Summary
Anvendelse af protein microarrays indeholder næsten hele S. cerevisiae proteom probes til hurtig unbiased forhør af tusindvis af protein-protein interaktioner i parallel. Denne metode kan anvendes til protein-lille molekyle, posttranslationel modifikation og andre assays i high-throughput.
Abstract
High-density funktionelt protein mikroarrays indeholdende ~ 4.200 rekombinante gærproteiner undersøges for kinase protein-protein interaktioner under anvendelse af et affinitetsoprenset gær kinase fusionsprotein indeholdende en V5-epitopmærke til udlæsning. Oprenset kinase opnås ved dyrkning af en gærstamme optimeret for høj kopi proteinproduktion huser et plasmid indeholdende en kinase-V5 fusionskonstruktion under en GAL promotor. Gæren dyrkes i restriktiv medier med en neutral carbonkilde i 6 timer efterfulgt af induktion med 2% galactose. Dernæst høstes kulturen og kinase oprenses ved anvendelse af standard affinitet kromatografiske teknikker til opnåelse af et højt oprensede protein kinase til anvendelse i assayet. Det oprensede kinase fortyndes med kinase buffer til et passende område for assayet og proteinet mikroarrays blokeres før hybridisering med proteinet microarray. Efter hybridisering arrays probet med monoklonalt V5 ANTIBody at identificere proteiner bundet af kinase-V5-protein. Endelig er arrays scannet ved hjælp af en standard microarray scanner, og data hentes for downstream informatik analyse 1,2 for at bestemme en høj tillid sæt protein interaktioner for downstream validering in vivo.
Introduction
Behovet for at udføre globale analyser af protein biokemi og bindende aktivitet in vivo har resulteret i udvikling af nye metoder til profilering af protein-protein interaktioner (PPI) og de post-translationelle modifikationer af hele proteomer 1,3-8. Protein microarrays fremstilles som funktionelle protein microarrays anvender fuld længde funktionelle proteiner 4-6,8,9 eller analytiske protein mikroarrays indeholdende antistoffer 10,11. De er manipuleret til at indeholde en høj densitet af proteiner opstillede på objektglas med en række overfladekemier at lette en række eksperimentelle betingelser, der kræves for udførelse vidtrækkende biokemiske analyser 12. Nitrocellulose og aldehyd overfladekemier til kemisk binding gennem lysin eller affinitet vedhæftede metoder såsom nikkel chelaterede slides til fastgørelse His-mærkede proteiner og glutathion for affinitet fastgørelse blandt andre 13. Anvendelsen af funktionelt protein microarrays til påvisning af protein-protein-interaktioner kræver adgang til en høj kvalitet funktionelt protein bibliotek 14. S. cerevisiae er modtagelig for at producere et sådant bibliotek gennem parring af høj-kopi affinitetsmærkede proteinkonstruktioner med højt gennemløb kromatografiske oprensningsteknikker. Langt størstedelen af gærgenomet er blevet sekventeret og næsten hele proteom kan udtrykkes fra en høj-kopi plasmid til oprensning og biokemiske analyser 12. Når proteinerne opnås og grupperet i 384-brønds format, bliver de trykt på et mikroskopobjektglas muliggør hurtig parallel multi-parametrisk biokemisk analyse og bioinformatik forhør 8,14-16. Protein microarrays er blevet anvendt til enzymatiske assays og interaktioner med proteiner, lipider, små molekyler og nukleinsyrer blandt mange andre applikationer. Tilgængeligheden af proteiner på overfladen af proteomarrays gør dem modtagelige for forskellige typer af analytisk påvisning, herunder, immun-affinitet, overfladeplasmonresonans, fluorescens og mange andre teknikker. Desuden muliggør fin styring af den eksperimentelle tilstand, hvor det kan være svært at gøre in vivo.
Formålet med denne protokol er at demonstrere hensigtsmæssig brug af funktionelle protein microarrays til at opdage protein-protein interaktioner. Denne applikation giver højt gennemløb parallel biokemisk analyse af proteinbindende aktiviteter, der benytter en højt oprenset analyt (protein) af interesse. En C-terminal (carboxy-terminal) mærket V5-fusionsprotein bait protein af interesse er fremstillet af en høj-kopi plasmid i en gærstamme optimeret til proteinoprensning. C-terminale tagging sikrer at hele længde proteinet er blevet oversat. Proteinet anvendt i denne undersøgelse er Tda1-V5 fusionsprotein kinase, der oprenses ved anvendelse af nikkel affinitet harpiks via en His6X tag. Den Tda1-V5 fusion konstrukt oprenses via seriel eluering under anvendelse af en imidazol-gradient til eluering af de højt beriget fraktion til anvendelse i assayet.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Probe Forberedelse
- Kultur og rense V5-fusion kinase sonder anvendes til at undersøge interaktioner med andre proteiner som følger:
- Brug frisk stribede gærstamme Y258 (MATa pep4-3, his4-580, ura3-53, leu2-3,112) indeholdende V5-fusionsprotein (udtrykt fra GATEWAY vektor pYES-DEST52). Brug det isolerede protein som probe på microarrays. Plate gæren på syntetisk komplet-uracil (Sc-Ura) / 2% dextrose / agar og vokse ved 30 ° C i 3 dage fra frossen kultur (-80 ° C glycerol stock).
- Inokulere starterkulturer (5-20 ml) fra en enkelt koloni og vokse natten over i Sc-Ura / 2% dextrose på rystebord (220-250 rpm) eller hjul ved 30 ° C.
- Den følgende morgen inokuleres 400 ml af sc-Ura / 2% raffinose kultur med tilstrækkelig starterkultur til en endelig OD 600 på 0,1.
- Dyrke inoculums til OD600 på 0,6, efterfulgt af galactose induktion af V5-kinase fusionen konstruere ekspression ved tilsætning af en opløsning af 3x gærekstrakt / pepton (YEP) suppleret med 6% galactose, ved at tilsætte nok til at fortynde induktion medier med en faktor på 3, således at slutkoncentrationen af galactose er 2%.
- Inducere celler ved 30 ° C i 6 timer på et rystebord. Brug en 2 L Erlenmeyerkolbe at sikre passende beluftning.
- Harvest celler med en JA-10 (eller tilsvarende) rotor ved spinding 400 ml cellesuspension ved 1.000 xg i 5 min ved 4 ° C.
- Vask cellerne en gang med 50 ml iskold PBS-buffer og overføres til en 50 ml konisk rør. Vask pelleten igen i iskold PBS-buffer (uden detergenter eller andre additiver), der anvendes til lysis og overførsel til 2 ml snap-cap rør til lysis.
- Spin cellerne ved 20.000 xg i 1 min ved 4 ° C til en pellet og pipette væk bufferen.
- Rørene anbringes på is og fortsætte med lysis trin.
- Lyse cellerne (250-350 pi pellet) med 0.5 Mm zirconia perler i en 1: 1: 1 volumen cellepellet, perler, og phosphatpufret saltvand (PBS) lysepuffer og vortex blandingen under anvendelse af en agitation platform 3 gange med 2 minutters intervaller ved 4 ° C.
- Centrifuger lysatet ved 20.000 x g i en bordplade mikrocentrifuge i 10 minutter ved 4 ° C.
- Pipette supernatant i polycarbonat højhastigheds centrifugeglas og tydeliggøre ved ulracentrufugation i 30 minutter ved 150.000 xg ved 4 ° C.
- Overfør det klarede lysat til et rør indeholdende forvasket Ni2 + affinitetsharpiks (~ 100 pi) og inkuber på en nutator i 2 timer ved 4 ° C for at indfange Histidin (His) 6X mærkede V5-fusionsprotein.
- Resinen vaskes tre gange i 10 minutter ved 4 ° C med vaskebuffer. Pelletere harpiksen under anvendelse af en bordcentrifuge i 5 minutter ved 1000 xg ved 4 ° C og aspireres supernatanten. Tilføj frisk vaskebuffer til hver vask og returnere røret på nutator for agitation under vask.
- Efter vask steps er fuldstændige, anvende den vaskede harpiks til en frisk G-25 søjle til eluering.
- Påfør 25 pi elueringsbuffer i en trinvis måde, der begynder med 100 mM imidazol til 500 mM imidazol i 50 mM intervaller for i alt 9 fraktioner.
- Analysere de opsamlede fraktioner ved hjælp natriumdodecylsulfat polyacrylamid gel (SDS-PAGE) og Coomassie-farvning for at identificere den mest højt beriget fraktion (er) til anvendelse i assayet og tilføj glycerol til 30% og opbevares ved -80 ° C indtil anvendelse i assay.
2. Probing de Arrays
BEMÆRK: Se venligst trin 2.6 i dette afsnit for at forberede antistofopløsningen inden analysen startes.
- For at detektere interaktioner fortyndes V5-fluoroforen konjugeret antistof (dvs. AlexaFluor 647) til 260 ng / ml i sonden buffer og bland grundigt ved at ryste.
BEMÆRK: Forbered dette antistof løsning 30 minutter før brug og placere røret på en nutateller eller hjulet for at sikre fuldstændig blanding og en homogen suspension af antistof. - Fortynd V5-fusionsproteinet sonde over et koncentrationsområde på 5-500 ug / ml.
BEMÆRK: Optimeret til hvert protein-protein-interaktion assay under anvendelse af probe-buffer. Optimering involverer tilsætning flere prober til at probe buffer. Typisk 10 pg / ml anvendes som udgangspunkt og justeres baseret på signalstyrken. - Fjerne protein microarrays fra fryseren (-20 ° C) og bringe til 4 ° C i køleskabet lige før brug.
- Tilføj blokerende buffer direkte til diasholderen indeholder protein micorarrays og dække toppen med parafilm at forhindre lækage. Blokere arrays i blokerende buffer i 1 time ved omrystning ved 50 rpm på en scene ved 4 ° C.
- Efter blokering overføre arrays til et fugtigt kammer nedkøles til 4 ° C, og der tilsættes 90 pi fortyndet probe direkte til array overflade. Overlejre arrays med en hævet lift slip og inkuber statiske (ingen omrystning) i fugtigt kammer ved 4 ° C i 1,5 timer.
- Vask arrays 3 gange i 1 min hver i probe buffer i tre 50 ml koniske rør. Tilsæt dias til koniske rør, der indeholder nok pre-afkølet sonde buffer til helt kuvert diasset. Lad løfteren slip til forsigtigt glide af proteinet microarray (ikke tvinge det ud, da det kan resultere i skader på array overflade).
- Påfør antistofopløsningen direkte til opstilling umiddelbart efter endt vask (trin 2.5) og overlay med en hævet løfteren slip som før. Inkubér arrays til 30 minutter ved 4 ° C i befugtet kammer.
- Udfør den samme vasketrin som før (3 gange 1 min i probe-buffer), og spin i et 50 ml konisk rør ved 800 xg i en bordcentrifuge i 5 minutter ved stuetemperatur. Air-tørre arrays i et dias holder i mørke i 30 minutter før scanning array på 647 nm.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Protein-protein-interaktion aktivitet blev observeret ved anvendelse af en standard chip-læser for at evaluere Tda1-V5 proteinkinase fusion konstrukt som en bait-protein mod en gær funktionelt protein microarray indeholdende ca. 4.200 unikke S. cerevisiae GST-fusionsproteiner. Yderligere forhør med GenePix software afsløret et væld af bindende begivenheder af varierende intensitet. Affiniteten blev målt fra det graduerede intensitet af signalet afledt fra et monoklonalt V5-fluorophor konjugeret antistof bundet til dens mål (V5-kinase). ProCat scoring algoritme 2 blev anvendt til at identificere protein-protein-interaktioner på tværs af to separate protein microarrays for hvert af proteinerne analyseret dobbelt (hvert protein er spottet to gange på arrayet), derefter en tærskel afskæring blev bestemt for at udføre de observerede interaktioner.
Ved at sammenligne to arrays opnår man 4 tekniske replikater (n = 4), der kan bruge til at bestemme inter-assay variation gennem korrelation (R2) af de to pletter for hvert protein på arrays. Blev identificeret i alt 9 protein-protein interaktioner mellem Tda1-V5 bait-protein og proteinerne på mikroarrayet bruger foruddefineret tærskel for at identificere unikke protein kinase interaktioner 1. Endvidere er de samme proteiner spottet i forskellige positioner i hele arrays som en kontrol for at vurdere overflade artefakter som kan bidrage til falske positive. Sammenligningen af flere bindende profiler af forskellige kinase-V5 fusionsproteiner muliggør identifikation af kinase specifikke protein-protein-interaktioner til test in vivo.
I dette eksperiment testede vi den bindende virkning af Tda1-V5 og identificeret flere statistisk signifikante PPI baseret på sorteret efter p-værdi i forhold til andre testede kinaser. Af særlig interesse er Rim11, der er blevet identificeret som et phosphoryleret mål for Tda1 i en tidligere offentliggjort sTudy 9. Når målene er blevet identificeret, kan de testes for biokemisk og funktionel aktivitet in vivo 1.
Figur 1:. Tda1-V5 sammenlignet med tom vektor kontrol gærprotein microarrays spottet to gange med ~ 4.200 fuldlængde GST-fusionsproteinet blev inkuberet med kontrol eller Tda1-V5 prober. Indsat panel sammenligner identiske region i begge arrays. Protein-protein interaktion blev påvist (blå bokse) mellem Rim11 og Tda1-V5.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Protokollen præsenterede blev oprindeligt udført under anvendelse af 85 unikke gær protein kinase-V5 fusionsproteiner at sammenligne bindingsaktivitet tværs særskilte og beslægtede familier af gær proteinkinaser resulterer i identifikationen af nye kinase interaktionsnetværk in vivo 1. Som en spirende proteomisk profilering teknologi, udvikling af High Throughput (HTP) screening af proteomer anvender protein microarrays påberåbte peptid biblioteker og eukaryote og prokaryote modelorganismer 8,17; senere blev denne analyse platform anvendes på højere eukaryoter såsom anlæg og menneskelig 5,7. Øjeblikket er der ingen kommercielt tilgængelig gærprotein array. , Sekvensverificeret dog cDNA samlinger er tilgængelige fra flere ressourcer
Selvom teknikken kan blive stærke, en advarsel at huske på er, at assayet er udført in vitro, og dermed resultater vil have falske positiver. Således optimizing assay tilstand og strategisk filtrering ordningen er tilrådeligt at hente meningsfulde data. Næste generations protein microarray teknologi indeholder et langt større antal højt oprensede funktionelle proteiner til biokemisk analyse på tværs af en lang række organismer, herunder A. thaliana, S. cerevisiae, og Homo Sapien.
Niveauet af raffinement, at de nye protein mikroarrays har manipuleret ind i dem giver en ekspansiv række biokemiske analyser, der kan udføres. Næsten hele proteom er blevet klonet og oprenset for S. cerevisiae under anvendelse af et C-terminalt mærkede bibliotek for at sikre korrekt post-translationel modifikation af proteinerne 14. Endvidere er de hurtige parallelle analyser tilbudt hjælp af protein microarrays muliggør en objektiv tilgang til protein-protein-interaktion og post-translationel modifikation profilering.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Petri Dishes | VWR | NC-10747 | or comparable |
| Bacto yeast extract | Difco | 0217-17 | |
| Bacto peptone | Difco | 0118-17 | |
| Bacto agar | Difco | 0140-01 | |
| Dextrose | Sigma | D9434 | |
| Raffinose | Sigma | R0514 | |
| Galactose | Sigma | G0750 | |
| Sc-Ura drop out media | MP Bio | 114410622 | |
| Small Culture tubes | VWR/Fisher | ||
| Large Erlenmeyer Flask | VWR/Fisher | ||
| Centrifuge JA-10 rotor | |||
| Centrifuge tubes (500 ml) | |||
| Falcon tube (50 ml) | VWR/Fisher | 21008-951 | |
| PBS Tablets | Sigma | P4417 | |
| FastPrep Tubes (2 ml screw cap tube) | |||
| FastPrep Machine | MP Biomedicals | 116004500 | |
| Zircon Beads | BioSpec | 11079105 | |
| Triton X100 | Sigma | P4417 | |
| DTT | Sigma | D9779 | |
| MgCl2 | Sigma | M8266 | |
| NaCl | Sigma | S3014 | |
| Imidazole (pH = 7.4) | Sigma | I5513 | |
| PMSF | Sigma | 93482 | |
| Complete Inhibitor Cocktail (EDTA Free) | Roche | 11873580001 | |
| Phosphatase inhibitor cocktail 1 | sigma | P2850 | |
| BSA | Sigma | A2153 | |
| Tween-20 | Sigma | P1379 | |
| ATP | Sigma | A1852 | |
| Shaking Incubator (30 °C) | |||
| Nickel Affinity Resin | Life Technologies | R901-01 | |
| G25 column | GE life sciences | 27-5325-01 | |
| Nutator | VWR/Fisher | ||
| SDS-PAGE Gel (NuPage) | Life Technologies | ||
| Coomassie Blue Stain | Life Technologies | ||
| Monoclonal V5 Antibody | Life Technologies | R960-25 | |
| Alexa647 Tagged monoclonal V5 Antibody | Life Technologies | 451098 | |
| Protein Microarrays Kit | Life Technologies | PAH0525013 | |
| Genepix Scanner | Molecular Devices | ||
| Lifter Slips | Thomas Scientific | http://www.thomassci.com/Supplies/Microscope-Cover-Glass/_/LIFTER-SLIPS/ | |
| Lysis Buffer: 0.1% Triton X-100, 0.5 mM DTT, 2 mM MgCl2, 500 mM NaCl, 50 mM imidazole (pH 7.4), Complete protease inhibitor cocktail – EDTA-free, Phosphatase inhibitor Cocktail 1, 1 mM PMSF (add just prior to use) |
Add the reagents to 1x PBS (0.01 M phosphate buffer, 0.0027 M potassium chloride, 0.137 M sodium chloride; pH 7.4) to obtain the desired volume of lysis solution | ||
| Blocking Buffer: 1% bovine serum albumin (BSA), 0.1% Tween-20 | Add the reagents to 1x PBS to obtain the desired volume of blocking buffer | ||
| Probe Buffer: 2 mM MgCl2, 0.5 mM DTT, 0.05% Triton X-100, 50 mM NaCl, 500 μM ATP (for kinases), 1% BSA | Add the reagent to 1x PBS to obtain desired volume of probe buffer | ||
| Wash Buffer: 0.1% Triton X-100, 500 mM NaCl, 0.5 mM DTT, 50 mM imidazole (pH 7.4),2 mM MgCl2 | Add the reagent to 1x PBS to obtain desired volume of probe buffer | ||
| Elution Buffer: 0.1% Triton X-100, 0.5 mM DTT, 2 mM MgCl2, 500 mM NaCl, 50 – 500 mM imidazole (pH 7.4), Complete protease inhibitor cocktail – EDTA-free, Phosphatase inhibitor Cocktail 1, 1 mM PMSF (add just prior to use) | Before you begin, it is important to note the concentration gradient of imidazole (50 – 500 mM) and to create separate tubes for each concentration (it is advisable to create the interval using 50 mM increments). Add the reagent to 1x PBS to obtain desired volume of probe buffer | ||
| 3x YEP +6% galactose: Dissolve 30 g of yeast extract and 60 g of peptone in 700 ml of H2O, and autoclave. Add 300 ml of filter sterilized 20% galactose (wt/vol) | Galactose should not be autoclaved |
References
- Fasolo, J., et al. Diverse protein kinase interactions identified by protein microarrays reveal novel connections between cellular processes. Genes. 25, 767-778 (2011).
- Zhu, X., Gerstein, M., Snyder, M. ProCAT: a data analysis approach for protein microarrays. Genome biology. 7, R110 (2006).
- Breitkreutz, A., et al. A global protein kinase and phosphatase interaction network in yeast. Science. 328, 1043-1046 (2010).
- Gavin, A. C., et al. Functional organization of the yeast proteome by systematic analysis of protein complexes. Nature. 415, 141-147 (2002).
- Jeong, J. S., et al. Rapid identification of monospecific monoclonal antibodies using a human proteome microarray. Mol Cell Proteomics. 11 (6), (2012).
- Krogan, N. J., et al. Global landscape of protein complexes in the yeast Saccharomyces cerevisiae. Nature. 440, 637-643 (2006).
- Popescu, S. C., et al. Differential binding of calmodulin-related proteins to their targets revealed through high-density Arabidopsis protein microarrays. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 104, 4730-4735 (2007).
- Zhu, H., et al. Global analysis of protein activities using proteome chips. Science. 293, 2101-2105 (2001).
- Ptacek, J., et al. Global analysis of protein phosphorylation in yeast. Nature. 438, 679-684 (2005).
- Haab, B. B. Antibody arrays in cancer research. Molecular & cellular proteomics. Mol Cell Proteomics. 4 (4), 377-383 (2005).
- Kopf, E., Zharhary, D. Antibody arrays--an emerging tool in cancer proteomics. The international journal of biochemistry & cell biology. 39, 1305-1317 (2007).
- Berrade, L., Garcia, A. E., Camarero, J. A. Protein microarrays: novel developments and applications. Pharmaceutical research. 28, 1480-1499 (2011).
- Balboni, I., Limb, C., Tenenbaum, J. D., Utz, P. J. Evaluation of microarray surfaces and arraying parameters for autoantibody profiling. Proteomics. 8, 3443-3449 (2008).
- Gelperin, D. M., et al. Biochemical and genetic analysis of the yeast proteome with a movable ORF collection. Genes & development. 19, 2816-2826 (2005).
- Fasolo, J., Snyder, M. Protein microarrays. Methods Mol. Biol. 548, 209-222 (2009).
- Im, H., Snyder, M., et al. Preparation of recombinant protein spotted arrays for proteome-wide identification of kinase targets. Current protocols in protein science. Coligan, J. E. 27, Unit 27 24 (2013).
- MacBeath, G., Schreiber, S. L. Printing proteins as microarrays for high-throughput function determination. Science. 289, 1760-1763 (2000).
