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Biology

उच्च घनत्व कार्यात्मक प्रोटीन जांच प्रोटीन, प्रोटीन बातचीत का पता लगाने के लिए

Published: August 2, 2015 doi: 10.3791/51872
Automatic Translation
1, 1, 1,2
1Department of Genetics, Stanford University, 2Stanford Center for Genomics and Personalized Medicine, Stanford University

Summary

लगभग पूरे एस युक्त प्रोटीन का प्रयोग cerevisiae proteome समानांतर में प्रोटीन, प्रोटीन बातचीत के हजारों की तेजी से निष्पक्ष पूछताछ के लिए जांच की जाती है। इस विधि प्रोटीन-छोटे अणु, posttranslational संशोधन, और उच्च throughput में अन्य assays के लिए उपयोग किया जा सकता है।

Abstract

~ 4200 संयोजक खमीर प्रोटीन युक्त उच्च घनत्व कार्यात्मक प्रोटीन पढ़ने के लिए बाहर के लिए एक V5-मिलान टैग युक्त एक आकर्षण शुद्ध खमीर काइनेज संलयन प्रोटीन का उपयोग काइनेज प्रोटीन, प्रोटीन बातचीत के लिए जांच कर रहे हैं। शुद्ध काइनेज एक kinase-V5 के संलयन एक लड़की inducible प्रमोटर के तहत निर्माण युक्त प्लाज्मिड शरण उच्च प्रतिलिपि प्रोटीन के उत्पादन के लिए अनुकूलित एक खमीर तनाव की संस्कृति के माध्यम से प्राप्त किया जाता है। खमीर 2% गैलेक्टोज साथ प्रेरण द्वारा पीछा 6 घंटे के लिए एक तटस्थ कार्बन स्रोत के साथ प्रतिबंधात्मक मीडिया में उगाया जाता है। अगला, संस्कृति काटा जाता है और काइनेज परख में इस्तेमाल के लिए एक अत्यधिक शुद्ध प्रोटीन काइनेज प्राप्त करने के लिए मानक आत्मीयता chromatographic तकनीक का उपयोग कर शुद्ध होता है। शुद्ध काइनेज परख के लिए एक उपयुक्त श्रेणी के लिए काइनेज बफर के साथ पतला है और प्रोटीन से पहले प्रोटीन माइक्रोएरे के साथ संकरण को अवरुद्ध कर रहे हैं। संकरण के बाद, सरणियों मोनोक्लोनल V5 के antib के साथ जांच कर रहे हैंODY काइनेज-V5 के प्रोटीन से बाध्य प्रोटीन की पहचान। अंत में, सरणियों एक मानक माइक्रोएरे स्कैनर का उपयोग कर स्कैन कर रहे हैं, और डेटा विवो में नीचे की ओर सत्यापन के लिए प्रोटीन बातचीत का सेट एक उच्च आत्मविश्वास का निर्धारण करने के लिए नीचे की ओर सूचना विज्ञान विश्लेषण 1,2 के लिए निकाला जाता है।

Introduction

प्रोटीन जैव रसायन और vivo में गतिविधि बंधन की वैश्विक विश्लेषण प्रदर्शन करने की जरूरत प्रोटीन, प्रोटीन बातचीत (PPIs) और पूरे proteomes 1,3-8 के बाद translational संशोधनों की रूपरेखा के लिए नए तरीकों के विकास में हुई है। प्रोटीन एंटीबॉडी 10,11 युक्त 4-6,8,9 पूर्ण लंबाई कार्यात्मक प्रोटीन का उपयोग कर कार्यात्मक प्रोटीन, या विश्लेषणात्मक प्रोटीन के रूप में निर्मित कर रहे हैं। वे 12 का विश्लेषण करती व्यापक जैव रासायनिक के संचालन के लिए आवश्यक प्रयोगात्मक स्थितियों की एक किस्म की सुविधा के लिए सतह chemistries की एक किस्म के साथ खुर्दबीन स्लाइड पर तैनात प्रोटीन की एक उच्च घनत्व को शामिल करने के लिए इंजीनियर हैं। इस तरह दूसरों 13 के बीच आत्मीयता कुर्की के लिए उनकी टैग प्रोटीन और glutathione संलग्न करने के लिए निकल chelated स्लाइड के रूप में लाइसिन या आत्मीयता लगाव तरीकों के माध्यम से रासायनिक कुर्की के लिए Nitrocellulose और एल्डिहाइड सतह chemistries। प्रोटीन, प्रोटीन बातचीत का पता लगाने के लिए कार्यात्मक प्रोटीन के उपयोग के लिए एक उच्च गुणवत्ता कार्यात्मक प्रोटीन पुस्तकालय 14 के लिए उपयोग की आवश्यकता है। एस cerevisiae उच्च throughput chromatographic शोधन तकनीक के साथ प्रोटीन निर्माणों में चिह्नित उच्च प्रतिलिपि आत्मीयता की जोड़ी के माध्यम से इस तरह के एक पुस्तकालय का निर्माण करने के लिए उत्तरदायी है। खमीर जीनोम के विशाल बहुमत के अनुक्रम निर्धारण किया गया है और यह लगभग पूरे proteome शुद्धि के लिए एक उच्च प्रतिलिपि प्लाज्मिड से व्यक्त किया जा सकता है और जैव रासायनिक 12 विश्लेषण करती है। प्रोटीन प्राप्त की है और 384 अच्छी तरह प्रारूप में तैनात कर रहे हैं, वे तेजी से समानांतर बहु पैरामीट्रिक जैव रासायनिक विश्लेषण और पहले से पंजीकृत पूछताछ 8,14-16 की अनुमति के लिए एक खुर्दबीन स्लाइड पर मुद्रित कर रहे हैं। प्रोटीन कई अन्य अनुप्रयोगों के बीच में प्रोटीन, लिपिड, छोटे अणुओं, और न्यूक्लिक एसिड के साथ एंजाइमी assays और बातचीत के लिए इस्तेमाल किया गया है। proteome की सतह पर प्रोटीन की पहुंचसरणियों, सहित विश्लेषणात्मक पता लगाने के विभिन्न प्रकार, प्रतिरक्षा आत्मीयता के लिए उन्हें उत्तरदायी बनाने plasmon अनुनाद, प्रतिदीप्ति और कई अन्य तकनीकों सतह। इसके अलावा, यह यह विवो में करने के लिए कठिन हो सकता है, जहां प्रयोगात्मक हालत के ठीक नियंत्रण के लिए अनुमति देता है।

इस प्रोटोकॉल के उद्देश्य प्रोटीन, प्रोटीन बातचीत का पता लगाने के लिए कार्यात्मक प्रोटीन की उचित उपयोग के प्रदर्शन के लिए है। इस एप्लिकेशन को ब्याज की एक उच्च शुद्ध विश्लेष्य (प्रोटीन) का उपयोग प्रोटीन बाध्यकारी गतिविधियों की उच्च throughput समानांतर जैव रासायनिक विश्लेषण के लिए सक्षम बनाता है। एक सी टर्मिनल (टर्मिनल carboxy) ब्याज की V5-फ्यूजन चारा प्रोटीन प्रोटीन शुद्धि के लिए अनुकूलित एक खमीर तनाव में एक उच्च प्रतिलिपि प्लाज्मिड से उत्पादन किया है टैग किया। सी टर्मिनल टैगिंग पूर्ण लंबाई प्रोटीन अनुवाद किया गया है कि यह सुनिश्चित करता है। इस अध्ययन में इस्तेमाल प्रोटीन एक His6X टैग के माध्यम से निकल आत्मीयता राल का उपयोग कर शुद्ध होता है जो Tda1-V5 के संलयन प्रोटीन काइनेज है। Tda1-V5 के संलयन निर्माणटी परख में इस्तेमाल के लिए सबसे अत्यधिक संवर्धित अंश elute करने के लिए एक imidazole ढाल का उपयोग धारावाहिक क्षालन के माध्यम से शुद्ध होता है।

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Protocol

1. जांच तैयारी

  1. संस्कृति और के रूप में अन्य प्रोटीन के साथ बातचीत की जांच करने के लिए इस्तेमाल V5-फ्यूजन काइनेज जांच शुद्ध:
    1. हौसले से परेशान खमीर तनाव Y258 का उपयोग करें (माता pep4-3, his4-580, ura3-53, leu2-3,112) (प्रवेश द्वार वेक्टर pYES-DEST52 से व्यक्त) वी 5-संलयन प्रोटीन युक्त। प्रोटीन पर जांच के रूप में पृथक प्रोटीन का प्रयोग करें। सिंथेटिक पूरा-uracil (SC-ura) / 2% dextrose / अग्रवाल पर खमीर की थाली और जमे हुए संस्कृति (-80 डिग्री सेल्सियस ग्लिसरॉल शेयर) से 3 दिनों के लिए 30 डिग्री सेल्सियस पर बढ़ता है।
    2. एक ही कॉलोनी से स्टार्टर संस्कृतियों (5-20 मिलीग्राम) टीका लगाना और 30 डिग्री सेल्सियस पर मंच (220-250 आरपीएम) या पहिया मिलाते पर SC-Ura / 2% Dextrose में रात भर बढ़ता है।
    3. अगली सुबह, एक अंतिम ओवर ड्राफ्ट 0.1 के 600 करने के लिए पर्याप्त स्टार्टर संस्कृति के साथ SC-Ura / 2% raffinose संस्कृति के 400 मिलीलीटर टीका लगाना।
    4. 0.6 की 600 वी 5-काइनेज फू के गैलेक्टोज प्रेरण द्वारा पीछा आयुध डिपो के लिए inoculums बढ़ोसायन इसलिए गैलेक्टोज की है कि अंतिम एकाग्रता 2% है 3 का एक पहलू से प्रेरण मीडिया को कमजोर करने के लिए पर्याप्त जोड़कर, 6% Galactose के साथ पूरक 3x खमीर निकालने / peptone (हां) का एक समाधान जोड़कर अभिव्यक्ति का निर्माण।
    5. एक मिलाते हुए मंच पर 6 घंटे के लिए 30 डिग्री सेल्सियस पर कोशिकाओं को उत्पन्न। उचित वातन सुनिश्चित करने के लिए एक 2 एल Erlenmeyer कुप्पी का प्रयोग करें।
    6. 4 डिग्री सेल्सियस पर 5 मिनट के लिए 1,000 XG पर सेल निलंबन के 400 मिलीलीटर कताई द्वारा एक जावेद-10 (या तुलनीय) रोटर का उपयोग कर हार्वेस्ट कोशिकाओं।
    7. बर्फ की 50 मिलीलीटर ठंड पीबीएस बफर और एक 50 मिलीलीटर शंक्वाकार ट्यूब हस्तांतरण के साथ एक बार कोशिकाओं को धो लें। सेल के लिए ट्यूब-कैप तस्वीर मिली 2 करने के लिए सेल और हस्तांतरण के लिए इस्तेमाल किया (डिटर्जेंट या अन्य additives के बिना) बर्फ ठंड पीबीएस बफर में फिर से गोली धो लें।
    8. एक गोली और पिपेट दूर बफर करने के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर 1 मिनट के लिए 20,000 XG पर कोशिकाओं स्पिन।
    9. बर्फ पर ट्यूबों प्लेस और सेल कदम के साथ आगे बढ़ें।
    10. Lyse कोशिकाओं (250-350 μl गोली) 0 के साथ1: एक 1 में .5 मिमी Zirconia मोती सेल गोली, मोती, और फॉस्फेट बफर खारा (पीबीएस) के 1 मात्रा 4 डिग्री सेल्सियस पर 2 मिनट के अंतराल पर बफर और भंवर एक आंदोलन मंच 3 बार का उपयोग कर मिश्रण lysis।
    11. 4 डिग्री सेल्सियस पर 10 मिनट के लिए एक tabletop microfuge में 20,000 XG पर lysate अपकेंद्रित्र।
    12. पिपेट पॉली कार्बोनेट उच्च गति अपकेंद्रित्र ट्यूब में सतह पर तैरनेवाला और 4 डिग्री सेल्सियस पर 150,000 XG पर 30 मिनट के लिए ulracentrufugation द्वारा स्पष्ट।
    13. Histidine कब्जा करने के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर 2 घंटे के लिए एक nutator पर prewashed नी 2 + आत्मीयता राल (~ 100 μl) युक्त एक ट्यूब को स्पष्ट किया lysate स्थानांतरण और सेते हैं (उनकी) 6X V5 के संलयन प्रोटीन टैग किया।
    14. धो बफर के साथ 4 डिग्री सेल्सियस पर 10 मिनट के लिए राल तीन बार धोएं। 4 डिग्री सेल्सियस पर 1,000 XG पर 5 मिनट के लिए एक तालिका के शीर्ष सेंट्रीफ्यूज का उपयोग कर राल गोली और सतह पर तैरनेवाला महाप्राण। प्रत्येक धोने के लिए नए सिरे से धो बफर जोड़ें और धोने के दौरान ट्यूब आंदोलन के लिए nutator वापसी।
    15. धोने के बाद काएंपुनश्च पूरा कर रहे हैं, क्षालन के लिए एक नए सिरे से जी -25 स्तंभ को धोया राल लागू होते हैं।
    16. 9 भागों का एक कुल के लिए 50 मिमी वेतन वृद्धि में 500 मिमी imidazole करने के लिए 100 मिमी Imidazole के साथ शुरुआत एक कदम-वार ढंग से क्षालन बफर के 25 μl लागू करें।
    17. सोडियम dodecyl सल्फेट polyacrylamide जेल का उपयोग कर एकत्र भिन्न परख (एसडीएस पृष्ठ) और परख में इस्तेमाल के लिए सबसे अत्यधिक संवर्धित अंश (एस) की पहचान करने और -80 डिग्री सेल्सियस पर 30% और स्टोर करने के लिए ग्लिसरॉल जोड़ने के लिए Coomassie धुंधला में प्रयोग किया जाता है जब तक परख।

2. सारणियों की जांच

नोट: परख की शुरुआत से पहले एंटीबॉडी समाधान तैयार करने के लिए इस खंड के चरण 2.6 देखें।

  1. बातचीत का पता लगाने के लिए जांच के बफर में 260 एनजी / एमएल V5-फ्लोरोफोरे संयुग्मित एंटीबॉडी (यानी AlexaFluor 647) पतला और झटकों से मिश्रण अच्छी तरह से।
    नोट: उपयोग करें और एक nutat पर ट्यूब स्थान के लिए 30 मिनट से पहले इस एंटीबॉडी समाधान तैयारया या पहिया पूर्ण मिश्रण और एंटीबॉडी के एक समरूप निलंबन सुनिश्चित करने के लिए।
  2. 5-500 माइक्रोग्राम / एमएल की एकाग्रता रेंज पर V5 के संलयन प्रोटीन जांच पतला।
    नोट: जांच बफर का उपयोग, प्रत्येक प्रोटीन, प्रोटीन बातचीत परख के लिए अनुकूलित। अनुकूलन बफर जांच करने के लिए और अधिक जांच जोड़ने शामिल है। आम तौर पर 10 माइक्रोग्राम / एमएल प्रारंभिक बिंदु के रूप में प्रयोग किया जाता है और सिग्नल की शक्ति पर आधारित अनुसार समायोजित।
  3. फ्रीजर (-20 डिग्री सेल्सियस) से प्रोटीन निकालें और उपयोग करने के लिए बस से पहले फ्रिज में 4 डिग्री सेल्सियस तक लाने के लिए।
  4. रिसाव को रोकने के लिए parafilm के साथ शीर्ष प्रोटीन micorarrays युक्त स्लाइड धारक को सीधे अवरुद्ध बफर जोड़ें और कवर। 4 डिग्री सेल्सियस पर एक मंच पर 50 rpm पर झटकों से 1 घंटे के लिए बफर अवरुद्ध में सरणियों अवरुद्ध करें।
  5. अवरुद्ध करने के बाद, 4 डिग्री सेल्सियस तक ठंडा एक humidified चैम्बर के लिए सरणियों हस्तांतरण, और सीधे सरणी सतह को पतला जांच के 90 μl जोड़ें। आगमन ओवरले1.5 घंटे के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर humidified कक्ष में एक उठाया चोर पर्ची के साथ ays और स्थिर सेते (कोई मिलाते हुए)।
  6. तीन 50 मिलीलीटर शंक्वाकार ट्यूब में जांच के बफर में 1 मिनट प्रत्येक के लिए सरणियों 3 बार धोएं। पूरी तरह से स्लाइड लिफाफा करने के लिए पर्याप्त पूर्व ठंडा जांच बफर युक्त शंक्वाकार ट्यूबों के लिए स्लाइड जोड़ें। चोर पर्ची धीरे प्रोटीन माइक्रोएरे (इस सरणी सतह को नुकसान में परिणाम सकता है के रूप में इसे बंद कर लिए मजबूर नहीं है) के बंद स्लाइड करने के लिए अनुमति दें।
  7. तुरंत पहले के रूप में एक उठाया चोर पर्ची के साथ धोने (2.5 कदम) और ओवरले पूरा करने के बाद सरणी के लिए सीधे एंटीबॉडी समाधान को लागू करें। Humidified कक्ष में 4 डिग्री सेल्सियस पर 30 मिनट के लिए सरणियों सेते हैं।
  8. कमरे के तापमान पर 5 मिनट के लिए एक tabletop अपकेंद्रित्र में 800 XG पर एक 50 मिलीलीटर शंक्वाकार ट्यूब में एक ही धोने (जांच बफर में 3 बार 1 मिनट) के रूप में पहले कदम है, और स्पिन प्रदर्शन करते हैं। 647 एनएम पर सरणी स्कैनिंग करने से पहले 30 मिनट के लिए अंधेरे में एक स्लाइड धारक में सरणियों हवा शुष्क।

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Representative Results

प्रोटीन, प्रोटीन बातचीत गतिविधि Tda1-V5 के प्रोटीन काइनेज संलयन लगभग 4,200 अद्वितीय एस युक्त एक खमीर कार्यात्मक प्रोटीन माइक्रोएरे के खिलाफ एक चारा प्रोटीन के रूप में निर्माण का मूल्यांकन करने के लिए एक मानक चिप रीडर का उपयोग कर मनाया गया cerevisiae जीएसटी संलयन प्रोटीन। GenePix सॉफ्टवेयर के साथ आगे की पूछताछ के अलग-अलग तीव्रता की घटनाओं के बंधन की एक भीड़ का पता चला। आत्मीयता अपने लक्ष्य (v5-काइनेज) करने के लिए बाध्य एक मोनोक्लोनल V5-Fluorophore संयुग्मित एंटीबॉडी से निकाली गई संकेत के वर्गीकृत तीव्रता से लगाया गया था। ProCat स्कोरिंग एल्गोरिथ्म 2 (प्रत्येक प्रोटीन सरणी पर दो बार देखा है) दो प्रतियों में assayed प्रोटीन से प्रत्येक के लिए दो अलग-अलग प्रोटीन भर में प्रोटीन, प्रोटीन बातचीत की पहचान करने के लिए इस्तेमाल किया गया था, तो एक सीमा से कट ऑफ मनाया बातचीत स्कोरिंग के लिए निर्धारित किया गया था।

एक 4 तकनीकी प्रतिकृति (एन = 4) Int निर्धारित करने के लिए उपयोग कर सकते हैं कि प्राप्त दो सरणियों की तुलना करकेसहसंबंध के माध्यम से एर-परख भिन्नता सरणियों पर प्रत्येक प्रोटीन के लिए दो स्थानों में से (2 आर)। 9 प्रोटीन, प्रोटीन बातचीत की कुल Tda1-V5 के चारा प्रोटीन और अद्वितीय प्रोटीन काइनेज बातचीत 1 की पहचान करने के लिए एक पूर्वनिर्धारित सीमा का उपयोग कर माइक्रोएरे पर प्रोटीन के बीच पहचान की गई। इसके अलावा, एक ही प्रोटीन झूठी सकारात्मक योगदान कर सकते हैं कि सतह कलाकृतियों का आकलन करने के लिए एक नियंत्रण के रूप में सरणियों भर में विभिन्न स्थानों में देखा जाता है। अलग काइनेज-V5 के संलयन प्रोटीन का बंधन, कई प्रोफाइल के तुलना vivo में परीक्षण के लिए काइनेज विशिष्ट प्रोटीन, प्रोटीन बातचीत की पहचान के लिए सक्षम बनाता है।

इस प्रयोग में हम Tda1-V5 के बंधन गतिविधि का परीक्षण किया है और जांच की अन्य kinases की तुलना में पी मूल्य द्वारा क्रम के आधार पर कई महत्वपूर्ण सांख्यिकीय PPIs की पहचान की। विशेष रुचि के पिछले प्रकाशित एस में Tda1 के phosphorylated लक्ष्य के रूप में पहचान की गई है जो Rim11 है,tudy 9। लक्ष्यों की पहचान की गई है, वे विवो 1 में जैव रासायनिक और कार्यात्मक गतिविधि के लिए परीक्षण किया जा सकता है।

चित्र 1
चित्रा 1:। ~ 4200 पूरी लंबाई जीएसटी संलयन प्रोटीन के साथ दो प्रतियों में देखा खाली वेक्टर नियंत्रण की तुलना में Tda1-V5 के खमीर प्रोटीन नियंत्रण या Tda1-V5 के जांच के साथ incubated किया गया था। इनसेट पैनल दोनों सरणियों में समान क्षेत्र तुलना करती है। प्रोटीन प्रोटीन बातचीत Rim11 और Tda1-V5 के बीच (नीले बक्से) का पता चला था।

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Discussion

प्रोटोकॉल मूल विवो 1 में नए काइनेज बातचीत नेटवर्क की पहचान में जिसके परिणामस्वरूप खमीर प्रोटीन kinases के विशिष्ट और संबंधित परिवारों के पार बंधन गतिविधि तुलना करने के लिए 85 अद्वितीय खमीर प्रोटीन काइनेज-V5 के संलयन प्रोटीन का उपयोग किया गया था प्रस्तुत किया। एक उभरती हुई प्रोटिओमिक प्रोफाइलिंग प्रौद्योगिकी के रूप में, उच्च Throughput (HTP) पेप्टाइड पुस्तकालयों, और यूकेरियोटिक और प्रोकार्योटिक मॉडल जीवों 8,17 पर भरोसा प्रोटीन का उपयोग कर proteomes की स्क्रीनिंग के विकास; बाद में, इस परख मंच इस तरह के पौधे और मानव 5,7 के रूप में उच्च यूकेरियोट्स करने के लिए लागू किया गया था। वर्तमान में कोई व्यावसायिक रूप से उपलब्ध खमीर प्रोटीन सरणी है। हालांकि, अनुक्रम सीडीएनए संग्रह एकाधिक संसाधनों से उपलब्ध हैं सत्यापित

तकनीक शक्तिशाली हो सकता है, मन में रखने के लिए एक चेतावनी है, इस प्रकार के परिणाम झूठी सकारात्मक होगा, परख इन विट्रो में किया जाता है, और। इस प्रकार, optimizinजी परख हालत और सामरिक छानने योजना सार्थक डेटा पुनः प्राप्त करने के लिए सलाह दी जाती है। अगली पीढ़ी प्रोटीन माइक्रोएरे प्रौद्योगिकियों ए सहित जीवों की एक भीड़ भर में जैव रासायनिक विश्लेषण के लिए अत्यधिक शुद्ध कार्यात्मक प्रोटीन की एक बहुत बड़ी संख्या में होते हैं thaliana, एस cerevisiae, और होमो sapien।

नए प्रोटीन उन्हें में इंजीनियर है कि मिलावट के स्तर का प्रदर्शन किया जा सकता है कि जैव रासायनिक विश्लेषण का एक विशाल विविधता के लिए सक्षम बनाता है। लगभग पूरे proteome क्लोन और एस के लिए शुद्ध किया गया है cerevisiae प्रोटीन 14 के समुचित बाद translational संशोधन सुनिश्चित करने के लिए एक सी टर्मिनल की गईं पुस्तकालय का उपयोग कर। इसके अलावा, तेजी से समानांतर विश्लेषण प्रोटीन का उपयोग कर प्रोटीन, प्रोटीन बातचीत और बाद translational संशोधन की रूपरेखा के लिए एक निष्पक्ष दृष्टिकोण में सक्षम बनाता है की पेशकश की।

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Materials

Name Company Catalog Number Comments
Petri Dishes VWR NC-10747 or comparable
Bacto yeast extract Difco 0217-17
Bacto peptone Difco 0118-17
Bacto agar Difco 0140-01
Dextrose Sigma D9434
Raffinose Sigma R0514
Galactose Sigma G0750
Sc-Ura drop out media MP Bio 114410622
Small Culture tubes VWR/Fisher
Large Erlenmeyer Flask VWR/Fisher
Centrifuge JA-10 rotor
Centrifuge tubes (500 ml)
Falcon tube (50 ml) VWR/Fisher 21008-951
PBS Tablets Sigma P4417
FastPrep Tubes (2 ml screw cap tube)
FastPrep Machine MP Biomedicals 116004500
Zircon Beads BioSpec 11079105
Triton X100 Sigma P4417
DTT Sigma D9779
MgCl2 Sigma M8266 
NaCl Sigma S3014 
Imidazole (pH = 7.4) Sigma I5513 
PMSF Sigma 93482
Complete Inhibitor Cocktail (EDTA Free) Roche 11873580001
Phosphatase inhibitor cocktail 1 sigma P2850
BSA Sigma A2153 
Tween-20 Sigma P1379 
ATP Sigma A1852 
Shaking Incubator (30 °C)
Nickel Affinity Resin Life Technologies R901-01
G25 column GE life sciences 27-5325-01 
Nutator VWR/Fisher
SDS-PAGE Gel (NuPage) Life Technologies
Coomassie Blue Stain Life Technologies
Monoclonal V5 Antibody Life Technologies R960-25
Alexa647 Tagged monoclonal V5 Antibody Life Technologies 451098
Protein Microarrays Kit Life Technologies PAH0525013
Genepix Scanner Molecular Devices
Lifter Slips Thomas Scientific http://www.thomassci.com/Supplies/Microscope-Cover-Glass/_/LIFTER-SLIPS/
Lysis Buffer: 0.1% Triton X-100, 0.5 mM DTT,
2 mM MgCl2, 500 mM NaCl, 50 mM imidazole (pH 7.4), Complete protease inhibitor cocktail – EDTA-free, Phosphatase inhibitor Cocktail 1, 1 mM PMSF  (add just prior to use)		 Add the reagents to 1x PBS (0.01 M phosphate buffer, 0.0027 M potassium chloride, 0.137 M sodium chloride; pH 7.4) to obtain the desired volume of lysis solution
Blocking Buffer: 1% bovine serum albumin (BSA), 0.1% Tween-20 Add the reagents to 1x PBS to obtain the desired volume of blocking buffer
Probe Buffer: 2 mM MgCl2, 0.5 mM DTT, 0.05% Triton X-100, 50 mM NaCl, 500 μM ATP (for kinases), 1% BSA Add the reagent to 1x PBS to obtain desired volume of probe buffer
Wash Buffer: 0.1% Triton X-100, 500 mM NaCl, 0.5 mM DTT, 50 mM imidazole (pH 7.4),2 mM MgCl2 Add the reagent to 1x PBS to obtain desired volume of probe buffer
Elution Buffer: 0.1% Triton X-100, 0.5 mM DTT, 2 mM MgCl2, 500 mM NaCl, 50 – 500 mM imidazole (pH 7.4), Complete protease inhibitor cocktail – EDTA-free, Phosphatase inhibitor Cocktail 1, 1 mM PMSF (add just prior to use) Before you begin, it is important to note the concentration gradient of imidazole (50 – 500 mM) and to create separate tubes for each concentration (it is advisable to create the interval using 50 mM increments). Add the reagent to 1x PBS to obtain desired volume of probe buffer
3x YEP +6% galactose: Dissolve 30 g of yeast extract and  60 g of peptone in 700 ml of H2O, and autoclave. Add 300 ml of filter sterilized 20% galactose (wt/vol)  Galactose should not be autoclaved

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References

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सेलुलर जीवविज्ञान अंक 102 प्रोटीन काइनेज खमीर प्रोटीन प्रोटीन बातचीत
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