Summary
使用含有几乎整个S.蛋白质芯片酵母蛋白质组被探查以十万计的蛋白质-蛋白质相互作用中并行快速无偏询问。这种方法可以用于蛋白质 - 小分子，翻译后修饰，并在高通量其它测定。
Abstract
含〜4200重组酵母蛋白的高密度功能蛋白微阵列检查使用含有用于读出一个V5表位标签的亲和纯化的酵母激酶融合蛋白激酶蛋白质 - 蛋白质相互作用。纯化激酶通过酵母菌株的高仿蛋白质生产带有含下GAL诱导启动子激酶-V5融合构建的质粒优化培养获得。酵母生长在限制性培养基用中性碳源为6小时，随后通过感应用2％半乳糖。接着，将培养物收获和激酶用标准亲和层析技术来获得用于在测定中使用高度纯化的蛋白激酶纯化。将纯化的激酶稀释激酶缓冲到一个适当的范围内用于测定和蛋白微阵列被阻断之前与蛋白质微阵列杂交。该杂交后，阵列探测用单克隆V5 antibODY鉴定蛋白质结合的由激酶-V5蛋白。最后，该阵列是利用标准的微阵列扫描仪扫描，并且数据被提取用于下游信息学分析1,2，以确定高置信度设置蛋白质相互作用的体内下游验证。
Introduction
执行蛋白质生物化学和结合的体内活性的全局分析的需要已导致对分析蛋白质-蛋白质相互作用（质子泵抑制剂）和整个蛋白质组1,3-8的翻译后修饰的新方法的发展。蛋白质微阵列被制造为包含抗体10,11-功能蛋白微阵列使用全长功能蛋白4-6,8,9，或分析蛋白质微阵列。它们被加工成含有高密度排列到显微镜载玻片用各种表面化学的蛋白，以促进所需的多种用于进行广泛的生化分析12的实验条件。硝化纤维素和醛的表面化学进行化学附着，通过赖氨酸或亲和力连接方法如镍螯合载玻片用于附His标签的蛋白质，谷胱甘肽对除其他13亲和力附件。 使用功能的蛋白质微阵列来检测蛋白质-蛋白质相互作用，需要获得一个高质量的功能性蛋白质库14。S.酵母是适合于通过高拷贝亲和力配对产生这样的库标记蛋白构建与高通量色谱纯化技术。酵母基因组的绝大部分已测序，几乎整个蛋白质组可以从高拷贝质粒纯化被表达和生化分析12。一旦蛋白被获得并排列在384孔格式，它们被打印到载玻片允许快速并行多参数生化分析和生物信息学的询问8,14-16。蛋白质微阵列已经用于酶测定和相互作用与蛋白质，脂质，小分子和核酸中的许多其它应用。蛋白质的蛋白质组的表面上的辅助阵列使得它们适合于不同类型的分析检测的，包括免疫亲和，表面等离子体共振，荧光技术及其他技术。此外，它允许精细控制的实验条件下在那里它可能是很难做到的体内 。
该协议的目的是要证明的适当使用的功能性蛋白微阵列来检测蛋白质 - 蛋白质相互作用。此应用程序的使用的兴趣高度纯化的分析物（蛋白质）的蛋白质结合活性的高通量平行生化分析。 C-末端（羧基末端）标记的感兴趣的V5融合诱饵蛋白从在酵母菌株的蛋白质纯化优化的高拷贝质粒制备。 C-末端标记确保了全长蛋白质被翻译。在这项研究中使用的蛋白质是Tda1-V5融合蛋白激酶，其使用镍亲和树脂经由His6X标签纯化。该Tda1-V5融合construct为通过串行洗脱使用咪唑梯度洗脱最高度富集的馏分在测定法中使用纯化。
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Protocol
1.探针制备
- 文化与净化用来检查与其他蛋白质的相互作用如下V5融合激酶探头：
- 用新鲜挑染酵母菌株Y258（的MATa pep4-3，his4-580，ura3-53，leu2-3,112）含V5融合蛋白（从GATEWAY载体pYES-DEST52表示）。使用分离的蛋白质作为探针上的微阵列。板上完全合成 - 尿嘧啶（SC-URA）/ 2％葡萄糖/琼脂酵母和生长在30℃下从冷冻培养（-80℃的甘油原液）3天。
- 从单个菌落接种起子培养（5-20毫升）和上摇动平台（220-250转）或车轮在30℃在钪浦/ 2％葡萄糖生长过夜。
- 第二天早晨，接种将400ml钪浦/ 2％棉子糖与足够起子培养培养物至最终OD 600为0.1。
- 成长到接种OD 600为0.6接着半乳糖诱导V5激酶福锡永构建表达通过添加3×酵母提取物/蛋白胨（YEP）补充有6％的半乳糖的溶液中，通过添加足够的由3倍稀释的诱导培养基，以便半乳糖的那个最终浓度为2％。
- 诱导细胞在30℃下进行6小时的摇动平台上。使用2升锥形瓶中，以保证适当的通风。
- 使用JA-10（或可比）转子通过纺丝400毫升细胞悬浮液在1000×g离心5分钟，在4℃下收获细胞。
- 用50ml冰冷的PBS缓冲液并转移至50ml锥形管一次洗细胞。在冰冷的PBS缓冲液再次洗涤沉淀（没有清洁剂或其它添加剂），用于裂解和转移至2ml单元帽管裂解。
- 在4℃旋转细胞在20,000×g离心1分钟以粒料和吸管离开缓冲区。
- 管放置在冰上进行裂解步骤。
- 裂解细胞（250-350微升粒料）用01：在1.5 1mm的氧化锆珠粒1体积细胞沉淀，珠子，和磷酸盐缓冲盐水（PBS）的裂解缓冲液，涡旋使用搅动平台3次将混合物在2分钟的间隔在4℃。
- 离心裂解物在20,000×g离心在台式微量离心机，在4℃下10分钟。
- 吸管上清液进聚碳酸酯高速离心管中并通过ulracentrufugation以150,000×g离心澄清30分钟，在4℃。
- 转移的澄清的裂解物，以含有预洗涤的Ni 2+亲和树脂（〜100微升）的管和孵育在章动器2小时，在4℃下以捕获组氨酸（His）的6X标记V5-融合蛋白。
- 为10分钟，在4℃下用洗涤缓冲液洗树脂三次。沉淀用台式离心机5分钟的树脂在1000 xg离心在4℃下并吸出上清液。加入新鲜的洗涤缓冲液，每次洗涤和洗涤过程中返回管中的章动器的搅拌。
- 洗净后，STEps的是完整的，应用该洗涤树脂至新的G-25柱洗脱。
- 申请25微升洗脱缓冲液中逐步的方式开始用100mM咪唑到500mM咪唑的50mM增量为总共9馏分。
- 利用十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶测定所收集的级分（SDS-PAGE）和考马斯染色来确定最高度富集的馏分（秒）测定中使用，并添加甘油至30％，并储存于-80℃直至在使用检测。
2.在探测阵列
注：请参阅本节的步骤2.6开始试验前的准备抗体溶液。
- 为了检测的相互作用，稀释V5-荧光团缀合的抗体（ 即 AlexaFluor 647），以在探针缓冲器260纳克/毫升和振荡调匀。
注：准备该抗体溶液30分钟，在使用前和将管上的nutat或者或轮，以确保完全混合和抗体的均匀悬浮液。 - 稀释V5-融合蛋白探针，5-500微克/ ml的浓度范围。
注：优化每个蛋白质 - 蛋白质相互作用测定法中，使用探针的缓冲区。优化涉及增加更多的探针探测缓冲区。通常为10微克/毫升作为起点，并相应地根据信号强度调整。 - 从冰箱中（-20℃）除去蛋白质芯片和带至4℃的冰箱在使用之前。
- 直接添加封闭缓冲液到含有蛋白质micorarrays载玻片支架和盖顶用石蜡膜，防止泄漏。通过在50rpm在舞台上，在4℃振荡方框在封闭缓冲液中进行1小时的阵列。
- 封闭后，将阵列转移到湿润的腔室冷却至4℃，并加入90微升稀释的探针直接到阵列表面。叠加的ARR带有凸起挺杆滑AYS孵育静态（无晃动）在加湿室中在4℃下1.5小时。
- 在探针缓冲器在三个50ml锥形管中的每个1分钟洗阵列3次。滑动添加到含有足够预冷探针缓冲器完全包住滑动锥形管。允许升降滑轻轻滑落的蛋白质微阵列（不要强迫它关闭，因为这可能会导致损坏阵列表面）。
- 作为前完成清洗（步骤2.5），并覆盖有凸起的防滑起苗后立即申请直接抗体溶液阵列。在加湿室中孵育阵列30分钟，在4℃。
- 在台式离心机5分钟在室温下以800×g离心执行相同的洗涤步骤之前（3次1在探针缓冲min），而旋在50ml锥形管中。风干在滑动保持器阵列在黑暗中以扫描该阵列在647毫微米之前30分钟。
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Representative Results
使用标准的芯片读取器，以评估Tda1-V5蛋白激酶融合构建体对含有约4200独特S.酵母功能性蛋白微阵列诱饵蛋白质的蛋白质-蛋白质相互作用的活性，观察酵母 GST-融合蛋白。与Genepix软件进一步审讯发现多种结合不同强度的活动。的亲和力从单克隆V5-荧光团缀合的抗体结合至其靶（V5-激酶）导出的信号的梯度强度衡量。 ProCat评分算法2用于鉴定蛋白质-蛋白质相互作用跨两个单独的蛋白微阵列的每个测定一式两份的蛋白（每种蛋白在阵列上点样两次），然后一个阈切断物为计分观察到的相互作用确定。
通过比较两个数组可以得到4技术复制（N = 4），可以用它来确定INT通过相关ER-分析误差的两个点上的每个阵列蛋白质（R 2）。总共9蛋白质-蛋白质相互作用进行鉴定Tda1-V5诱饵蛋白，并使用预定的阈值用于识别独特的蛋白激酶相互作用1上的微阵列的蛋白质之间。此外，同样的蛋白质被发现在整个阵列作为控制不同的位置来评估表面假象，可能会导致误报。的不同激酶的V5融合蛋白的多结合谱的比较使得能够特异性激酶蛋白质-蛋白质相互作用进行检测体内的标识。
在这个实验中，我们测试Tda1-V5的结合活性，并确定基于由p值排名相比测试其它激酶几个统计学显著质子泵抑制剂。特别感兴趣的是Rim11，这已被确定为Tda1的在先前公布的s的磷酸化靶tudy 9。一旦目标已经确定，它们可以被用于生化和功能活性在体内 1进行测试。
图1：Tda1-V5相比空载体对照酵母蛋白质微阵列点样两份以〜4200全长GST融合蛋白温育与对照或Tda1-V5探针。嵌入面板在两个数组比较相同的地区。蛋白质相互作用检测Rim11和Tda1-V5之间（蓝色框）。
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Discussion
提出最初执行使用85独特酵母蛋白激酶-V5融合蛋白进行比较跨越导致新激酶相互作用网络体内 1的识别酵母蛋白激酶不同及相关家族结合活性的协议。作为一个新兴的蛋白质组学分析技术，高通量（HTP）使用蛋白质微阵列依靠肽库，和真核和原核模式生物蛋白质组8,17筛选的发展;后来，这个实验平台应用于高等真核生物如植物和人类5,7。目前还没有商业上可得到的酵母蛋白质阵列。然而，验证序列的cDNA的集合都可以从多个资源
虽然该技术可厉害了，一个警告要牢记的是，该试验是在体外完成，并因此结果将有误报。因此，optimizin摹试验条件和战略滤波方案是可取的检索有意义的数据。下一代蛋白质微阵列技术包含跨越多种生物，包括A的高度纯化的功能蛋白进行生化分析的大得多的数目拟南芥属，酿酒酵母和智人Sapien的 。
一种成熟的新蛋白质微阵列已工程改造入他们的水平使一个膨胀各种可以进行的生化分析的。几乎整个蛋白质组已被克隆，并纯化为S.用酵母 C末端标记的文库，以保证蛋白14的适当的翻译后修饰。此外，快速并行分析提供使用蛋白质微阵列使得能够无偏方法蛋白质 - 蛋白质相互作用和翻译后修饰剖析。
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Petri Dishes | VWR | NC-10747 | or comparable |
| Bacto yeast extract | Difco | 0217-17 | |
| Bacto peptone | Difco | 0118-17 | |
| Bacto agar | Difco | 0140-01 | |
| Dextrose | Sigma | D9434 | |
| Raffinose | Sigma | R0514 | |
| Galactose | Sigma | G0750 | |
| Sc-Ura drop out media | MP Bio | 114410622 | |
| Small Culture tubes | VWR/Fisher | ||
| Large Erlenmeyer Flask | VWR/Fisher | ||
| Centrifuge JA-10 rotor | |||
| Centrifuge tubes (500 ml) | |||
| Falcon tube (50 ml) | VWR/Fisher | 21008-951 | |
| PBS Tablets | Sigma | P4417 | |
| FastPrep Tubes (2 ml screw cap tube) | |||
| FastPrep Machine | MP Biomedicals | 116004500 | |
| Zircon Beads | BioSpec | 11079105 | |
| Triton X100 | Sigma | P4417 | |
| DTT | Sigma | D9779 | |
| MgCl2 | Sigma | M8266 | |
| NaCl | Sigma | S3014 | |
| Imidazole (pH = 7.4) | Sigma | I5513 | |
| PMSF | Sigma | 93482 | |
| Complete Inhibitor Cocktail (EDTA Free) | Roche | 11873580001 | |
| Phosphatase inhibitor cocktail 1 | sigma | P2850 | |
| BSA | Sigma | A2153 | |
| Tween-20 | Sigma | P1379 | |
| ATP | Sigma | A1852 | |
| Shaking Incubator (30 °C) | |||
| Nickel Affinity Resin | Life Technologies | R901-01 | |
| G25 column | GE life sciences | 27-5325-01 | |
| Nutator | VWR/Fisher | ||
| SDS-PAGE Gel (NuPage) | Life Technologies | ||
| Coomassie Blue Stain | Life Technologies | ||
| Monoclonal V5 Antibody | Life Technologies | R960-25 | |
| Alexa647 Tagged monoclonal V5 Antibody | Life Technologies | 451098 | |
| Protein Microarrays Kit | Life Technologies | PAH0525013 | |
| Genepix Scanner | Molecular Devices | ||
| Lifter Slips | Thomas Scientific | http://www.thomassci.com/Supplies/Microscope-Cover-Glass/_/LIFTER-SLIPS/ | |
| Lysis Buffer: 0.1% Triton X-100, 0.5 mM DTT, 2 mM MgCl2, 500 mM NaCl, 50 mM imidazole (pH 7.4), Complete protease inhibitor cocktail – EDTA-free, Phosphatase inhibitor Cocktail 1, 1 mM PMSF (add just prior to use) |
Add the reagents to 1x PBS (0.01 M phosphate buffer, 0.0027 M potassium chloride, 0.137 M sodium chloride; pH 7.4) to obtain the desired volume of lysis solution | ||
| Blocking Buffer: 1% bovine serum albumin (BSA), 0.1% Tween-20 | Add the reagents to 1x PBS to obtain the desired volume of blocking buffer | ||
| Probe Buffer: 2 mM MgCl2, 0.5 mM DTT, 0.05% Triton X-100, 50 mM NaCl, 500 μM ATP (for kinases), 1% BSA | Add the reagent to 1x PBS to obtain desired volume of probe buffer | ||
| Wash Buffer: 0.1% Triton X-100, 500 mM NaCl, 0.5 mM DTT, 50 mM imidazole (pH 7.4),2 mM MgCl2 | Add the reagent to 1x PBS to obtain desired volume of probe buffer | ||
| Elution Buffer: 0.1% Triton X-100, 0.5 mM DTT, 2 mM MgCl2, 500 mM NaCl, 50 – 500 mM imidazole (pH 7.4), Complete protease inhibitor cocktail – EDTA-free, Phosphatase inhibitor Cocktail 1, 1 mM PMSF (add just prior to use) | Before you begin, it is important to note the concentration gradient of imidazole (50 – 500 mM) and to create separate tubes for each concentration (it is advisable to create the interval using 50 mM increments). Add the reagent to 1x PBS to obtain desired volume of probe buffer | ||
| 3x YEP +6% galactose: Dissolve 30 g of yeast extract and 60 g of peptone in 700 ml of H2O, and autoclave. Add 300 ml of filter sterilized 20% galactose (wt/vol) | Galactose should not be autoclaved |
References
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