Summary
En utilisant des puces à protéines contenant presque toute la S. cerevisiae protéome est sondé pour interrogatoire impartiale rapide de milliers d'interactions protéine-protéine en parallèle. Cette méthode peut être utilisée pour la molécule de protéine-petite, la modification post-traductionnelle, et d'autres dosages in à haut débit.
Abstract
Haute densité des puces à protéines fonctionnelles contenant 4,200 ~ protéines de levure recombinantes sont examinées pour les interactions protéine-protéine kinase en utilisant une protéine de fusion purifiée par affinité de la kinase de levure contenant une étiquette V5-épitope de lecture. Kinase purifiée est obtenue par la culture d'une souche de levure optimisé pour la production de protéines de haute copie hébergeant un plasmide contenant une fusion kinase-V5 construire sous un promoteur inductible GAL. La levure est cultivée dans des milieux restrictive avec une source de carbone neutre pendant 6 heures, suivi par induction avec 2% de galactose. Ensuite, la culture est récoltée et la kinase est purifiée en utilisant des techniques standards de Chromatographie d'affinité pour obtenir une protéine kinase hautement purifiée pour une utilisation dans le dosage. La kinase purifiée est diluée avec un tampon de kinase à une gamme appropriée pour le dosage et les puces à protéines sont bloqués avant l'hybridation avec le microréseau de protéines. Après l'hybridation, les tableaux sont sondés avec des anticorps monoclonaux V5 antiborps d'identifier les protéines liées par la protéine kinase-V5. Enfin, les tableaux sont numérisés à l'aide d'un scanner de puces à ADN standard, et les données sont extraites pour analyse informatique aval 1,2 à déterminer un niveau de confiance élevé définir des interactions des protéines pour la validation aval in vivo.
Introduction
La nécessité de réaliser des analyses globales de biochimie des protéines et de l'activité in vivo de liaison a abouti à l'élaboration de nouvelles méthodes de profilage interactions protéine-protéine (IPP) et les modifications post-traductionnelles de protéomes entiers 1,3-8. Puces à protéines sont fabriqués comme puces fonctionnelles de protéines en utilisant des protéines fonctionnelles pleine longueur 4-6,8,9, ou des puces à protéines analytiques contenant des anticorps 10,11. Ils sont conçus pour contenir une grande densité de protéines disposées sur des lames de microscope avec une variété de compositions chimiques de surface pour faciliter une variété de conditions expérimentales requises pour effectuer biochimique large 12 analyses. Nitrocellulose et de la surface de l'aldéhyde chimies pour la fixation chimique à travers lysine ou fixation d'affinité des méthodes telles que nickel diapositives chélatés pour fixer les protéines et les glutathion His-étiqueté pour la fixation d'affinité entre autres 13. L'utilisation de puces à protéines fonctionnelles pour détecter les interactions protéine-protéine nécessite l'accès à une bibliothèque de protéine fonctionnelle de haute qualité 14. S. cerevisiae est susceptible de produire une telle bibliothèque à travers le jumelage de haute affinité copie étiqueté constructions de protéines à haut débit avec des techniques de purification chromatographique. La grande majorité du génome de la levure a été séquencé et la quasi-totalité du protéome peut être exprimée à partir d'un plasmide grand nombre de copies pour la purification et l'analyse biochimique 12. Une fois que les protéines sont obtenus et disposés en format de 384 puits, ils sont imprimés sur une lame de microscope permettant une analyse biochimique rapide parallèle multi-paramétrique et l'interrogatoire bioinformatique 8,14-16. microréseaux de protéines ont été utilisées pour les dosages enzymatiques et des interactions avec des protéines, des lipides, des petites molécules et des acides nucléiques, parmi beaucoup d'autres applications. L'accessibilité des protéines sur la surface du protéometableaux rendent prêtent à différents types de détection analytique, y compris immunitaire affinité, résonance plasmonique de surface, la fluorescence et de nombreuses autres techniques. En outre, il permet un contrôle précis de la condition expérimentale où il pourrait être difficile de le faire in vivo.
L'objectif de ce protocole est de démontrer l'usage approprié des puces à protéines fonctionnelles pour détecter les interactions protéine-protéine. Cette application permet à l'analyse biochimique parallèle à haut débit des activités de liaison de protéines en utilisant un analyte hautement purifiée (protéine) d'intérêt. A C-terminal (carboxy-terminale) étiqueté V5-fusion protéine appât d'intérêt est produit à partir d'un plasmide grand nombre de copies dans une souche de levure optimisé pour la purification des protéines. C-terminal marquage assure que la protéine pleine longueur a été traduit. La protéine utilisée dans cette étude est TDA1-V5 protéine de fusion kinase, qui est purifiée en utilisant une résine d'affinité de nickel via un tag His6X. La fusion construc TDA1-V5t est purifié par élution série en utilisant un gradient d'imidazole pour éluer la fraction la plus hautement enrichi destiné à être utilisé dans le dosage.
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Protocol
1. Préparation de la sonde
- Culture et purifier les sondes kinase V5-fusion utilisées pour examiner les interactions avec d'autres protéines comme suit:
- Utilisez fraîchement striée souche de levure Y258 (MATa pep4-3, his4-580, ura3-53, leu2-3,112) contenant des protéines V5-fusion (exprimé de Gateway vecteur pYES-DEST52). Utilisez la protéine isolée comme sonde sur les puces. Plaque sur la levure synthétique complet-uracile (Sc-Ura) / 2% de dextrose / agar et de croître à 30 ° C pendant 3 jours de culture congelée (-80 ° C glycérol stock).
- Inoculer des cultures de démarrage (5-20 ml) à partir d'une seule colonie et de croître pendant la nuit dans Sc-Ura / 2% de dextrose à secouer la plate-forme (220-250 rpm) ou de la roue à 30 ° C.
- Le lendemain matin, inoculer 400 ml de la Sc-Ura / 2% de la culture de raffinose avec la culture de démarrage suffisant pour une DO finale 600 de 0,1.
- Cultivez les inoculums à DO 600 de 0,6 suivie par induction par le galactose de la fu V5-kinasesion construire expression par addition d'une solution d'extrait de levure 3x / Peptone (YEP) additionné de 6% de galactose, en suffisant pour diluer le support d'induction d'un facteur 3 en ajoutant de sorte que la concentration finale de 2% de galactose est.
- Induire les cellules à 30 ° C pendant 6 heures sur une table d'agitation. Utilisez un L Erlenmeyer de 2 pour assurer une aération appropriée.
- Récolte des cellules en utilisant un rotor JA-10 (ou comparables), la rotation 400 ml de suspension de cellules à 1000 g pendant 5 min à 4 ° C.
- Laver les cellules une fois avec 50 ml de glace tampon PBS froid et transférer dans un tube conique de 50 ml. Laver le culot de nouveau dans un tampon PBS glacé (sans détergents ou d'autres additifs) utilisés pour la lyse et le transfert à 2 ml à bouchon tubes de lyse.
- Faites tourner les cellules à 20.000 g pendant 1 min à 4 ° C à une pastille et la pipette loin le tampon.
- Placer les tubes sur la glace et passez à l'étape de lyse.
- Lyse des cellules (250-350 pi granulés) avec 00,5 mm billes de zircone dans un 1: 1: volume de culot cellulaire, des perles, et une solution saline tamponnée au phosphate (PBS) 1 tampon de lyse et le vortex le mélange en utilisant une plate-forme d'agitation 3 fois à intervalles de 2 min à 4 ° C.
- Centrifuger le lysat à 20.000 xg dans une centrifugeuse de table pendant 10 min à 4 ° C.
- Pipette surnageant dans le tube de centrifugeuse en polycarbonate à haute vitesse et de clarifier par ulracentrufugation pendant 30 minutes à 150 000 g à 4 ° C.
- Transférer le lysat clarifié dans un tube contenant de la résine Ni 2+ prélavé d'affinité (~ 100 ul) et incuber sur un nutator pendant 2 h à 4 ° C pour capturer l'histidine (His) 6X protéine étiquetée V5-fusion.
- Laver la résine trois fois pendant 10 min à 4 ° C avec le tampon de lavage. Pellet la résine en utilisant une centrifugeuse de table pendant 5 min à 1000 g à 4 ° C et aspirer le surnageant. Ajouter tampon de lavage fraîche pour chaque lavage et retourner le tube du nutator pour l'agitation pendant le lavage.
- Après la ste de lavageps sont complets, appliquer la résine lavée à une colonne G-25 frais pour l'élution.
- Appliquer 25 pi de tampon d'élution d'une manière par étapes en commençant avec 100 mM d'imidazole à 500 mM d'imidazole 50 mM par incréments pour un total de neuf fractions.
- Doser les fractions recueillies en utilisant du gel de dodécylsulfate de sodium et de polyacrylamide (SDS-PAGE) et coloration de Coomassie pour déterminer la fraction (s) le plus fortement enrichi pour être utilisé dans l'essai et ajouter du glycérol à 30% et stocker à -80 ° C jusqu'à utilisation dans le dosage.
2. Sonder les tableaux
NOTE: S'il vous plaît voir l'étape 2.6 de cette section pour préparer la solution d'anticorps avant de commencer l'essai.
- Pour détecter les interactions, diluer l'anticorps conjugué V5-fluorophore (c. AlexaFluor 647) à 260 ng / ml dans le tampon de la sonde et mélanger soigneusement par agitation.
NOTE: Préparer cette solution d'anticorps 30 min avant de les utiliser et placer le tube sur un nutatou ou la roue pour assurer un mélange complet et une suspension homogène d'anticorps. - Diluer la sonde de protéines V5-fusion sur une plage de concentration de 5-500 pg / ml.
REMARQUE: optimisée pour chaque essai d'interaction protéine-protéine, en utilisant un tampon de la sonde. L'optimisation consiste à ajouter plusieurs sondes pour sonder tampon. Typiquement, 10 ug / ml est utilisée comme point de départ et ajusté en conséquence en fonction de la puissance du signal. - Retirer les puces à protéines du congélateur (-20 ° C) et porter à 4 ° C au réfrigérateur juste avant l'utilisation.
- Ajouter un tampon bloquant directement le support de diapositives contenant les micorarrays de protéines et de couvrir le dessus avec du parafilm pour éviter les fuites. Bloquer les tableaux dans un tampon de blocage pendant 1 heure en agitant à 50 rpm sur une scène à 4 ° C.
- Après blocage, les ensembles de transférer une chambre humidifiée refroidi à 4 ° C et ajouter 90 ul de sonde diluée directement à la surface du tableau. Superposer l'arrays avec un bordereau de lifter soulevé et incuber statique (sans agitation) dans la chambre humide à 4 ° C pendant 1,5 heures.
- Laver les tableaux 3 fois pendant 1 min dans un tampon de chaque sonde dans trois 50 ml tubes coniques. Ajouter la diapositive à tubes coniques contenant un tampon de la sonde pré-réfrigérés assez pour envelopper complètement la diapositive. Laisser le bordereau de levier pour doucement glisser hors de la puce de protéine (ne pas forcer off car cela pourrait entraîner des dommages à la surface de la matrice).
- Appliquer la solution d'anticorps directement au tableau immédiatement après avoir terminé le lavage (étape 2.5) et la superposition avec un glissement de levage soulevé comme avant. Incuber les matrices pendant 30 minutes à 4 ° C en chambre humide.
- Effectuez la même étape de lavage comme avant (3 fois 1 min dans un tampon de la sonde), et de spin dans un tube conique de 50 ml à 800 xg dans une centrifugeuse de table pendant 5 min à température ambiante. Air-sécher les tableaux dans un support de diapositives dans l'obscurité pendant 30 min avant de balayer le tableau à 647 nm.
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Representative Results
L'activité de l'interaction protéine-protéine a été observée à l'aide d'un lecteur de puce standard pour évaluer la TDA1-V5 protéine kinase Construction d'une fusion protéine d'appât contre une puce de protéine fonctionnelle de levure contenant environ 4200 uniques S. cerevisiae des protéines de fusion GST. Nouvel interrogatoire avec le logiciel Genepix révélé une multitude d'événements de différentes intensités de liaison. L'affinité a été évaluée à partir de l'intensité graduelle du signal provenant d'un monoclonal V5-Fluorophore anticorps conjugué lié à sa cible (V5-kinase). ProCat notation algorithme 2 a été utilisé pour identifier les interactions protéine-protéine entre deux puces à protéines distinctes pour chacune des protéines analysées en double (chaque protéine est repéré deux fois sur le tableau), puis un seuil de coupure a été déterminée pour marquer les interactions observées.
En comparant les deux tableaux on obtient 4 répétitions techniques (n = 4) qui peuvent utiliser pour déterminer inter-dosage variation par corrélation (R 2) des deux points pour chaque protéine sur les tableaux. Un total de 9 interactions protéine-protéine ont été identifiées entre la protéine appât TDA1-V5 et les protéines sur la puce à ADN à l'aide d'un seuil prédéfini pour identifier les interactions entre protéines kinases uniques 1. En outre, les mêmes protéines sont repérés dans des positions différentes à travers les tableaux comme un contrôle pour évaluer artefacts de surface qui peuvent contribuer à des faux positifs. La comparaison de plusieurs profils de liaison de différentes protéines kinase-V5 fusion permet l'identification des interactions protéine-protéine kinase spécifique pour les essais in vivo.
Dans cette expérience, nous avons testé l'activité de liaison de TDA1-V5 et identifié plusieurs IPP statistiquement significative en fonction de leur indice de p-valeur par rapport à d'autres kinases testées. D'intérêt particulier est Rim11, qui a été identifié comme une cible phosphorylée de TDA1 dans une s publié précédenteTudy 9. Une fois que les cibles ont été identifiés, ils peuvent être testés pour l'activité biochimique et fonctionnel in vivo 1.
Figure 1:. TDA1-V5 par rapport à vide lutte antivectorielle puces à protéines de levure repérés en double avec ~ 4200 pleine longueur de protéine de fusion GST a été incubé avec contrôle ou sondes TDA1-V5. Panneau encadré compare la région identique dans les deux tableaux. Interaction protéine-protéine a été détectée (boîtes bleues) entre Rim11 et TDA1-V5.
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Discussion
Le protocole présenté a été effectuée en utilisant 85 des protéines kinase-V5 de fusion protéine de levure uniques pour comparer l'activité de liaison à travers familles distinctes et liées des protéines kinases de la levure conduisant à l'identification de nouveaux réseaux d'interactions in vivo une kinase. En tant que technologie de profilage protéomique émergents, le développement de High Throughput (HTP) de dépistage du protéome en utilisant des puces à protéines appuyés sur des bibliothèques de peptides, et des organismes eucaryotes et procaryotes modèle 8,17; plus tard, cette plate-forme d'analyse a été appliquée à des eucaryotes supérieurs telles que des installations et 5,7 humaine. Actuellement, il n'y a pas de réseau de protéines de levure disponible dans le commerce. Cependant, la séquence vérifiée collections d'ADNc sont disponibles à partir de multiples ressources
Bien que la technique peut être puissant, une mise en garde à garder à l'esprit est que le dosage est effectué in vitro, et, par conséquent les résultats auront des faux positifs. Ainsi, optimizing état de dosage et système de filtrage stratégique est conseillé de récupérer des données significatives. Technologies de microréseaux de protéines de nouvelle génération contiennent un plus grand nombre de protéines fonctionnelles hautement purifiés pour l'analyse biochimique à travers une multitude d'organismes, y compris A. thaliana, S. cerevisiae, et Homo Sapien.
Le niveau de sophistication que les nouvelles puces à protéines ont conçu dans leur permet une variété large d'analyses biochimiques qui peuvent être effectuées. Presque tout le protéome a été cloné et purifié de S. cerevisiae en utilisant une banque balisé C-terminale pour assurer la modification post-traductionnelle correcte des protéines 14. En outre, les analyses parallèles rapides offerts en utilisant des puces à protéines permet une approche impartiale à l'interaction protéine-protéine et la modification post-traductionnelle profilage.
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Petri Dishes | VWR | NC-10747 | or comparable |
| Bacto yeast extract | Difco | 0217-17 | |
| Bacto peptone | Difco | 0118-17 | |
| Bacto agar | Difco | 0140-01 | |
| Dextrose | Sigma | D9434 | |
| Raffinose | Sigma | R0514 | |
| Galactose | Sigma | G0750 | |
| Sc-Ura drop out media | MP Bio | 114410622 | |
| Small Culture tubes | VWR/Fisher | ||
| Large Erlenmeyer Flask | VWR/Fisher | ||
| Centrifuge JA-10 rotor | |||
| Centrifuge tubes (500 ml) | |||
| Falcon tube (50 ml) | VWR/Fisher | 21008-951 | |
| PBS Tablets | Sigma | P4417 | |
| FastPrep Tubes (2 ml screw cap tube) | |||
| FastPrep Machine | MP Biomedicals | 116004500 | |
| Zircon Beads | BioSpec | 11079105 | |
| Triton X100 | Sigma | P4417 | |
| DTT | Sigma | D9779 | |
| MgCl2 | Sigma | M8266 | |
| NaCl | Sigma | S3014 | |
| Imidazole (pH = 7.4) | Sigma | I5513 | |
| PMSF | Sigma | 93482 | |
| Complete Inhibitor Cocktail (EDTA Free) | Roche | 11873580001 | |
| Phosphatase inhibitor cocktail 1 | sigma | P2850 | |
| BSA | Sigma | A2153 | |
| Tween-20 | Sigma | P1379 | |
| ATP | Sigma | A1852 | |
| Shaking Incubator (30 °C) | |||
| Nickel Affinity Resin | Life Technologies | R901-01 | |
| G25 column | GE life sciences | 27-5325-01 | |
| Nutator | VWR/Fisher | ||
| SDS-PAGE Gel (NuPage) | Life Technologies | ||
| Coomassie Blue Stain | Life Technologies | ||
| Monoclonal V5 Antibody | Life Technologies | R960-25 | |
| Alexa647 Tagged monoclonal V5 Antibody | Life Technologies | 451098 | |
| Protein Microarrays Kit | Life Technologies | PAH0525013 | |
| Genepix Scanner | Molecular Devices | ||
| Lifter Slips | Thomas Scientific | http://www.thomassci.com/Supplies/Microscope-Cover-Glass/_/LIFTER-SLIPS/ | |
| Lysis Buffer: 0.1% Triton X-100, 0.5 mM DTT, 2 mM MgCl2, 500 mM NaCl, 50 mM imidazole (pH 7.4), Complete protease inhibitor cocktail – EDTA-free, Phosphatase inhibitor Cocktail 1, 1 mM PMSF (add just prior to use) |
Add the reagents to 1x PBS (0.01 M phosphate buffer, 0.0027 M potassium chloride, 0.137 M sodium chloride; pH 7.4) to obtain the desired volume of lysis solution | ||
| Blocking Buffer: 1% bovine serum albumin (BSA), 0.1% Tween-20 | Add the reagents to 1x PBS to obtain the desired volume of blocking buffer | ||
| Probe Buffer: 2 mM MgCl2, 0.5 mM DTT, 0.05% Triton X-100, 50 mM NaCl, 500 μM ATP (for kinases), 1% BSA | Add the reagent to 1x PBS to obtain desired volume of probe buffer | ||
| Wash Buffer: 0.1% Triton X-100, 500 mM NaCl, 0.5 mM DTT, 50 mM imidazole (pH 7.4),2 mM MgCl2 | Add the reagent to 1x PBS to obtain desired volume of probe buffer | ||
| Elution Buffer: 0.1% Triton X-100, 0.5 mM DTT, 2 mM MgCl2, 500 mM NaCl, 50 – 500 mM imidazole (pH 7.4), Complete protease inhibitor cocktail – EDTA-free, Phosphatase inhibitor Cocktail 1, 1 mM PMSF (add just prior to use) | Before you begin, it is important to note the concentration gradient of imidazole (50 – 500 mM) and to create separate tubes for each concentration (it is advisable to create the interval using 50 mM increments). Add the reagent to 1x PBS to obtain desired volume of probe buffer | ||
| 3x YEP +6% galactose: Dissolve 30 g of yeast extract and 60 g of peptone in 700 ml of H2O, and autoclave. Add 300 ml of filter sterilized 20% galactose (wt/vol) | Galactose should not be autoclaved |
References
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