Summary
El uso de microarrays de proteínas que contienen casi toda la S. cerevisiae proteoma se sondeó para un rápido interrogatorio imparcial de miles de interacciones proteína-proteína en paralelo. Este método puede ser utilizado para la molécula de proteína pequeña, modificación postraduccional, y otros ensayos en alto rendimiento.
Abstract
De alta densidad de microarrays de proteínas funcionales que contienen ~ 4200 proteínas de levadura recombinantes se examinan las interacciones proteína-proteína quinasa utilizando una proteína de fusión purificada por afinidad levadura quinasa que contiene una etiqueta V5-epítopo para leer-out. Quinasa purificada se obtiene mediante cultivo de una cepa de levadura optimizado para la producción de proteínas de copia alto que alberga un plásmido que contiene una fusión de quinasa-V5 construir bajo un promotor inducible GAL. La levadura se cultiva en medios de comunicación restrictiva con una fuente de carbono neutral durante 6 horas seguido de inducción con 2% de galactosa. A continuación, el cultivo se recoge y se purifica usando quinasa de afinidad estándar técnicas cromatográficas para obtener una proteína quinasa altamente purificada para su uso en el ensayo. La quinasa purificada se diluye con tampón de quinasa a un rango apropiado para el ensayo y los microarrays de proteínas están bloqueados antes de la hibridación con el microarray de proteínas. Después de la hibridación, los arreglos se probaron con antib V5 monoclonalody para identificar proteínas unidas por la proteína quinasa-V5. Por último, las matrices se escanean con un escáner de microarrays estándar, y los datos se extrajeron para el análisis de la informática aguas abajo 1,2 para determinar una alta confianza conjunto de interacciones de proteínas para la validación de aguas abajo en vivo.
Introduction
La necesidad de realizar análisis globales de bioquímica de proteínas y la actividad in vivo de unión se ha traducido en el desarrollo de nuevos métodos para perfiles de interacciones proteína-proteína (IBP) y las modificaciones post-traduccionales de proteomas enteros 1,3-8. Microarrays de proteínas se fabrican como los microarrays de proteínas funcionales utilizando proteínas funcionales de larga duración 4-6,8,9 o microarrays de proteínas que contienen anticuerpos analíticos 10,11. Están diseñados para contener una alta densidad de proteínas dispuestas en portaobjetos de microscopio con una variedad de químicas de superficie para facilitar una variedad de condiciones experimentales requeridas para la realización de bioquímica amplio análisis 12. Nitrocelulosa y de superficie aldehído químicas para la unión química a través de métodos de fijación de lisina o de afinidad tales como toboganes quelatos de níquel para la fijación de proteínas etiquetadas-Su y el glutatión para la fijación de afinidad entre otros 13. El uso de microarrays de proteínas funcionales para detectar interacciones proteína-proteína requiere acceso a una biblioteca de alta calidad de proteína funcional 14. S. cerevisiae es susceptible de producir tal una biblioteca a través de la vinculación de la afinidad alta copia etiquetados construcciones de proteínas con alto rendimiento técnicas de purificación cromatográfica. La gran mayoría de genoma de la levadura ha sido secuenciado y casi todo el proteoma puede ser expresada a partir de un plásmido de alta copia para la purificación y análisis bioquímicos 12. Una vez que se obtienen las proteínas y dispuestas en formato de 384 pocillos, que se imprimen en un portaobjetos de microscopio que permite un rápido análisis bioquímico multi-paramétrico paralelo e interrogatorio bioinformático 8,14-16. Microarrays de proteínas se han utilizado para ensayos enzimáticos y de las interacciones con proteínas, lípidos, moléculas pequeñas, y ácidos nucleicos, entre muchas otras aplicaciones. La accesibilidad de las proteínas en la superficie del proteomaarrays los hacen susceptibles a diferentes tipos de detección analítica, incluyendo inmune afinidad, resonancia de plasmón superficial, la fluorescencia y muchas otras técnicas. Además, permite un control preciso de la condición experimental donde podría ser difícil de hacer en vivo.
El objetivo de este protocolo es demostrar el uso apropiado de los microarrays de proteínas funcionales para detectar interacciones proteína-proteína. Esta aplicación permite el análisis bioquímico paralelo de alto rendimiento de las actividades de unión a proteínas utilizando un analito altamente purificada (proteína) de interés. Un C-terminal (carboxi-terminal) etiquetada proteína cebo V5-fusión de interés se produce a partir de un plásmido de alta copia en una cepa de levadura optimizado para la purificación de proteínas. Marcado C-terminal asegura que la proteína de longitud completa se ha traducido. La proteína utilizada en este estudio es Tda1-V5 proteína de fusión de cinasa, que se purificó usando resina de afinidad de níquel a través de una etiqueta His6X. La construc fusión Tda1-V5t se purifica a través de elución serial usando un gradiente de imidazol para eluir la fracción más altamente enriquecido para su uso en el ensayo.
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Protocol
1. Preparación de la sonda
- Cultura y purificar las sondas V5-quinasa de fusión utilizados para examinar las interacciones con otras proteínas como sigue:
- Utilice recién rayada cepa Y258 de levadura (MATa pep4-3, his4-580, ura3-53, leu2-3,112) que contiene proteína V5-fusión (expresado desde GATEWAY vector pYES-DEST52). Utilice la proteína aislada como sonda en los microarrays. Placa de la levadura en completa-uracilo sintético (Sc-Ura) / 2% de dextrosa / Agar y crecer a 30 ° C durante 3 días a partir de cultivo congelado (-80 ° C glicerol).
- Inocular cultivos iniciadores (5-20 ml) de una sola colonia y crecer durante la noche en SC-ura / 2% de dextrosa en agitación plataforma (220-250 rpm) o rueda a 30 ° C.
- A la mañana siguiente, inocular 400 ml de la Sc-Ura / 2% cultura rafinosa con cultivo iniciador suficiente para una DO final de 600 0.1.
- Cultivar los inóculos a OD 600 de 0,6, seguido de galactosa inducción de la fu V5-quinasaSion constructo de expresión mediante la adición de una solución de levadura Extracto de 3x / peptona (YEP) suplementado con 6% de galactosa, mediante la adición de suficiente para diluir los medios de inducción por un factor de 3 para que concentración final de galactosa es 2%.
- Inducir a las células a 30 ° C durante 6 horas en una plataforma de agitación. Utilice un matraz de 2 L Erlenmeyer para asegurar la aireación adecuada.
- Cosecha células utilizando un rotor JA-10 (o comparable) haciendo girar 400 ml de suspensión celular a 1000 xg durante 5 min a 4 ° C.
- Se lavan las células una vez con 50 ml de hielo búfer y transferir a un tubo cónico de 50 ml de PBS frío. Lavar el pellet de nuevo en hielo tampón PBS frío (sin detergentes u otros aditivos) que se utilizan para la lisis y traslado a 2 ml complemento tapa tubos para la lisis.
- Girar las células a 20.000 xg durante 1 min a 4 ° C en un precipitado y pipeta de distancia el búfer.
- Coloque los tubos en hielo y continúe con el paso de lisis.
- Lyse las células (250-350 l pellet) con 00,5 mm perlas de óxido de circonio en una proporción 1: 1: 1 volumen de sedimento celular, cuentas, y solución salina tamponada con fosfato (PBS) lisis de amortiguación y agitar la mezcla usando una plataforma de agitación 3 veces a intervalos de 2 min a 4 ° C.
- Centrifugar el lisado a 20.000 xg en una microcentrífuga de sobremesa durante 10 min a 4 ° C.
- Pipeta sobrenadante en el tubo de centrífuga de policarbonato de alta velocidad y aclarar por ulracentrufugation durante 30 minutos a 150.000 xg a 4 ° C.
- Transferir el lisado aclarado a un tubo que contiene resina de Ni 2+ prelavado afinidad (~ 100 l) y se incuba en un nutator durante 2 horas a 4 ° C para capturar histidina (His) 6X proteína marcada V5-fusión.
- Lavar la resina tres veces durante 10 minutos a 4 ° C con tampón de lavado. Se precipitan la resina usando una centrífuga de mesa durante 5 min a 1000 xg a 4 ° C y aspirar el sobrenadante. Añadir tampón de lavado fresca para cada lavado y devolver el tubo de la nutator para la agitación durante el lavado.
- Después del lavado steps son completos, aplicar la resina se lava a una columna fresca G-25 para la elución.
- Aplicar 25 l de tampón de elución de una manera paso a paso empezando con 100 mM de imidazol a 500 mM de imidazol en incrementos de 50 mm para un total de 9 fracciones.
- Ensayo de fracciones recogidas usando gel de poliacrilamida dodecil sulfato sódico (SDS-PAGE) y tinción de Coomassie para identificar la fracción (s) más altamente enriquecido para uso en el ensayo y añadir glicerol al 30% y se almacena a -80 ° C hasta su uso en el ensayo.
2. Sondeo los Arrays
NOTA: Por favor consulte el paso 2.6 de esta sección para preparar la solución de anticuerpos antes de comenzar el ensayo.
- Para detectar interacciones, diluir el anticuerpo conjugado-V5 fluoróforo (es decir AlexaFluor 647) a 260 ng / ml en tampón sonda y mezclar bien por agitación.
NOTA: Preparar esta solución de anticuerpo 30 min antes de su uso y colocar el tubo en un nutato o rueda para asegurar una mezcla completa y una suspensión homogénea de anticuerpos. - Diluir la sonda proteína V5-fusión en un rango de concentración de 5-500 g / ml.
NOTA: Optimizado para cada ensayo interacción proteína-proteína, utilizando tampón sonda. Optimización implica la adición de más sondas para sondear tampón. Típicamente 10 mg / ml se utiliza como punto de partida y ajusta en consecuencia sobre la base de la intensidad de la señal. - Retire los microarrays de proteínas del congelador (-20 ° C) y llevar a 4 ° C en el refrigerador justo antes de su uso.
- Añadir tampón de bloqueo directamente al soporte de diapositivas que contiene los micorarrays proteínas y cubrir la parte superior con parafilm para evitar fugas. Bloquear las matrices en tampón de bloqueo durante 1 hr por agitación a 50 rpm en un escenario a 4 ° C.
- Después del bloqueo, transferir los arrays a una cámara humidificada enfriado a 4 ° C, y añadir 90 l de sonda diluida directamente a la superficie de la matriz. Superposición del arrays con un resbalón elevador levantado e incubar estática (sin agitación) en la cámara húmeda a 4 ° C durante 1,5 horas.
- Lavar las matrices 3 veces durante 1 min cada uno en tampón de sonda en tres tubos de 50 ml cónicos. Añadir la diapositiva para tubos cónicos que contienen suficiente búfer sonda pre-enfriado para envolver completamente el portaobjetos. Deje que el deslizamiento elevador se deslice suavemente fuera de los microarrays de proteínas (no lo fuerce fuera ya que esto podría causar daños a la superficie de la matriz).
- Aplicar la solución de anticuerpos directamente a la matriz inmediatamente después de completar el lavado (paso 2.5) y la superposición con una hoja de levantador planteado como antes. Incubar las matrices de 30 min a 4 ° C en la cámara de humidificado.
- Realice el mismo paso de lavado como antes (3 veces 1 min en tampón de sonda), y centrifugado en un tubo cónico de 50 ml a 800 xg en una centrífuga de mesa durante 5 min a temperatura ambiente. Seque las matrices en un soporte de diapositivas en la oscuridad durante 30 minutos antes de la exploración de la matriz en 647 nm.
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Representative Results
Se observó la actividad de interacción proteína-proteína usando un lector de chip estándar para evaluar la fusión de la proteína quinasa Tda1-V5 constructo como una proteína de cebo contra una levadura de microarrays proteína funcional que contiene aproximadamente 4.200 única S. las proteínas de fusión GST cerevisiae. Además de interrogación con el software Genepix reveló una multitud de eventos de diferentes intensidades de unión. La afinidad se mide a partir de la intensidad graduada de la señal derivada de un anticuerpo monoclonal V5-fluoróforo conjugado anticuerpo unida a su diana (V5-quinasa). ProCAT algoritmo de puntuación 2 se utilizó para identificar las interacciones proteína-proteína a través de dos microarrays de proteínas separadas para cada una de las proteínas ensayadas por duplicado (cada proteína se detecta dos veces en la matriz), a continuación, un umbral de corte se determinó al eliminar las interacciones observadas.
Al comparar dos matrices que se obtienen 4 técnicos repeticiones (n = 4), que pueden utilizar para determinar intvariación er-ensayo a través de correlación (R 2) de los dos puntos para cada proteína en las matrices. Se identificaron un total de 9 interacciones proteína-proteína entre la proteína cebo Tda1-V5 y las proteínas en el microarray utilizando un umbral predefinido para la identificación de proteínas únicas interacciones quinasa 1. Por otra parte, las mismas proteínas se detectaron en diferentes posiciones a lo largo de las matrices como un control para evaluar los artefactos superficiales que pueden contribuir a falsos positivos. La comparación de múltiples perfiles de unión de diferentes proteínas de fusión de quinasa-V5 permite la identificación de quinasa específica interacciones proteína-proteína para las pruebas in vivo.
En este experimento se probó la actividad de unión de Tda1-V5 y se identificaron varios IBP estadísticamente significativas basadas en clasificados en orden de p-valor en comparación con otras quinasas ensayadas. De particular interés es Rim11, que ha sido identificado como un objetivo fosforilada de Tda1 en un s anterior publicadatudy 9. Una vez que los objetivos han sido identificados, pueden ser probados para la actividad bioquímica y funcional in vivo 1.
Figura 1:. Tda1-V5 en comparación con el control del vector vacío microarrays de proteínas de levadura manchado por duplicado con ~ 4200 proteína de fusión GST longitud completa se incubó con el control o sondas Tda1-V5. Panel de Inserción compara la región idéntica en ambas matrices. Interacción proteína-proteína se detectó (cajas azules) entre Rim11 y Tda1-V5.
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Discussion
El protocolo presentado se realizó originalmente con 85 proteínas únicas fusión quinasa-V5 de proteínas de levadura para comparar la actividad de unión a través de familias distintas y relacionadas de quinasas de proteínas de levadura que resulta en la identificación de nuevas redes de interacción quinasa in vivo 1. Como la tecnología de perfiles proteómicos emergentes, el desarrollo de alto rendimiento (HTP) proyección de proteomas utilizando microarrays de proteínas confiado en bibliotecas de péptidos y eucariotas y procariotas organismos modelo 8,17; después, esta plataforma de ensayo se aplicó a eucariotas superiores tales como plantas y 5,7 humano. Actualmente no existe una matriz de proteína de levadura disponibles comercialmente. Sin embargo, la secuencia verificada colecciones de cDNA están disponibles a partir de múltiples recursos
Aunque la técnica puede ser de gran alcance, una advertencia a tener en cuenta es que el ensayo se realiza in vitro, y, por tanto, los resultados tendrán falsos positivos. Por lo tanto, optimizing condición de ensayo y el esquema de filtrado estratégica es aconsejable para recuperar datos significativos. Tecnologías de microarrays de proteínas de próxima generación contienen un número mucho mayor de proteínas funcionales altamente purificados para el análisis bioquímico a través de una multitud de organismos incluyendo A. thaliana, S. cerevisiae y el Homo Sapiens.
El nivel de sofisticación que los nuevos microarrays de proteínas han diseñado en ellos permite una variedad amplia de análisis bioquímicos que se pueden realizar. Casi todo el proteoma se ha clonado y purificada para S. cerevisiae utilizando una biblioteca etiquetada C-terminal para asegurar la modificación post-traduccional correcto de las proteínas 14. Por otra parte, los análisis paralelos rápidos ofrecen utilizando microarrays de proteínas permite un enfoque imparcial a la interacción proteína-proteína y perfilado modificación post-traduccional.
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Petri Dishes | VWR | NC-10747 | or comparable |
| Bacto yeast extract | Difco | 0217-17 | |
| Bacto peptone | Difco | 0118-17 | |
| Bacto agar | Difco | 0140-01 | |
| Dextrose | Sigma | D9434 | |
| Raffinose | Sigma | R0514 | |
| Galactose | Sigma | G0750 | |
| Sc-Ura drop out media | MP Bio | 114410622 | |
| Small Culture tubes | VWR/Fisher | ||
| Large Erlenmeyer Flask | VWR/Fisher | ||
| Centrifuge JA-10 rotor | |||
| Centrifuge tubes (500 ml) | |||
| Falcon tube (50 ml) | VWR/Fisher | 21008-951 | |
| PBS Tablets | Sigma | P4417 | |
| FastPrep Tubes (2 ml screw cap tube) | |||
| FastPrep Machine | MP Biomedicals | 116004500 | |
| Zircon Beads | BioSpec | 11079105 | |
| Triton X100 | Sigma | P4417 | |
| DTT | Sigma | D9779 | |
| MgCl2 | Sigma | M8266 | |
| NaCl | Sigma | S3014 | |
| Imidazole (pH = 7.4) | Sigma | I5513 | |
| PMSF | Sigma | 93482 | |
| Complete Inhibitor Cocktail (EDTA Free) | Roche | 11873580001 | |
| Phosphatase inhibitor cocktail 1 | sigma | P2850 | |
| BSA | Sigma | A2153 | |
| Tween-20 | Sigma | P1379 | |
| ATP | Sigma | A1852 | |
| Shaking Incubator (30 °C) | |||
| Nickel Affinity Resin | Life Technologies | R901-01 | |
| G25 column | GE life sciences | 27-5325-01 | |
| Nutator | VWR/Fisher | ||
| SDS-PAGE Gel (NuPage) | Life Technologies | ||
| Coomassie Blue Stain | Life Technologies | ||
| Monoclonal V5 Antibody | Life Technologies | R960-25 | |
| Alexa647 Tagged monoclonal V5 Antibody | Life Technologies | 451098 | |
| Protein Microarrays Kit | Life Technologies | PAH0525013 | |
| Genepix Scanner | Molecular Devices | ||
| Lifter Slips | Thomas Scientific | http://www.thomassci.com/Supplies/Microscope-Cover-Glass/_/LIFTER-SLIPS/ | |
| Lysis Buffer: 0.1% Triton X-100, 0.5 mM DTT, 2 mM MgCl2, 500 mM NaCl, 50 mM imidazole (pH 7.4), Complete protease inhibitor cocktail – EDTA-free, Phosphatase inhibitor Cocktail 1, 1 mM PMSF (add just prior to use) |
Add the reagents to 1x PBS (0.01 M phosphate buffer, 0.0027 M potassium chloride, 0.137 M sodium chloride; pH 7.4) to obtain the desired volume of lysis solution | ||
| Blocking Buffer: 1% bovine serum albumin (BSA), 0.1% Tween-20 | Add the reagents to 1x PBS to obtain the desired volume of blocking buffer | ||
| Probe Buffer: 2 mM MgCl2, 0.5 mM DTT, 0.05% Triton X-100, 50 mM NaCl, 500 μM ATP (for kinases), 1% BSA | Add the reagent to 1x PBS to obtain desired volume of probe buffer | ||
| Wash Buffer: 0.1% Triton X-100, 500 mM NaCl, 0.5 mM DTT, 50 mM imidazole (pH 7.4),2 mM MgCl2 | Add the reagent to 1x PBS to obtain desired volume of probe buffer | ||
| Elution Buffer: 0.1% Triton X-100, 0.5 mM DTT, 2 mM MgCl2, 500 mM NaCl, 50 – 500 mM imidazole (pH 7.4), Complete protease inhibitor cocktail – EDTA-free, Phosphatase inhibitor Cocktail 1, 1 mM PMSF (add just prior to use) | Before you begin, it is important to note the concentration gradient of imidazole (50 – 500 mM) and to create separate tubes for each concentration (it is advisable to create the interval using 50 mM increments). Add the reagent to 1x PBS to obtain desired volume of probe buffer | ||
| 3x YEP +6% galactose: Dissolve 30 g of yeast extract and 60 g of peptone in 700 ml of H2O, and autoclave. Add 300 ml of filter sterilized 20% galactose (wt/vol) | Galactose should not be autoclaved |
References
- Fasolo, J., et al. Diverse protein kinase interactions identified by protein microarrays reveal novel connections between cellular processes. Genes. 25, 767-778 (2011).
- Zhu, X., Gerstein, M., Snyder, M. ProCAT: a data analysis approach for protein microarrays. Genome biology. 7, R110 (2006).
- Breitkreutz, A., et al. A global protein kinase and phosphatase interaction network in yeast. Science. 328, 1043-1046 (2010).
- Gavin, A. C., et al. Functional organization of the yeast proteome by systematic analysis of protein complexes. Nature. 415, 141-147 (2002).
- Jeong, J. S., et al. Rapid identification of monospecific monoclonal antibodies using a human proteome microarray. Mol Cell Proteomics. 11 (6), (2012).
- Krogan, N. J., et al. Global landscape of protein complexes in the yeast Saccharomyces cerevisiae. Nature. 440, 637-643 (2006).
- Popescu, S. C., et al. Differential binding of calmodulin-related proteins to their targets revealed through high-density Arabidopsis protein microarrays. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 104, 4730-4735 (2007).
- Zhu, H., et al. Global analysis of protein activities using proteome chips. Science. 293, 2101-2105 (2001).
- Ptacek, J., et al. Global analysis of protein phosphorylation in yeast. Nature. 438, 679-684 (2005).
- Haab, B. B. Antibody arrays in cancer research. Molecular & cellular proteomics. Mol Cell Proteomics. 4 (4), 377-383 (2005).
- Kopf, E., Zharhary, D. Antibody arrays--an emerging tool in cancer proteomics. The international journal of biochemistry & cell biology. 39, 1305-1317 (2007).
- Berrade, L., Garcia, A. E., Camarero, J. A. Protein microarrays: novel developments and applications. Pharmaceutical research. 28, 1480-1499 (2011).
- Balboni, I., Limb, C., Tenenbaum, J. D., Utz, P. J. Evaluation of microarray surfaces and arraying parameters for autoantibody profiling. Proteomics. 8, 3443-3449 (2008).
- Gelperin, D. M., et al. Biochemical and genetic analysis of the yeast proteome with a movable ORF collection. Genes & development. 19, 2816-2826 (2005).
- Fasolo, J., Snyder, M. Protein microarrays. Methods Mol. Biol. 548, 209-222 (2009).
- Im, H., Snyder, M., et al. Preparation of recombinant protein spotted arrays for proteome-wide identification of kinase targets. Current protocols in protein science. Coligan, J. E. 27, Unit 27 24 (2013).
- MacBeath, G., Schreiber, S. L. Printing proteins as microarrays for high-throughput function determination. Science. 289, 1760-1763 (2000).
