Summary
Использование белковых микрочипов, содержащих почти всю С. Cerevisiae протеом зондируют для быстрого объективной допроса тысяч белок-белковых взаимодействий в параллель. Этот метод может быть использован для белка-малая молекула, посттрансляционной модификации, и других анализов в высокой пропускной.
Abstract
Функциональный белок-микрочипов высокой плотности, содержащие ~ 4200 рекомбинантные белки дрожжей проверяются на киназы белок-белковых взаимодействий с использованием гибридного белка аффинной очистке дрожжи киназы, содержащий тег V5-эпитоп для считывания. Очищенный киназа получена через культуры штамма дрожжей, оптимизированной для производства белка с высоким копирования содержащего плазмиду, содержащую слитый киназы-V5 построить под GAL индуцируемого промотора. Дрожжи выращивали в средах с ограничительной нейтрального источника углерода в течение 6 ч, затем по индукции с 2% галактозы. Далее, культура собирают и киназы очищают с использованием стандартных аффинных хроматографических методов для получения высокоочищенного протеинкиназу для использования в анализе. Очищенный киназы разбавляют киназного буфера с соответствующим диапазоном для анализа и белковых чипов заблокированы до гибридизации с белком микрочипов. После гибридизации, массивы зондируют моноклональное V5 АнтибODY для идентификации белков, связанных с протеинкиназой V5. Наконец, массивы будут отсканированы с использованием стандартных микрочипов сканер, и данные извлекаются для анализа вниз по течению информатики 1,2, чтобы определить высокое доверие набор белковых взаимодействий для последующего утверждения в естественных условиях.
Introduction
Необходимость проведения глобальных анализов биохимии белков и активность связывания в естественных условиях привело к разработке новых методов профилирования белок-белковых взаимодействий (ИЦП) и пост-трансляционные модификации целых протеомов 1,3-8. Белковые микрочипы изготавливаются в качестве функциональных белковых микрочипов с использованием полноформатных функциональные белки 4-6,8,9 или аналитических белковых микрочипов, содержащих антитела 10,11. Они разработаны, чтобы содержать высокой плотности белков, выстроенных на предметных стеклах с различными поверхностных химических для облегчения различных экспериментальных условиях, необходимых для проведения широкомасштабную биохимических анализов 12. Нитроцеллюлозы и альдегид поверхности химические для химической привязанности через лизина или крепления близость методов, таких как никель хелатных слайдов для крепления His-меченных белков и глутатиона для аффинной привязанности среди других 13. Использование функциональных белковых микрочипов для выявления белок-белковых взаимодействий требуется доступ к высококачественной библиотеки функционального белка 14. С. Cerevisiae поддается производить такой библиотеки через спаривания высокого сродства копирования меченый белок конструкции с высокой пропускной методов хроматографического очистки. Подавляющее большинство генома дрожжей было последовательности и почти вся протеом может быть выражена с высокой копирования плазмиды для очистки и биохимический анализы 12. После того, как белки получают и облеченные в формате 384-луночного, они напечатаны на предметное стекло микроскопа, позволяющего для быстрого параллельного многопараметрического биохимического анализа и биоинформатики допроса 8,14-16. Белковые микрочипы были использованы для ферментативных анализов и взаимодействий с белками, липидами, малых молекул, и нуклеиновых кислот среди многих других приложений. Доступность белков на поверхности протеомамассивы сделать их поддаются различным видам аналитического обнаружения в том числе, иммунных сродством, поверхностного плазмонного резонанса, флуоресценцию и многие другие методы. Кроме того, она позволяет точного контроля экспериментальных условиях, где он может быть трудно сделать в естественных условиях.
Цель этого протокола заключается в демонстрации соответствующего использования функциональных белковых микрочипов для выявления белок-белковых взаимодействий. Это приложение позволяет с высокой пропускной параллельный биохимический анализ белка связывания деятельности с использованием высокоочищенного анализируемого (белок) интересов. С-концевой (карбокси-терминал) помечены V5-фьюжн приманки интерес белок получают из высокого плазмидой в штамме дрожжей, оптимизированной для очистки белков. С-концевой пометки гарантирует, что белок полной длины была переведена. Белок, используемый в данном исследовании, Tda1-V5 слитый белок киназы, который очищают с помощью аффинной никель смолы с помощью тэга His6X. Tda1-V5 слияние строит очищали путем последовательного элюирования с использованием градиента имидазола для элюирования наиболее обогащенную фракцию для использования в анализе.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Зонд Подготовка
- Культура и очистить V5-киназы фьюжн зондов, используемых для изучения взаимодействий с другими белками следующим образом:
- Используйте недавно прожилками деформации Y258 дрожжей (MATa pep4-3, his4-580, ura3-53, leu2-3,112), содержащий V5-слитый белок (выраженное с GATEWAY векторных pYES-DEST52). Используйте изолированный белок в качестве зонда на микрочипов. Плита дрожжи на синтетические полная-урацил (SC-Ура) / 2% декстроза / агар и растут при температуре 30 ° С в течение 3 дней с замороженной культуры (-80 ° С глицерин фондовом).
- Посев закваски (5-20 мл) от одной колонии и расти в течение ночи в Sc-Ura / 2% декстрозы при встряхивании платформы (220-250 оборотов в минуту) или колесо при 30 ° С.
- На следующее утро, привить 400 мл SC-Ура / 2% рафиноза культуры с достаточной культуры стартера до конечного OD 600 0,1.
- Расти посевного для OD 600 0,6 с последующим галактозы индукции V5-киназы-фуSion построить выражение с помощью добавления раствора 3x дрожжевого экстракта / пептон (YEP) с добавлением 6% галактозы, добавляя достаточно, чтобы разбавить индукции носитель с коэффициентом 3, так что конечная концентрация галактозы составляет 2%.
- Индуцируют клетки при 30 ° С в течение 6 ч на качалке платформы. Используйте 2 л колбу Эрленмейера, чтобы обеспечить надлежащее проветривание.
- Урожай клетки с использованием ротора JA-10 (или сопоставимый), вращая 400 мл клеточной суспензии при 1000 х г в течение 5 мин при 4 ° С.
- Вымойте клетки один раз с 50 мл ледяной PBS буфер и передают в 50 мл коническую трубку. Вымойте гранул раз в ледяной буфера PBS (без моющих средств или других добавок), используемых для лизиса и передачи до 2 мл оснастки колпачок трубки для лизиса.
- Спин клетки при 20000 х г в течение 1 мин при 4 ° С до гранул и пипеткой вдали буфера.
- Поместите трубки на льду и заполните лизиса шагу.
- Лизировать клетки (250-350 мкл гранул) с 00,5 мм оксида циркония в соотношении 1: 1: объем клеточного осадка, бисера и фосфатно-солевом буфере (PBS) буфере для лизиса 1 и вихревых смеси с использованием агитацией платформа 3 раза в 2-минутными интервалами при 4 ° С.
- Центрифуга лизата при 20000 х г в настольной микроцентрифуге в течение 10 мин при 4 ° С.
- Пипетка супернатант в поликарбонат высокоскоростной центрифужную пробирку и уточнить по ulracentrufugation в течение 30 мин при 150000 х г при 4 ° С.
- Передача осветленной лизата в пробирку, содержащую предварительно промытую Ni 2+ аффинной смолы (~ 100 мкл) и инкубируют на nutator в течение 2 ч при 4 ° С для захвата гистидин (His) 6X помечены V5-слитый белок.
- Промыть смолы три раза в течение 10 мин при 4 ° С промывочным буфером. Гранул смолы с использованием таблицы центрифуге в течение 5 мин при 1000 х г при 4 ° С и аспирата супернатант. Добавить свежий промывочный буфер при каждой стирке и вернуться трубки nutator для агитации во время стирки.
- После стирки стеPS являются полными, применяют промытый смолы на свежую G-25 колонке дл элюировани.
- Применить 25 мкл буфера для элюции в поэтапно, начиная с 100 мМ имидазола до 500 мМ имидазола в 50 мм для приращений в общей сложности 9 фракций.
- Анализе собранных фракций использованием додецилсульфата натрия полиакриламидном геле (SDS-PAGE) и Кумасси окрашивания для идентификации наиболее высоко фракции, обогащенной (ы) для использования в анализе и добавить глицерин до 30% и хранить при температуре -80 ° С до использования в Анализ.
2. Исследование массивов
ПРИМЕЧАНИЕ: Пожалуйста, обратитесь шаг 2.6 этого раздела, чтобы подготовить раствор антител до начала анализа.
- Для обнаружения взаимодействий, разбавить V5-флуорофор конъюгированного антитела (т.е. AlexaFluor 647) 260 нг / мл в буфере зонда и тщательно перемешать, встряхивая.
ПРИМЕЧАНИЕ: Подготовьте раствор антител 30 мин до использования и поместите трубку на nutatили или колеса для обеспечения полного перемешивания и гомогенную суспензию антитела. - Развести белка зонд V5-фьюжн в диапазоне концентраций от 5-500 мкг / мл.
ПРИМЕЧАНИЕ: Оптимизирован для каждого взаимодействия анализе белок-белок, используя буфер зонда. Оптимизация включает в себя добавление более зондов для исследования буфера. Обычно 10 мкг / мл используют в качестве отправной точки, и соответствующим образом скорректированы на основе сигнала. - Удалить белковых микрочипов из морозильника (-20 ° C) и довести до 4 ° С в холодильнике до использования.
- Добавить блокирующем буфере непосредственно держатель слайдов, содержащий белок micorarrays и закрывать верхнюю с парафином, чтобы предотвратить утечку. Блок массивы в блокирующем буфере в течение 1 часа при встряхивании при 50 оборотах в минуту на стадии при 4 ° С.
- После блокирования передачи массивов в увлажненной камере охлаждают до 4 ° С и добавляют 90 мкл разбавленного зонда непосредственно на поверхность массива. Наложение обрн я с поднятой скольжения подъемного и инкубировать статическое (не встряхивая) в увлажненной камере при 4 ° С в течение 1,5 ч.
- Вымойте массивы 3 раза в течение 1 мин каждый в буфере зонда в трех 50 мл конические пробирки. Добавить слайд, конических пробирок, содержащих достаточно предварительно охлажденной буфера зонд полностью конверт слайд. Разрешить скольжения ручка мягко соскальзывать микрочипов белка (не заставить ее покинуть, как это может привести к повреждению поверхности массива).
- Нанесите раствор антител непосредственно в массив сразу после завершения стирки (этап 2.5) и накладку с поднятым скольжения подъемного как раньше. Инкубируйте массивов в течение 30 мин при 4 ° С в увлажненной камере.
- Точно так же следует стадия промывки, как и раньше (3 раза 1 мин в буфере зонда) и спина в 50 мл коническую пробирку при 800 х г в настольной центрифуге в течение 5 мин при комнатной температуре. Высушите массивов в держатель слайдов в темноте в течение 30 мин перед сканированием массива на 647 нм.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Активность белок-белковое взаимодействие наблюдалось с помощью стандартного считывателя чип оценить Tda1-V5 протеинкиназы слитой конструкции в качестве приманки против белка функциональной микрочипов белка дрожжей, содержащего приблизительно 4,200 уникальную S. Cerevisiae GST-слитые белки. Кроме того допрос с программным обеспечением GenePix показал множество связывания события с различной интенсивностью. Сродство судить по градуированной интенсивности сигнала, полученного из моноклонального V5-флуорофора конъюгированного антитела, связанного с его мишенью (V5-киназы). ProCat алгоритм выигрыша 2 был использован для идентификации белок-белковых взаимодействий между двух отдельных белковых чипов для каждого из белков в дубликатах (каждый белок замечен дважды в массиве), то порог отсечения была определена для озвучивания наблюдаемые взаимодействия.
Сравнивая два массива получается 4 технических повтора (п = 4), что можно использовать для определения IntИзменение э-анализа через корреляции (R 2), из этих двух мест для каждого белка на массивах. Всего 9 белок-белковых взаимодействий были определены между приманки белка Tda1-V5 и белков на микрочипе, используя заданный порог для определения уникальный протеинкиназы взаимодействия 1. Кроме того, одни и те же белки замечен в различных положениях по всей массивов в качестве контроля для оценки поверхностных артефакты, которые могут способствовать ложных срабатываний. Сравнение нескольких обязательных профилей различных белков киназы-V5 синтеза позволяет идентифицировать конкретные киназы белок-белковых взаимодействий для тестирования в естественных условиях.
В этом эксперименте мы тестировали активности связывания Tda1-V5 и идентифицированы несколько статистически значимых ИПП на основе ранжированных по р-значение по сравнению с другими киназами тестируемых. Особый интерес представляет Rim11, который был идентифицирован как фосфорилированного цели Tda1 в ранее опубликованном сTudy 9. После цели были определены, они могут быть проверены на биохимическом и функциональной активности в естественных 1.
Рисунок 1:. Tda1-V5 по сравнению с пустой векторного управления Дрожжи белка микрочипов заметили в двух экземплярах с ~ 4200 полноразмерного GST-слитого белка инкубировали с контролем или Tda1-V5 зондов. Панель Вставка сравнивает идентичные область в обоих массивах. Белок-белкового взаимодействия был обнаружен (синие коробки) между Rim11 и Tda1-V5.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Протокол, представленные первоначально был выполнен с использованием 85 уникальных дрожжей белка белки киназы-V5 фьюжн сравнить активность связывания через отдельных и связанных семей дрожжи протеинкиназ в результате идентификации новых сетей киназы взаимодействия в естественных условиях 1. Как новая технология профилирования протеомного, развитие Высокая пропускная способность (ПВТ) скрининга с использованием белка протеомов микрочипов полагались на пептидных библиотек, и эукариотических и прокариотических организмов модели 8,17; Через этот анализ платформа была применена к высших эукариот, таких как растения и человеческого 5,7. В настоящее время нет в продаже массива дрожжи белок. Тем не менее, последовательность подтверждали коллекции кДНК доступны из нескольких ресурсов
Хотя метод может быть мощным, один нюанс, чтобы иметь в виду, что анализ проводится в пробирке, и, таким образом, результаты будут иметь ложных срабатываний. Таким образом, optimizinг состояние анализа и стратегического схема фильтрации желательно, чтобы получить значимые данные. Белок технологии микрочипов следующего поколения содержат гораздо большее количество высокоочищенных функциональных белков для биохимического анализа по множеству организмов, включая A. THALIANA, S.cerevisiae, и Homo Сапиен.
Уровень сложности, что новые микрочипы белка спроектировали в них позволяет обширный выбор биохимических анализов, которые могут быть выполнены. Почти все протеом был клонирован и очищенный для S. Cerevisiae с использованием библиотеки тегами C-терминал для обеспечения надлежащего пост-трансляционной модификации белков 14. Кроме того, быстрые параллельные анализы предложили с помощью белковых микрочипов позволяет непредвзято подход к белок-белкового взаимодействия и пост-трансляционной модификации профилирования.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Petri Dishes | VWR | NC-10747 | or comparable |
| Bacto yeast extract | Difco | 0217-17 | |
| Bacto peptone | Difco | 0118-17 | |
| Bacto agar | Difco | 0140-01 | |
| Dextrose | Sigma | D9434 | |
| Raffinose | Sigma | R0514 | |
| Galactose | Sigma | G0750 | |
| Sc-Ura drop out media | MP Bio | 114410622 | |
| Small Culture tubes | VWR/Fisher | ||
| Large Erlenmeyer Flask | VWR/Fisher | ||
| Centrifuge JA-10 rotor | |||
| Centrifuge tubes (500 ml) | |||
| Falcon tube (50 ml) | VWR/Fisher | 21008-951 | |
| PBS Tablets | Sigma | P4417 | |
| FastPrep Tubes (2 ml screw cap tube) | |||
| FastPrep Machine | MP Biomedicals | 116004500 | |
| Zircon Beads | BioSpec | 11079105 | |
| Triton X100 | Sigma | P4417 | |
| DTT | Sigma | D9779 | |
| MgCl2 | Sigma | M8266 | |
| NaCl | Sigma | S3014 | |
| Imidazole (pH = 7.4) | Sigma | I5513 | |
| PMSF | Sigma | 93482 | |
| Complete Inhibitor Cocktail (EDTA Free) | Roche | 11873580001 | |
| Phosphatase inhibitor cocktail 1 | sigma | P2850 | |
| BSA | Sigma | A2153 | |
| Tween-20 | Sigma | P1379 | |
| ATP | Sigma | A1852 | |
| Shaking Incubator (30 °C) | |||
| Nickel Affinity Resin | Life Technologies | R901-01 | |
| G25 column | GE life sciences | 27-5325-01 | |
| Nutator | VWR/Fisher | ||
| SDS-PAGE Gel (NuPage) | Life Technologies | ||
| Coomassie Blue Stain | Life Technologies | ||
| Monoclonal V5 Antibody | Life Technologies | R960-25 | |
| Alexa647 Tagged monoclonal V5 Antibody | Life Technologies | 451098 | |
| Protein Microarrays Kit | Life Technologies | PAH0525013 | |
| Genepix Scanner | Molecular Devices | ||
| Lifter Slips | Thomas Scientific | http://www.thomassci.com/Supplies/Microscope-Cover-Glass/_/LIFTER-SLIPS/ | |
| Lysis Buffer: 0.1% Triton X-100, 0.5 mM DTT, 2 mM MgCl2, 500 mM NaCl, 50 mM imidazole (pH 7.4), Complete protease inhibitor cocktail – EDTA-free, Phosphatase inhibitor Cocktail 1, 1 mM PMSF (add just prior to use) |
Add the reagents to 1x PBS (0.01 M phosphate buffer, 0.0027 M potassium chloride, 0.137 M sodium chloride; pH 7.4) to obtain the desired volume of lysis solution | ||
| Blocking Buffer: 1% bovine serum albumin (BSA), 0.1% Tween-20 | Add the reagents to 1x PBS to obtain the desired volume of blocking buffer | ||
| Probe Buffer: 2 mM MgCl2, 0.5 mM DTT, 0.05% Triton X-100, 50 mM NaCl, 500 μM ATP (for kinases), 1% BSA | Add the reagent to 1x PBS to obtain desired volume of probe buffer | ||
| Wash Buffer: 0.1% Triton X-100, 500 mM NaCl, 0.5 mM DTT, 50 mM imidazole (pH 7.4),2 mM MgCl2 | Add the reagent to 1x PBS to obtain desired volume of probe buffer | ||
| Elution Buffer: 0.1% Triton X-100, 0.5 mM DTT, 2 mM MgCl2, 500 mM NaCl, 50 – 500 mM imidazole (pH 7.4), Complete protease inhibitor cocktail – EDTA-free, Phosphatase inhibitor Cocktail 1, 1 mM PMSF (add just prior to use) | Before you begin, it is important to note the concentration gradient of imidazole (50 – 500 mM) and to create separate tubes for each concentration (it is advisable to create the interval using 50 mM increments). Add the reagent to 1x PBS to obtain desired volume of probe buffer | ||
| 3x YEP +6% galactose: Dissolve 30 g of yeast extract and 60 g of peptone in 700 ml of H2O, and autoclave. Add 300 ml of filter sterilized 20% galactose (wt/vol) | Galactose should not be autoclaved |
References
- Fasolo, J., et al. Diverse protein kinase interactions identified by protein microarrays reveal novel connections between cellular processes. Genes. 25, 767-778 (2011).
- Zhu, X., Gerstein, M., Snyder, M. ProCAT: a data analysis approach for protein microarrays. Genome biology. 7, R110 (2006).
- Breitkreutz, A., et al. A global protein kinase and phosphatase interaction network in yeast. Science. 328, 1043-1046 (2010).
- Gavin, A. C., et al. Functional organization of the yeast proteome by systematic analysis of protein complexes. Nature. 415, 141-147 (2002).
- Jeong, J. S., et al. Rapid identification of monospecific monoclonal antibodies using a human proteome microarray. Mol Cell Proteomics. 11 (6), (2012).
- Krogan, N. J., et al. Global landscape of protein complexes in the yeast Saccharomyces cerevisiae. Nature. 440, 637-643 (2006).
- Popescu, S. C., et al. Differential binding of calmodulin-related proteins to their targets revealed through high-density Arabidopsis protein microarrays. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 104, 4730-4735 (2007).
- Zhu, H., et al. Global analysis of protein activities using proteome chips. Science. 293, 2101-2105 (2001).
- Ptacek, J., et al. Global analysis of protein phosphorylation in yeast. Nature. 438, 679-684 (2005).
- Haab, B. B. Antibody arrays in cancer research. Molecular & cellular proteomics. Mol Cell Proteomics. 4 (4), 377-383 (2005).
- Kopf, E., Zharhary, D. Antibody arrays--an emerging tool in cancer proteomics. The international journal of biochemistry & cell biology. 39, 1305-1317 (2007).
- Berrade, L., Garcia, A. E., Camarero, J. A. Protein microarrays: novel developments and applications. Pharmaceutical research. 28, 1480-1499 (2011).
- Balboni, I., Limb, C., Tenenbaum, J. D., Utz, P. J. Evaluation of microarray surfaces and arraying parameters for autoantibody profiling. Proteomics. 8, 3443-3449 (2008).
- Gelperin, D. M., et al. Biochemical and genetic analysis of the yeast proteome with a movable ORF collection. Genes & development. 19, 2816-2826 (2005).
- Fasolo, J., Snyder, M. Protein microarrays. Methods Mol. Biol. 548, 209-222 (2009).
- Im, H., Snyder, M., et al. Preparation of recombinant protein spotted arrays for proteome-wide identification of kinase targets. Current protocols in protein science. Coligan, J. E. 27, Unit 27 24 (2013).
- MacBeath, G., Schreiber, S. L. Printing proteins as microarrays for high-throughput function determination. Science. 289, 1760-1763 (2000).
