Summary
Verwendung von Protein-Mikroarrays enthält fast die gesamte S. cerevisiae Proteom ist für schnelle unvoreingenommene Abfragetausende von Protein-Protein-Wechselwirkungen in parallel sondiert. Dieses Verfahren kann für die Protein-Kleinmolekül, posttranslationale Modifikation und andere Assays mit hohem Durchsatz verwendet werden.
Abstract
Hochdichte funktionelle Protein-Microarrays ~ 4.200 rekombinanten Hefe Proteine enthalten, werden für Kinase-Protein-Protein-Wechselwirkungen unter Verwendung eines affinitätsgereinigten Hefe Kinase-Fusionsproteins, enthaltend ein V5-Epitop-Tag zum Auslesen sucht. Gereinigte Kinase wird durch die Kultur eines Hefestammes für eine hohe Kopienproteinproduktion, der ein Plasmid enthält eine Kinase-V5-Fusionskonstrukt unter einem GAL induzierbarer Promotor optimiert erhalten. Die Hefe wird in restriktiven Medien mit einem neutralen Kohlenstoffquelle für 6 Stunden, gefolgt von der Induktion mit 2% Galactose gezüchtet. Anschließend wird die Kultur geerntet und Kinase unter Verwendung von Standard affinitätschromatographischen Methoden, eine hoch gereinigte Protein-Kinase für die Verwendung in Assays zu erhalten, gereinigt. Die gereinigte Kinase wird mit Kinase-Puffer auf einen geeigneten Bereich für den Test verdünnt, und die Protein-Mikroarrays werden vor der Hybridisierung mit dem Protein-Mikroarray blockiert. Nach der Hybridisierung werden die Arrays mit monoklonalen V5 ANTIB sondiertody um Proteine durch die Kinase-V5-Protein gebunden zu identifizieren. Schließlich werden die Arrays mit einem Standard-Microarray-Scanner abgetastet und Daten für nachgelagerte Informatik Analyse 1,2 extrahiert, um ein hohes Vertrauen Reihe von Protein-Interaktionen für Downstream-Validierung in vivo zu bestimmen.
Introduction
Die Notwendigkeit, die globale Analysen der Proteinbiochemie und Bindungsaktivität in vivo durchzuführen in der Entwicklung neuer Verfahren zum Profilieren von Protein-Protein-Wechselwirkungen (PPI) und die post-translationalen Modifikationen von ganzen Proteomen 1,3-8 geführt. Protein-Mikroarrays werden als funktionelle Protein-Microarrays mit voller Länge funktionelle Proteine 4-6,8,9 oder analytische Protein-Microarrays 10,11 Antikörper enthält, hergestellt. Sie sind so konstruiert, um eine hohe Dichte von Proteinen auf Mikroskop-Objektträgern mit einer Vielzahl von Oberflächenchemie angeordnet enthalten, um eine Vielzahl von zum Leiten von weitreichenden biochemischen Analysen erforderlichen 12 Versuchsbedingungen zu erleichtern. Nitrocellulose und Aldehyd Oberflächenchemie für die chemische Anbindung durch Lysin oder Affinität Befestigungsmethoden, wie beispielsweise Nickel-Chelat-Objektträger zur Befestigung His-markierte Proteine und Glutathion zur Affinitäts Befestigung unter anderem 13. Die Verwendung von funktionellen Protein-Mikroarrays, um Protein-Protein-Interaktionen zu detektieren erfordert den Zugriff auf einen hochwertigen funktionellen Proteinbibliothek 14. S. cerevisiae ist zugänglich Herstellung einer solchen Bibliothek durch die Paarung von hoher Kopienaffinitätsmarkierten Proteinkonstrukte mit Hochdurchsatz-chromatographischen Reinigung Techniken. Die überwiegende Mehrheit des Hefegenoms sequenziert wurde und fast die gesamte Proteoms kann aus einem high-copy-Plasmid zur Reinigung exprimiert und biochemischen Analysen 12. Sobald die Proteine gewonnen und in 384-Well-Format angeordnet sind, werden sie auf einen Objektträger so dass für eine schnelle parallele multiparametrischer biochemische Analytik und Bioinformatik Abfrage 8,14-16 gedruckt. Protein-Mikroarrays für enzymatische Assays und Wechselwirkungen mit Proteinen, Lipiden, kleine Moleküle und Nukleinsäuren, unter vielen anderen Anwendungen eingesetzt. Die Zugänglichkeit von Proteinen auf der Oberfläche des ProteomsAnordnungen machen, sich auf andere Arten von analytischen Nachweis einschließlich Immunaffinitäts, Oberflächenplasmonresonanz, Fluoreszenz und viele andere Techniken. Außerdem ermöglicht sie die Feinsteuerung der experimentellen Bedingungen ab, wo es schwer, in vivo tun.
Ziel dieses Protokolls ist es, die angemessene Verwendung der funktionellen Protein-Microarrays, um Protein-Protein Wechselwirkungen erkennen zu demonstrieren. Diese Anwendung ermöglicht die Hochdurchsatz parallel biochemische Analyse von Protein-Bindungsaktivitäten unter Verwendung eines hoch gereinigten Analyten (Protein) von Interesse. Ein C-terminal (carboxyterminalen) Markierte V5-Fusions-Köderprotein von Interesse aus einem high-copy-Plasmid in einem Hefestamm zur Proteinreinigung optimiert produziert. C-terminalen Markierungs sichergestellt, dass das Volllängen-Protein übersetzt worden ist. Das in dieser Studie verwendete Protein ist TDA1-V5-Fusionsprotein-Kinase, die mit gereinigtem Nickel-Affinitätsharz über eine His6X tag. Die TDA1-V5-Fusions Baut wird durch serielle Elution mit einem Imidazol-Gradienten, um die am stärksten angereicherten Fraktion für den Einsatz im Assay Eluieren gereinigt.
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Protocol
1. Probe Vorbereitung
- Kultur und Reinigung der V5-Fusionskinase-Sonden verwendet werden, um Wechselwirkungen mit anderen Proteinen zu untersuchen, wie folgt:
- Verwenden Sie frisch ausgestrichenen Hefestamm Y258 (MATa pep4-3, his4-580, ura3-53, leu2-3,112), die V5-Fusionsprotein (von GATEWAY Vektor pYES-DEST52 ausgedrückt). Verwenden Sie das isolierte Protein als Sonde für die Mikroarrays. Platte die Hefe auf synthetischem Komplett-Uracil (SC-Ura) / 2% Dextrose / Agar und wachsen bei 30 ° C für 3 Tage aus gefrorenen Kultur (-80 ° C Glycerolstammlösung).
- Impfen Starterkulturen (5-20 ml) aus einer Einzelkolonie und über Nacht wachsen in Sc-Ura / 2% Dextrose auf Schüttelplattform (220-250 rpm) oder Rad bei 30 ° C.
- Am folgenden Morgen inokulieren 400 ml des Sc-Ura / 2% Raffinose Kultur mit ausreichend Starterkultur auf eine endgültige OD 600 von 0,1.
- Wachsen die Impfkulturen bis zu einer OD 600 von 0,6, gefolgt von Galactose-Induktion des V5-Kinase-fusion Konstrukt-Expression durch Zugabe einer Lösung von 3x Hefeextrakt / Pepton (YEP) mit 6% Galactose ergänzt durch Zugabe von genug, um das Induktionsmittel durch einen Faktor von 3 zu verdünnen, so dass die endgültige Konzentration der Galactose beträgt 2%.
- Induzieren Zellen bei 30 ° C für 6 Stunden auf eine schwankende Plattform. Verwenden Sie einen 2 l-Erlenmeyerkolben, angemessene Belüftung sicherzustellen.
- Ernten der Zellen unter Verwendung eines JA-10 (oder vergleichbaren) Rotors durch Drehen mit 400 ml Zellsuspension bei 1.000 g für 5 min bei 4 ° C.
- Mit 50 ml eiskaltem PBS-Puffer und in einen 50-ml konischen Röhrchen Waschen der Zellen einmal. Dann wird noch einmal das Pellet in eiskaltem PBS-Puffer (ohne Reinigungsmittel oder andere Additive) für die Lyse und Transfer zum 2 verwendet ml Röhrchen für die Lyse-Kappe einrasten.
- Drehen Sie die Zellen bei 20.000 · g für 1 min bei 4 ° C zu einem Pellet und Pipette entfernt Puffer.
- Zeigen Röhrchen auf Eis und füllen Lyseschritt.
- Lyse der Zellen (250-350 ul Pellet) mit 00,5 mm Zirkoniumoxidkügelchen in einer 1: 1: 1 Volumen des Zellpellets, Perlen und phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS) Lysepuffer und Wirbel das Gemisch unter Verwendung eines Bewegungsplattform 3 mal in 2 min Intervallen bei 4 ° C.
- Zentrifugieren Sie das Lysat bei 20.000 × g in einer Tischmikrozentrifuge für 10 min bei 4 ° C.
- Pipette Stand in Polycarbonat Hochgeschwindigkeitszentrifugenröhrchen und Klärung durch ulracentrufugation für 30 Minuten bei 150.000 × g bei 4 ° C.
- Übertragen die geklärte Lysat in ein Röhrchen vorgewaschen Ni 2+ Affinitätsharz (~ 100 & mgr; l) und Inkubieren auf einem Nutator für 2 h bei 4 ° C zu erfassen Histidin (His) 6X markierten V5-Fusionsprotein ist.
- Dreimal Waschen des Harzes für 10 Minuten bei 4 ° C mit Waschpuffer. Pelletierung des Harzes unter Verwendung einer Tisch-Zentrifuge 5 min bei 1000 × g bei 4 ° C und saugt den Überstand. In frischem Waschpuffer für jeden Wasch und senden Sie das Rohr Nutatorwinkel für Agitation während der Wäsche.
- Nach dem Wasch steps abgeschlossen sind, wenden die gewaschene Harz in ein frisches G-25-Säule für die Elution.
- Gelten 25 ul Elutionspuffer in einer schrittartigen Weise, beginnend mit 100 mM Imidazol und 500 mM Imidazol in 50 mM Inkremente für insgesamt 9 Fraktionen.
- Assay Die gesammelten Fraktionen mittels Natriumdodecylsulfat-Polyacrylamidgelelektrophorese (SDS-PAGE) und Coomassie-Färbung, um die am stärksten angereicherten Fraktion (en) zur Verwendung in dem Assay zu identifizieren und fügen Glycerin zu 30% und bei -80 ° C bis in den verwendeten Assay.
2. Beobachtung der Arrays
HINWEIS: Bitte beachten Sie Schritt 2.6 dieses Abschnitts, um die Antikörperlösung vor dem Test vorzubereiten.
- Um Wechselwirkungen zu erfassen, verdünnen das V5-Fluorophor konjugierten Antikörper (dh AlexaFluor 647) bis 260 ng / ml in Sondenpuffer und mischen durch Schütteln.
HINWEIS: Bereiten Sie dieses Antikörperlösung 30 Minuten vor der Anwendung und legen Sie den Schlauch auf einem nutatoder oder ein Rad vollständige Vermischung und eine homogene Suspension von Antikörper zu gewährleisten. - Verdünne die V5-Fusionsprotein Sonde über einen Konzentrationsbereich von 5-500 & mgr; g / ml.
HINWEIS: Optimiert für jedes Protein-Protein-Interaktionsassays, mit Sondenpuffer. Optimierung beinhaltet das Hinzufügen von mehr Sonden an Puffer zu sondieren. Typischerweise 10 & mgr; g / ml wird als Ausgangspunkt verwendet und angepasst basierend auf der Signalstärke. - Entfernen der Proteinarrays aus dem Tiefkühler (-20 ° C) und bringen auf 4 ° C im Kühlraum unmittelbar vor der Verwendung.
- In Blocking-Puffer direkt auf die Objektträgerhalter, die die Protein micorarrays und decken den Spitzen mit Parafilm, um ein Auslaufen zu verhindern. Blockieren die Arrays in Blockierungspuffer für 1 Stunde unter Schütteln bei 50 UpM auf einer Stufe bei 4 ° C.
- Nach dem Blockieren übertragen die Arrays einer befeuchteten Kammer auf 4 ° C gekühlt, und geben 90 ul der verdünnten Probe direkt auf der Array-Oberfläche. Überlagern die arrays mit einem erhöhten Schlupf Heber und Inkubation statisch (ohne Schütteln) in der feuchten Kammer bei 4 ° C für 1,5 Std.
- 3 mal in drei 50 ml konische Röhrchen waschen die Arrays für jeweils 1 min in Puffer Sonde. Fügen Sie die Folie, um konische Röhrchen, die genug vorgekühlte Sondenpuffer, um die Folie vollständig umhüllen. Lassen Sie den Lifter Schlupf sanft abrutschen des Proteinmikroarray (keine Gewalt aus, da dies zu Schäden an der Array-Oberfläche zur Folge haben).
- Übernehmen Sie die Antikörper-Lösung direkt auf Array sofort nach Abschluss des Wasch (Schritt 2.5) und Überlagerung mit einem erhöhten Heber Schlupf wie zuvor. Die Arrays 30 min Inkubation bei 4 ° C in der feuchten Kammer.
- Führen die gleiche Waschschritt wie zuvor (3 mal 1 min in Puffer Sonde) und Spin in einem 50 ml konischen Röhrchen bei 800 x g in einer Tischzentrifuge 5 min bei Raumtemperatur. Der Luft trocknen die Arrays in einem Objektträgerhalter in der Dunkelheit für 30 Minuten vor der Anordnung bei 647 nm gescannt.
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Representative Results
Das Protein-Protein-Wechselwirkung-Aktivität wurde mit einem Standard-Chip-Leser zu beurteilen, die TDA1-V5 Protein-Kinase-Fusionskonstrukt als Köderprotein gegen eine Hefe funktionelle Protein-Microarray, das etwa 4.200 einzigartige S. beobachtet cerevisiae GST-Fusionsproteinen. Weitere Abfrage mit der Genepix Software ergab eine Vielzahl von Bindungsereignissen unterschiedlicher Intensität. Die Affinität wurde aus dem abgestuften Intensität des von einem monoklonalen V5-Fluorophor-konjugierten Antikörper zu ihrem Ziel (V5-Kinase) gebunden abgeleiteten Signals gemessen. ProCAT Bewertungsalgorithmus 2 wurde verwendet, um Protein-Protein-Interaktionen über zwei getrennte Protein-Microarrays für jedes der Proteine in Doppelbestimmung zu identifizieren (jedes Protein wird zwei Mal auf dem Array gesichtet), dann eine Schwelle abgeschnitten wurde für Punktwertung der beobachteten Wechselwirkungen bestimmt.
Durch den Vergleich zweier Arrays erhält man 4 technische Replikate (n = 4), das zu verwenden, um zu bestimmen, kann inter-Assay-Variation durch Korrelation (R 2) der zwei Punkte für jedes Protein auf den Arrays. Eine Gesamtzahl von 9 Protein-Protein-Wechselwirkungen zwischen dem TDA1-V5 Köderprotein und die Proteine auf dem Microarray unter Verwendung einer vordefinierten Schwelle zum Identifizieren einzigartigen Proteinkinase Wechselwirkungen 1 identifiziert. Außerdem werden die gleichen Proteine in verschiedenen Positionen in den Arrays als Kontrolle gesichtet, um Oberflächenartefakten, die zu Fehlalarmen beitragen können, zu bewerten. Der Vergleich der mehrere Bindungsprofile verschiedener Kinase-V5-Fusionsproteinen ermöglicht die Identifikation von Kinase-spezifische Protein-Protein-Wechselwirkungen für die Prüfung in vivo.
In diesem Versuch untersuchten wir die Bindungsaktivität von TDA1-V5 und identifizierte mehrere statistisch signifikante PPIs basierend auf von p-Wert gewählt im Vergleich zu anderen Kinasen getestet. Von besonderem Interesse ist Rim11, die als phosphorylierte Ziel TDA1 in einer früher veröffentlichten s identifiziert wurde,tudy 9. Sobald Targets identifiziert worden sind, können sie für die biochemische und funktionelle Aktivität in vivo 1 getestet werden.
Abb. 1: TDA1-V5 im Vergleich zu leeren Vektorkontrolle Yeast Protein-Microarrays in zweifacher Ausfertigung mit ~ 4.200 in voller Länge GST-Fusionsprotein gesichtet wurde mit Kontrolle oder TDA1-V5-Sonden inkubiert. Inset Panel vergleicht die gleiche Region in beiden Arrays. Protein-Protein-Wechselwirkung wurde zwischen Rim11 und TDA1-V5 detektiert (blaue Kästen).
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Discussion
Das Protokoll vorgestellt wurde ursprünglich unter Verwendung von 85 einzigartigen Hefe-Proteinkinase-V5-Fusionsproteinen die Bindungsaktivität gegenüber verschiedenen und verwandte Familien von Hefe-Proteinkinasen, was zur Identifizierung von neuen Kinase-Interaktionsnetz in vivo 1 zu vergleichen. Als aufstrebender Proteom-Profiling-Technologie, die Entwicklung von High Throughput (HTP) Screening der Proteome mit Protein-Microarrays auf Peptidbibliotheken und eukaryotischen und prokaryotischen Modellorganismen 8,17 verlassen; später wurde dieser Assay-Plattform zu höheren Eukaryoten wie Pflanzen und menschlichen 5,7 angewendet. Gegenwärtig gibt es keine im Handel erhältlichen Hefe Protein-Array. Allerdings überprüft Sequenz cDNA Sammlungen sind von mehreren zur Verfügung stehenden Ressourcen
Obwohl die Technik kann stark sein, ist eine Einschränkung zu beachten, dass der Test in vitro durchgeführt, und damit falsch positive Ergebnisse haben. So optimizing Testbedingungen und strategische Filterschema ist ratsam, aussagekräftige Daten abzurufen. Nächste Generation Protein Microarray-Technologien beinhalten eine viel größere Anzahl von hochgereinigtem funktionelle Proteine zur biochemischen Analyse in einer Vielzahl von Organismen, einschließlich A. thaliana, S. cerevisiae, und Homo Sapiens.
Das Niveau der Raffinesse, die die neuen Protein-Mikroarrays haben in sie entworfen ermöglicht eine expansive Vielzahl von biochemischen Analysen, die durchgeführt werden können. Nahezu die gesamte Proteom wurde kloniert und für S. gereinigten cerevisiae unter Verwendung eines C-terminalen tagged Bibliothek richtigen post-translationalen Modifikationen der Proteine 14 zu gewährleisten. Darüber hinaus bot die schnelle parallele Analysen mit Protein-Microarrays ermöglicht eine unvoreingenommene Herangehensweise an Protein-Protein-Interaktion und post-translationale Modifikation Profilierung.
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Petri Dishes | VWR | NC-10747 | or comparable |
| Bacto yeast extract | Difco | 0217-17 | |
| Bacto peptone | Difco | 0118-17 | |
| Bacto agar | Difco | 0140-01 | |
| Dextrose | Sigma | D9434 | |
| Raffinose | Sigma | R0514 | |
| Galactose | Sigma | G0750 | |
| Sc-Ura drop out media | MP Bio | 114410622 | |
| Small Culture tubes | VWR/Fisher | ||
| Large Erlenmeyer Flask | VWR/Fisher | ||
| Centrifuge JA-10 rotor | |||
| Centrifuge tubes (500 ml) | |||
| Falcon tube (50 ml) | VWR/Fisher | 21008-951 | |
| PBS Tablets | Sigma | P4417 | |
| FastPrep Tubes (2 ml screw cap tube) | |||
| FastPrep Machine | MP Biomedicals | 116004500 | |
| Zircon Beads | BioSpec | 11079105 | |
| Triton X100 | Sigma | P4417 | |
| DTT | Sigma | D9779 | |
| MgCl2 | Sigma | M8266 | |
| NaCl | Sigma | S3014 | |
| Imidazole (pH = 7.4) | Sigma | I5513 | |
| PMSF | Sigma | 93482 | |
| Complete Inhibitor Cocktail (EDTA Free) | Roche | 11873580001 | |
| Phosphatase inhibitor cocktail 1 | sigma | P2850 | |
| BSA | Sigma | A2153 | |
| Tween-20 | Sigma | P1379 | |
| ATP | Sigma | A1852 | |
| Shaking Incubator (30 °C) | |||
| Nickel Affinity Resin | Life Technologies | R901-01 | |
| G25 column | GE life sciences | 27-5325-01 | |
| Nutator | VWR/Fisher | ||
| SDS-PAGE Gel (NuPage) | Life Technologies | ||
| Coomassie Blue Stain | Life Technologies | ||
| Monoclonal V5 Antibody | Life Technologies | R960-25 | |
| Alexa647 Tagged monoclonal V5 Antibody | Life Technologies | 451098 | |
| Protein Microarrays Kit | Life Technologies | PAH0525013 | |
| Genepix Scanner | Molecular Devices | ||
| Lifter Slips | Thomas Scientific | http://www.thomassci.com/Supplies/Microscope-Cover-Glass/_/LIFTER-SLIPS/ | |
| Lysis Buffer: 0.1% Triton X-100, 0.5 mM DTT, 2 mM MgCl2, 500 mM NaCl, 50 mM imidazole (pH 7.4), Complete protease inhibitor cocktail – EDTA-free, Phosphatase inhibitor Cocktail 1, 1 mM PMSF (add just prior to use) |
Add the reagents to 1x PBS (0.01 M phosphate buffer, 0.0027 M potassium chloride, 0.137 M sodium chloride; pH 7.4) to obtain the desired volume of lysis solution | ||
| Blocking Buffer: 1% bovine serum albumin (BSA), 0.1% Tween-20 | Add the reagents to 1x PBS to obtain the desired volume of blocking buffer | ||
| Probe Buffer: 2 mM MgCl2, 0.5 mM DTT, 0.05% Triton X-100, 50 mM NaCl, 500 μM ATP (for kinases), 1% BSA | Add the reagent to 1x PBS to obtain desired volume of probe buffer | ||
| Wash Buffer: 0.1% Triton X-100, 500 mM NaCl, 0.5 mM DTT, 50 mM imidazole (pH 7.4),2 mM MgCl2 | Add the reagent to 1x PBS to obtain desired volume of probe buffer | ||
| Elution Buffer: 0.1% Triton X-100, 0.5 mM DTT, 2 mM MgCl2, 500 mM NaCl, 50 – 500 mM imidazole (pH 7.4), Complete protease inhibitor cocktail – EDTA-free, Phosphatase inhibitor Cocktail 1, 1 mM PMSF (add just prior to use) | Before you begin, it is important to note the concentration gradient of imidazole (50 – 500 mM) and to create separate tubes for each concentration (it is advisable to create the interval using 50 mM increments). Add the reagent to 1x PBS to obtain desired volume of probe buffer | ||
| 3x YEP +6% galactose: Dissolve 30 g of yeast extract and 60 g of peptone in 700 ml of H2O, and autoclave. Add 300 ml of filter sterilized 20% galactose (wt/vol) | Galactose should not be autoclaved |
References
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