנה. ריאגנטים מופיעים מסופקים צריכים חוקרים רוצים לחזור על תוצאות הניסוי הספציפיות מתוארות.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
השלבים הקריטיים בניתוח זיזים מיקרוסקופים לראיות של התכווצות סלולרית הם המיקום של שבב שלוחה בתוך הבמה מיקרוסקופ, והיישור הבא של הלייזר וצילום גלאי עם הקצה של זיזי הפינה במערך. אם זה לא נעשה באופן מדויק, ולאחר מכן את התוכנה לא תוכל להסיק את עמדותיהם של הזיזים שנותרו במערך, שעלול לגרום להצטברות של תשלילים כוזבים במהלך איסוף הנתונים. מפעילים צריכים לטפל על מנת להבטיח כי שבב שלוחה משקר מיושר עם תחתית צלחת התרבות לפני כיול עמדות הלייזר. אם השבב יושב בזווית בצלחת, זה יהיה לשנות את דרכה של קרן לייזר המוסט ולבלבל את איסוף הנתונים.
אוויר שולחן פונקציונלי חייב להיות מועסק על מנת לבטל את תנודות רקע במהלך איסוף הנתונים. העובי הקטן (בערך 4 מיקרומטר) של הזיזים המשמש ביחסי ציבור מחקר זהovides רגישות גבוהה לפעילות התכווצות, אבל יש תופעת הלוואי של רגישות מוגברת לתנודות. מפעילים צריכים לדאוג למעבר בחומרה מעט ככל האפשר בזמן הקלטת נתונים, כדי להפחית את קריאות רקע. לבסוף, בעת ביצוע שבב שלוחה בשלב, דואג להבטיח את השבב אינו בא במגע עם אלקטרודות כסף גירוי בתרבות היטב. יישום של גירוי רחב שדה עם האלקטרודה נוגעת בשבב יהיה לשנות את הנתיב הנוכחי ולהשפיע לרעה על יכולתה של המערכת כדי לעורר ביעילות התאים בתרבית.
על מנת לקבל קריאה מדויקת יותר של תפוקת כוח בmyotubes שרירי שלד, מומלץ מאוד לבצע immunostaining של התאים בתרבית ניתוח פעם אחת פונקציונלי הוא מוחלט. המשוואות הרשומות דורשות קלט של שטח החתך של myotube (CSA) על מנת לחשב כוח. בעוד ערך להניח ניתן להשתמש על בסיס pנתונים revious, מדידה של CSA המדויק של myotube תוך שימוש בטכניקות הדמיה confocal יספק הערכה מדויקת יותר של הכוח המופעל על ידי myotube הקבלנות. הנוגעים נתוני התכווצות גלם למאפיינים הפיזיים של התא מדובר הוא בעל ערך בתוצאות נרמול פני זיזים מרובים ובין תנאי ניסוי 15, ולכן קריטי ליצירת תחזיות מדויקות של תגובות רקמה שלמות לטיפול תרופתי או מחלה. המשוואות של Stoney להניח myotubes בדק היקף לכל האורך של שלוחה כך מאמץ צריך להיעשות כדי לכלול רק נתונים המתקבלים מהתאים העומדים בהנחה זו. אם זה לא אפשרי, ניתוח אלמנטים סופי יכול לשמש כדי לספק מדידה מדויקת של כוח מmyotubes הקטן יותר כפי שפורסם בעבר 15. שיטה אנליטית זו היא הרבה יותר עבודה אינטנסיבית, ולכן אינם מתאימה ליישומי תפוקה גבוהים יותר, אבל עשוי להיות נחוץ אם מותאםלא ניתן להשיג בתרביות תאים העומדים בהנחות של Stoney.
כאמור, ניתן להעביר פרמטרים תרבות מהכנות coverslip סטנדרטיים. עם זאת, מומלץ לשקול ניצול יצירות סרום ללא מדיה ומצעים שאינם ביולוגיים לשימוש במערכת זו ביישומי הקרנת סמים. בשל האופי מוגדר של סרה בעלי החיים, את ההשפעה של תרופות חדשניות עשויה להיות מבולבלת על ידי הכללה של תוספים כגון במדיום התרבות. ניסוחים סרום ללא מדיה זמינים עבור שניהם מכרסם ותרבויות שרירי שלד אנושיות 18-21 ולספק סביבה לביצוע הערכת מתחם, מוגדרת היטב יותר בשליטה. באופן דומה, השימוש בציפויים ביולוגיים (קולגן, laminin, וכו ') בזיזים מציג השתנות להכנות תא הלהימנע על ידי יישום של מצעים שאינם ביולוגיים. בתצהיר של monolayers העצמי התאספו silane על גבי משטחי התרבות הוכח לשעברtensively לתמוך בדבקות ובפיתוח של סוגי תאים מרובים 16,18,20,22-31, ומייצג את האמצעים ליצירת משטחים באופן מלא מוגדרים באופן אמין ודיר.
בשל מגוון רחב של תאי התכווצות הנוכחיים במערכות יונקים, היישום של מודל זה למבחנים במבחנה הוא רחב יחסית. למרות מותאם תוך שימוש בתאים שרירי שלד, המערכת היא פוטנציאל ישים להחליק תאי שריר ושריר לב, כמו גם, מתן האמצעים לביצוע ההערכה המהירה של תגובות מינון לתרופות רומן בתאים אלה בזמן אמת. שבבי שלוחה שוטפים מורכבים ממערך של 32 זיזים (איור 5 א), אבל אפשר לשנות בקלות לכלול רב יותר. ניתוח של מערכים כאלה מייצר מספר לא מבוטל של נקודות נתונים מתרבות אחת, ובכך להגדיל באופן משמעותי את הכח הסטטיסטי של כל הבדלים שנצפו. כפי שמעיד באיור 8, תאים בתרביתבמערכת זו עוברת עייפות לאורך זמן, בתגובה לגירוי רחב שדה רציף, המאפשר הערכה של שפעות תרופה על רמות הסיבולת של תאים במבחנה. תוספת של הנוירונים מוטוריים innervating למודל תרבות זו גם מאפשר הערכה של היווצרות הסינפסה דרך מדידה של שריר התכווצות בתגובה לממריצים עצביים (איור 9). בעוד המדידה של פרמטרים תפקודיים בסיסיים בassay מרובב (איור 7) יש יתרונות ברורים על פני הערכת biomolecular סטנדרטית של תרבויות במבחנה, היכולת להעריך את הפונקציונליות תוקפת וכושר הסיבולת של תאים שנזרעו מגדילה מאוד את תחולתו של מודל זה להקרנת סמים ויישומי דוגמנות מחלה. הטכניקה המתוארת מציעה חוקרים האמצעים לבצע הערכה מהירה, עלות נמוכה פונקציונלית של שני תאי שריר בריאים וחולים במבחנה. הרבגוניות של מערכת התרבות, וhרמת בוהות של פרט פונקציונלי זמין מניתוח של נתונים הגולמיים, צריכה לייצר תחזיות מדויקות יותר של in vivo תגובות רקמה לאתגרי פתולוגי והכימיים רומן.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Acknowledgments
מחקר זה מומן על ידי המכון הלאומי לבריאות מענק המספרים R01NS050452 וR01EB009429. ייצור של שבבי שלוחה בוצע באופן חיצוני על ידי משתפי פעולה במתקן nanofabrication ממוקם באוניברסיטת קורנל. כל הציוד המשמש בתהליך ייצור שלוחה היה ממוקם במתקן זה. תודה מיוחדת למנדי Esch וז'אן מתיו Prot על סיועם במייקרו ייצור שלוחה. אנימציה וידאו של פונקציונליות שלוחה נוצרה על ידי צ'רלס יוז, אלכס Zelenin ואריק Imperiale מהמעבדה למציאות סינתטית בUCF.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Primary rat muscle growth medium | |||
| Neurobasal medium | Life Technologies | 21103-049 | |
| B27 (50x) | Life Technologies | 17504044 | 1x |
| Glutamax (100x) | Life Technologies | 35050061 | 1x |
| G5 supplement | Life Technologies | 17503-012 | 1x |
| Glial-Derived Neurotrophic Factor | Cell sciences | CRG400B | 20 ng/ml |
| Brain-Derived Neurotrophic Factor | Cell sciences | CRB600B | 20 ng/ml |
| Ciliary Neurotrophic Factor | Cell sciences | CRC400A | 40 ng/ml |
| Neurotrophin-3 | Cell sciences | CRN500B | 20 ng/ml |
| Neurotrophin-4 | Cell sciences | CRN501B | 20 ng/ml |
| Acidic Fibroblast Growth Factor | Life Technologies | 13241-013 | 25 ng/ml |
| Cardiotrophin-1 | Cell sciences | CRC700B | 20 ng/ml |
| Heparin Sulphate | Sigma | D9809 | 100 ng/ml |
| Leukemia Inhibitory Factor | Sigma | L5158 | 20 ng/ml |
| Vitronectin | Sigma | V0132 | 100 ng/ml |
| Primary rat muscle differentiation medium | |||
| NB Activ 4 | Brain Bits LLC | NB4-500 | |
| Equipment | |||
| Class 2 red diode laser | Newport | ||
| Photo-detector | Noah Industries | ||
| Model 2100 Pulse stimulator | A-M systems | ||
| Multiclamp 700B Digitizer | Axon Instruments | ||
| Patch clamp microscope and stage | Olympus | ||
| Delta T4 culture dish controller | Bioptechs | ||
| Axoscope software | Molecular Devices | ||
| LabVIEW software | National Instruments | ||
| 37 oC, 5% CO2 incubator | NAPCO | ||
| Class 2 microbiological flow hood | Labconco | ||
| Pipettes and tips | Eppendorf |
References
- Bischoff, R. Enzymatic liberation of myogenic cells from adult rat muscle. Anat. Rec. 180, 645-661 (1974).
- Yasin, R., et al. A quantitative technique for growing human adult skeletal muscle in culture starting from mononucleated cells. J. Neurol. Sci. 32, 347-360 (1977).
- Dennis, R. G., Kosnik, P. E., 2nd, Excitability and isometric contractile properties of mammalian skeletal muscle constructs engineered in vitro. In Vitro Cell Dev. Biol. Anim. 36, 327-335 (2000).
- Khodabukus, A., Baar, K. Defined electrical stimulation emphasizing excitability for the development and testing of engineered skeletal muscle. Tissue Eng Part C Methods. 18, 349-357 (2012).
- Langelaan, M. L. P., et al. Advanced maturation by electrical stimulation: Differences in response between C2C12 and primary muscle progenitor cells. Journal of tissue engineering and regenerative medicine. 5, 529-539 (2011).
- Stephenson, G. M., O'Callaghan, A., Stephenson, D. G. Single-fiber study of contractile and biochemical properties of skeletal muscles in streptozotocin-induced diabetic rats. Diabetes. 43, 622-628 (1994).
- Harber, M., Trappe, S. Single muscle fiber contractile properties of young competitive distance runners. Journal of applied physiology (Bethesda, Md: 1985). 105, 629-636 (2008).
- Hvid, L. G., et al. Four days of muscle disuse impairs single fiber contractile function in young and old healthy men. Experimental gerontology. 48, 154-161 (2013).
- Edman, K. A.
- Krivickas, L. S., Walsh, R., Amato, A. A. Single muscle fiber contractile properties in adults with muscular dystrophy treated with MYO-029. Muscle Nerve. 39, 3-9 (2009).
- Sung, J. H., et al. Microfabricated mammalian organ systems and their integration into models of whole animals and humans. Lab on a chip. 13, 1201-1212 (2013).
- Wilson, K., Molnar, P., Hickman, J. J. Integration of functional myotubes with a Bio-MEMS device for non-invasive interrogation. Lab on a chip. 7, 920-922 (2007).
- Wilson, K., Das, M., Wahl, K. J., Colton, R. J., Hickman, J. Measurement of contractile stress generated by cultured rat muscle on silicon cantilevers for toxin detection and muscle performance enhancement. PLoS ONE. 5, (2010).
- Binnig, G., Quate, C. F., Gerber, C.
- Pirozzi, K. L., Long, C. J., McAleer, C. W., Smith, A. S., Hickman, J. J. Correlation of embryonic skeletal muscle myotube physical characteristics with contractile force generation on an atomic force microscope-based bio-microelectromechanical systems device. Applied physics letters. 103, 83108 (2013).
- Smith, A., Long, C., Pirozzi, K., Hickman, J. A functional system for high-content screening of neuromuscular junctions in vitro. Technology. 1, 37-48 (2013).
- Stenger, D. A., et al. Coplanar molecular assemblies of amino- and perfluorinated alkylsilanes: characterization and geometric definition of mammalian cell adhesion and growth. Journal of the American Chemical Society. 114, 8435-8442 (1992).
- Das, M., Rumsey, J. W., Bhargava, N., Stancescu, M., Hickman, J. J. A defined long-term in vitro tissue engineered model of neuromuscular junctions. Biomaterials. 31, 4880-4888 (2010).
- Rumsey, J. W., Das, M., Bhalkikar, A., Stancescu, M., Hickman, J. J. Tissue engineering the mechanosensory circuit of the stretch reflex arc: Sensory neuron innervation of intrafusal muscle fibers. Biomaterials. 31, 8218-8227 (2010).
- Das, M., Rumsey, J. W., Bhargava, N., Stancescu, M., Hickman, J. J. Skeletal muscle tissue engineering: A maturation model promoting long-term survival of myotubes, structural development of the excitation-contraction coupling apparatus and neonatal myosin heavy chain expression. Biomaterials. 30, 5392-5402 (2009).
- Das, M., et al. Developing a novel serum-free cell culture model of skeletal muscle differentiation by systematically studying the role of different growth factors in myotube formation. In Vitro Cell Dev Biol Anim. 45, 378-387 (2009).
- Stenger, D. A., Pike, C. J., Hickman, J. J., Cotman, C. W. Surface determinants of neuronal survival and growth on self-assembled monolayers in culture. Brain research. 630, 136-147 (1993).
- Hickman, J. J., et al. Rational pattern design for in vitro cellular networks using surface photochemistry. Journal of Vacuum Scienc., & Technology A: Vacuum, Surfaces, and Films. 12, 607-616 (1994).
- Das, M., Molnar, P., Devaraj, H., Poeta, M., Hickman, J. J. Electrophysiological and morphological characterization of rat embryonic motor neurons in a defined system. Biotechnology progress. 19, 1756-1761 (2003).
- Rumsey, J. W., et al. Node of Ranvier formation on motor neurons in vitro. Biomaterials. 30, 3567-3572 (2009).
- Murugan, R., Molnar, P., Rao, K. P., Hickman, J. J. Biomaterial Surface patterning of self assembled monolayers for controlling neuronal cell behavior. International journal of biomedical engineering and technology. 2, 104-134 (2009).
- Guo, X., Johe, K., Molnar, P., Davis, H., Hickman, J. Characterization of a human fetal spinal cord stem cell line, NSI-566RSC, and its induction to functional motoneurons. Journal of Tissue Engineering and Regenerative Medicine. 4, 181-193 (2010).
- Varghese, K., et al. A new target for amyloid beta toxicity validated by standard and high-throughput electrophysiology. PLoS ONE. 5, e8643 (2010).
- Natarajan, A., et al. Patterned cardiomyocytes on microelectrode arrays as a functional, high information content drug screening platform. Biomaterials. 32, 4267-4274 (2011).
- Davis, H., et al. Rat Cortical Oligodendrocyte-Embryonic Motoneuron Co-Culture: An Axon-Oligodendrocyte Interaction Model. Journal of biomaterials and tissue. 2, 206-214 (2012).
- Natarajan, A., DeMarse, T., Molnar, P., Hickman, J. Engineered In Vitro Feed-Forward Networks. J Biotechnol Biomater. 3, 2 (2013).
