Summary
Utilizzando microarray proteici contenenti quasi tutta la S. cerevisiae proteoma è sondato per un rapido interrogatori imparziale di migliaia di interazioni proteina-proteina in parallelo. Questo metodo può essere utilizzato per la proteina-piccola molecola, modificazione post-traslazionale, e altri saggi in high-throughput.
Abstract
Ad alta densità di microarrays della proteina funzionali contenenti ~ 4.200 proteine ricombinanti di lievito vengono esaminati per le interazioni proteina-proteina chinasi utilizzando una proteina di fusione purificate per affinità lievito chinasi contenente un tag V5-epitopi per read-out. Chinasi purificata è ottenuto attraverso la cultura di un ceppo di lievito ottimizzato per alta copia la produzione di proteine ospitare un plasmide contenente una fusione chinasi-V5 costruire sotto un elenco indirizzi globale promotore inducibile. Il lievito viene coltivato in mezzi restrittiva con una fonte di carbonio neutro per 6 ore seguita da induzione con 2% galattosio. Successivamente, la coltura è raccolta e chinasi è purificato mediante affinità standard di tecniche cromatografiche per ottenere una proteina chinasi altamente purificata per uso nel saggio. La chinasi purificata è diluita con tampone chinasi ad una gamma appropriata per il dosaggio e microarray della proteina sono bloccate prima ibridazione con il microarray della proteina. Dopo l'ibridazione, gli array vengono sondati con un anticorpo monoclonale V5 ANTIBody per identificare le proteine legate dalla proteina chinasi-V5. Infine, gli array vengono sottoposti a scansione utilizzando uno scanner microarray standard ei dati vengono estratti per l'informatica a valle dell'analisi 1,2 per determinare una elevata fiducia insieme di interazioni proteiche per la convalida a valle in vivo.
Introduction
La necessità di effettuare analisi globali di biochimica delle proteine e di attività in vivo legame ha portato allo sviluppo di nuovi metodi di profiling interazioni proteina-proteina (PPI) e le modificazioni post-traduzionali di proteomi interi 1,3-8. Microarrays proteine sono prodotte come microarray proteici funzionali utilizzando proteine funzionali full-length 4-6,8,9 o microarrays della proteina analitiche contenenti anticorpi 10,11. Essi sono progettati per contenere una alta densità di proteine disposte su vetrini da microscopio con una varietà di chimiche superficiali per facilitare una varietà di condizioni sperimentali necessari per condurre ampio biochimico analisi 12. Nitrocellulosa e di superficie aldeide chimiche per il fissaggio chimico tramite lisina o attaccamento affinità metodi come diapositive chelati nichel per fissare le proteine His-tag e glutatione per il fissaggio affinità tra gli altri 13. L'uso di microarray della proteina funzionali per rilevare le interazioni proteina-proteina richiede l'accesso a una elevata qualità library proteina funzionale 14. S. cerevisiae è suscettibile di produrre una tale biblioteca attraverso l'abbinamento di alta copia affinità tagged costrutti di proteine ad alto throughput tecniche di purificazione cromatografica. La stragrande maggioranza del genoma del lievito è stato sequenziato e quasi l'intero proteoma può essere espresso da un plasmide alta copia per la purificazione e biochimico analisi 12. Una volta che le proteine sono ottenuti e disposte in formato da 384 pozzetti, vengono stampate su un vetrino da microscopio che permette una rapida analisi biochimica multi-parametrica parallelo e interrogatori bioinformatica 8,14-16. Microarrays della proteina sono stati utilizzati per saggi enzimatici e interazioni con proteine, lipidi, piccole molecole, e acidi nucleici tra molte altre applicazioni. L'accessibilità delle proteine sulla superficie del proteomaarray li rendono suscettibili di diversi tipi di rilevazione analitica, tra cui, immuno-affinità, risonanza plasmonica di superficie, fluorescenza e molte altre tecniche. Inoltre, esso consente un controllo preciso della condizione sperimentale dove potrebbe essere difficile da fare in vivo.
L'obiettivo di questo protocollo è quello di dimostrare l'uso appropriato di microarrays della proteina funzionali per rilevare le interazioni proteina-proteina. Questa applicazione consente l'analisi biochimica in parallelo ad alta produttività delle attività di legame alle proteine usando un analita altamente purificato (proteina) di interesse. Una C-terminale (carbossi-terminale) etichettato V5-fusione esca proteina di interesse è prodotta da un plasmide alta copia in un ceppo di lievito ottimizzato per la purificazione della proteina. C-terminale codifica assicura che l'intera lunghezza proteina è stato tradotto. La proteina utilizzata in questo studio è TDA1-V5 proteina di fusione chinasi, che viene potabilizzata con resina nichel affinità tramite un tag His6X. La costru fusione TDA1-V5t è purificato tramite eluizione seriale utilizzando un gradiente di imidazolo per eluire la frazione più altamente arricchito per l'uso nel saggio.
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Protocol
1. Preparazione della sonda
- Cultura e purificare le sonde chinasi V5-fusione utilizzate per esaminare le interazioni con altre proteine come segue:
- Utilizzare appena striato ceppo di lievito Y258 (Mata pep4-3, his4-580, ura3-53, leu2-3,112) contenenti proteine V5-fusion (espressa da GATEWAY vettoriali pYES-DEST52). Utilizzare la proteina isolata come sonda sui microarray. Piatto il lievito in sintetico complete-uracile (Sc-Ura) / 2% destrosio / Agar e crescere a 30 ° C per 3 giorni di cultura congelati (-80 ° C glicerolo magazzino).
- Seminare colture starter (5-20 ml) da una singola colonia e crescere durante la notte in Sc-Ura / 2% destrosio sulla piattaforma (220-250 giri al minuto) o la rotella che agita a 30 ° C.
- La mattina seguente, inoculare 400 ml di Sc-Ura / 2% cultura raffinosio con la cultura di avviamento sufficiente per un diametro finale 600 del 0.1.
- Crescere i inoculums a OD 600 di 0,6, seguita da induzione galattosio del fu V5-chinasisione costruire espressione aggiungendo una soluzione di 3x Yeast Extract / Peptone (YEP) supplementato con 6% galattosio, aggiungendo abbastanza per diluire il supporto di induzione di un fattore 3 in modo che la concentrazione finale di galattosio è 2%.
- Indurre le cellule a 30 ° C per 6 h su una piattaforma oscillante. Utilizzare un pallone da 2 L Erlenmeyer per garantire un'adeguata aerazione.
- Celle di raccolta utilizzando un rotore JA-10 (o comparabili) facendo girare 400 ml di sospensione cellulare a 1000 xg per 5 minuti a 4 ° C.
- Lavare le cellule una volta con 50 ml di ghiaccio tampone PBS freddo e trasferirlo in una provetta da 50 ml. Lavare il pellet di nuovo in ghiaccio PBS freddo (senza detergenti o altri additivi) utilizzati per lisi e trasferimento in 2 ml snap-cap tubi per lisi.
- Spin le cellule a 20.000 xg per 1 min a 4 ° C per un pellet e pipetta via buffer.
- Mettere le provette su ghiaccio e procedere con il passaggio di lisi.
- Lyse le cellule (250-350 ml pellet) con 00,5 millimetri perle zirconia in un 1: 1: 1 volume di pellet, perline, e PBS (PBS) Lysis Buffer e vortex la miscela utilizzando una piattaforma di agitazione per 3 volte a 2 min a intervalli di 4 ° C.
- Centrifugare il lisato a 20.000 xg in una microcentrifuga da tavolo per 10 minuti a 4 ° C.
- Dispensare surnatante in provetta da centrifuga in policarbonato ad alta velocità e chiarire da ulracentrufugation per 30 min a 150.000 xg a 4 ° C.
- Trasferire il lisato chiarificato in una provetta contenente prelavato Ni 2 + resina di affinità (~ 100 ml) e incubare su un nutator per 2 ore a 4 ° C per catturare istidina (His) 6X tagged proteine V5-fusion.
- Lavare la resina tre volte per 10 minuti a 4 ° C con tampone di lavaggio. Pellet resina utilizzando una centrifuga da tavolo per 5 min a 1000 xga 4 ° C e aspirare il surnatante. Aggiungere tampone di lavaggio fresco per ogni lavaggio e restituire il tubo del nutator per l'agitazione durante il lavaggio.
- Dopo il lavaggio steps sono completi, applicare la resina lavato per un nuovo G-25 colonna per eluizione.
- Applicare 25 microlitri di tampone di eluizione in maniera graduale iniziando con imidazolo 100 mM imidazolo 500 mM in incrementi di 50 mm per un totale di 9 frazioni.
- Analizzare frazioni raccolte utilizzando gel di sodio dodecil solfato poliacrilammide (SDS-PAGE) e colorazione Coomassie identificare la frazione (s) più altamente arricchito per l'uso nel saggio e aggiungere glicerolo al 30% e conservare a -80 ° C fino all'uso nel test.
2. Probing gli Array
NOTA: Si prega di vedere il punto 2.6 di questa sezione per preparare la soluzione di anticorpi prima di iniziare il test.
- Per rilevare le interazioni, diluire l'anticorpo coniugato V5-fluoroforo (cioè AlexaFluor 647) a 260 ng / ml in tampone sonda e mescolare accuratamente agitando.
NOTA: Preparare questa soluzione di anticorpo 30 min prima dell'uso e porre il tubo su una nutato o ruota per permettere una miscelazione completa e una sospensione omogenea di anticorpi. - Diluire la sonda proteica V5-fusione su un intervallo di concentrazione di 5-500 mg / ml.
NOTA: Ottimizzato per ogni proteina-proteina test interazione, utilizzando tampone sonda. Ottimizzazione comporta l'aggiunta più sonde per sondare buffer. Tipicamente 10 ug / ml viene usata come punto di partenza e regolati di conseguenza sulla base della forza del segnale. - Rimuovere i microarrays della proteina dal congelatore (-20 ° C) e portare a 4 ° C in frigorifero immediatamente prima dell'uso.
- Aggiungere tampone di bloccaggio direttamente al titolare diapositiva contenente i micorarrays proteine e coprire la parte superiore con parafilm per evitare perdite. Bloccare gli array in tampone bloccante per 1 ora agitando a 50 giri su un palco a 4 ° C.
- Dopo il blocco, trasferire gli array ad una camera umidificata refrigerate a 4 ° C e aggiungere 90 ml di sonda diluito direttamente sulla superficie dell'array. Sovrapporre il arrays con una scivolata sollevatore alzato e incubare statico (senza agitando) nella camera umidificata a 4 ° C per 1,5 ore.
- Lavare gli array 3 volte per 1 min ciascuna in tampone sonda in tre provette da 50 ml coniche. Aggiungere la diapositiva per provette coniche contenenti abbastanza tampone sonda pre-raffreddata a busta completamente la diapositiva. Lasciare che la polizza sollevatore di scivolare delicatamente fuori del microarray di proteine (non forzare fuori come questo potrebbe causare danni alla superficie array).
- Applicare la soluzione di anticorpi direttamente a matrice immediatamente dopo aver completato il lavaggio (passo 2.5) e overlay con una scivolata sollevatore cresciuto come prima. Incubare le matrici per 30 min a 4 ° C in camera umidificata.
- Eseguire la stessa fase di lavaggio come prima (3 volte 1 min in tampone sonda), e centrifuga in una provetta conica da 50 ml a 800 xg in una centrifuga da tavolo per 5 min a temperatura ambiente. Asciugare gli array in un supporto di diapositive al buio per 30 minuti prima scansione della matrice a 647 nm.
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Representative Results
L'attività di interazione proteina-proteina è stata osservata utilizzando un lettore di chip standard per valutare l'TDA1-V5 proteina chinasi di fusione costrutto come proteina esca contro un lievito microarray proteina funzionale contenente circa 4,200 unica S. cerevisiae proteine di fusione GST-. Ulteriore interrogatorio con il software GenePix rivelato una moltitudine di eventi di intensità variabili vincolanti. L'affinità è stato misurato l'intensità graduata del segnale derivato da un anticorpo monoclonale V5-Fluoroforo anticorpo coniugato legato al suo obiettivo (V5-chinasi). ProCat algoritmo di valutazione 2 è stato usato per identificare le interazioni proteina-proteina tra due microarray proteici separati per ciascuna delle proteine determinazione in duplicato (ogni proteina è macchiato due volte sul array), quindi una soglia di cut-off è stato determinato per aver interazioni osservate.
Confrontando due array si ottengono 4 repliche tecniche (n = 4), che possono utilizzare per determinare intvariazione er-assay per correlazione (R 2) dei due punti per ogni proteina sugli array. Un totale di 9 interazioni proteina-proteina sono stati identificati tra la proteina esca TDA1-V5 e le proteine sulla microarray utilizzando una soglia predefinita per l'identificazione di proteine uniche interazioni chinasi 1. Inoltre, le stesse proteine sono macchiati in posizioni diverse nel corso degli array come un controllo per valutare i manufatti di superficie che possono contribuire a falsi positivi. Il confronto dei profili multipli vincolanti di diverse proteine chinasi-V5 fusione consente l'identificazione di chinasi specifiche interazioni proteina-proteina per i test in vivo.
In questo esperimento abbiamo testato l'attività di legame di TDA1-V5 e identificato diversi PPI statisticamente significativi sulla base ordinati per p-value rispetto ad altre chinasi testati. Di particolare interesse è Rim11, che è stato identificato come un obiettivo fosforilata di TDA1 in un precedente s pubblicatotudy 9. Una volta che sono stati individuati obiettivi, possono essere testati per l'attività biochimica e funzionale in vivo 1.
Figura 1:. Microarrays TDA1-V5 rispetto al controllo vettoriale vuoto proteine del lievito macchiato in doppio con ~ 4.200 lunghezza proteina GST-fusione è stato incubate con controllo o sonde TDA1-V5. Pannello Inserto confronta regione identico in entrambi gli array. Interazione proteina-proteina è stata rilevata (scatole nere) tra Rim11 e TDA1-V5.
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Discussion
Il protocollo è stato originariamente presentato effettuata utilizzando 85 proteine del lievito proteine chinasi-V5 fusione unica di confrontare attività di legame attraverso distinte famiglie e connessi di protein chinasi lievito conseguente individuazione di nuove reti di interazione in vivo chinasi 1. Come un emergente tecnologia profilazione proteomica, lo sviluppo di High Throughput (HTP) proiezione del proteoma usando microarrays della proteina invocato librerie peptidiche e eucarioti e procarioti organismi modello 8,17; più tardi, questa piattaforma test è stato applicato a eucarioti superiori come impianti e 5,7 umano. Attualmente non esiste una matrice di proteine del lievito in commercio. Tuttavia, sequenza verificato collezioni di cDNA sono disponibili più risorse
Sebbene la tecnica può essere potente, un avvertimento da tenere a mente è che l'analisi viene effettuata in vitro, e, così risultati avranno falsi positivi. Così, optimizing condizione di dosaggio e lo schema di filtraggio strategico è consigliabile per recuperare i dati significativi. Tecnologie proteina microarray nuova generazione contengono un numero molto maggiore di proteine funzionali altamente purificate per l'analisi biochimica attraverso una moltitudine di organismi, tra cui A. thaliana, S. cerevisiae, e l'Homo Sapiens.
Il livello di sofisticazione che i nuovi microarray della proteina sono progettati in loro permette una varietà espansiva di analisi biochimiche che possono essere eseguite. Quasi l'intero proteoma è stato clonato e purificato per S. cerevisiae utilizzando una libreria tag C-terminale per assicurare la corretta modificazione post-traduzionale di proteine 14. Inoltre, le analisi parallele rapidi offerti utilizzando microarrays della proteina consente un approccio imparziale di interazione proteina-proteina e post-traduzionale profiling modifica.
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Petri Dishes | VWR | NC-10747 | or comparable |
| Bacto yeast extract | Difco | 0217-17 | |
| Bacto peptone | Difco | 0118-17 | |
| Bacto agar | Difco | 0140-01 | |
| Dextrose | Sigma | D9434 | |
| Raffinose | Sigma | R0514 | |
| Galactose | Sigma | G0750 | |
| Sc-Ura drop out media | MP Bio | 114410622 | |
| Small Culture tubes | VWR/Fisher | ||
| Large Erlenmeyer Flask | VWR/Fisher | ||
| Centrifuge JA-10 rotor | |||
| Centrifuge tubes (500 ml) | |||
| Falcon tube (50 ml) | VWR/Fisher | 21008-951 | |
| PBS Tablets | Sigma | P4417 | |
| FastPrep Tubes (2 ml screw cap tube) | |||
| FastPrep Machine | MP Biomedicals | 116004500 | |
| Zircon Beads | BioSpec | 11079105 | |
| Triton X100 | Sigma | P4417 | |
| DTT | Sigma | D9779 | |
| MgCl2 | Sigma | M8266 | |
| NaCl | Sigma | S3014 | |
| Imidazole (pH = 7.4) | Sigma | I5513 | |
| PMSF | Sigma | 93482 | |
| Complete Inhibitor Cocktail (EDTA Free) | Roche | 11873580001 | |
| Phosphatase inhibitor cocktail 1 | sigma | P2850 | |
| BSA | Sigma | A2153 | |
| Tween-20 | Sigma | P1379 | |
| ATP | Sigma | A1852 | |
| Shaking Incubator (30 °C) | |||
| Nickel Affinity Resin | Life Technologies | R901-01 | |
| G25 column | GE life sciences | 27-5325-01 | |
| Nutator | VWR/Fisher | ||
| SDS-PAGE Gel (NuPage) | Life Technologies | ||
| Coomassie Blue Stain | Life Technologies | ||
| Monoclonal V5 Antibody | Life Technologies | R960-25 | |
| Alexa647 Tagged monoclonal V5 Antibody | Life Technologies | 451098 | |
| Protein Microarrays Kit | Life Technologies | PAH0525013 | |
| Genepix Scanner | Molecular Devices | ||
| Lifter Slips | Thomas Scientific | http://www.thomassci.com/Supplies/Microscope-Cover-Glass/_/LIFTER-SLIPS/ | |
| Lysis Buffer: 0.1% Triton X-100, 0.5 mM DTT, 2 mM MgCl2, 500 mM NaCl, 50 mM imidazole (pH 7.4), Complete protease inhibitor cocktail – EDTA-free, Phosphatase inhibitor Cocktail 1, 1 mM PMSF (add just prior to use) |
Add the reagents to 1x PBS (0.01 M phosphate buffer, 0.0027 M potassium chloride, 0.137 M sodium chloride; pH 7.4) to obtain the desired volume of lysis solution | ||
| Blocking Buffer: 1% bovine serum albumin (BSA), 0.1% Tween-20 | Add the reagents to 1x PBS to obtain the desired volume of blocking buffer | ||
| Probe Buffer: 2 mM MgCl2, 0.5 mM DTT, 0.05% Triton X-100, 50 mM NaCl, 500 μM ATP (for kinases), 1% BSA | Add the reagent to 1x PBS to obtain desired volume of probe buffer | ||
| Wash Buffer: 0.1% Triton X-100, 500 mM NaCl, 0.5 mM DTT, 50 mM imidazole (pH 7.4),2 mM MgCl2 | Add the reagent to 1x PBS to obtain desired volume of probe buffer | ||
| Elution Buffer: 0.1% Triton X-100, 0.5 mM DTT, 2 mM MgCl2, 500 mM NaCl, 50 – 500 mM imidazole (pH 7.4), Complete protease inhibitor cocktail – EDTA-free, Phosphatase inhibitor Cocktail 1, 1 mM PMSF (add just prior to use) | Before you begin, it is important to note the concentration gradient of imidazole (50 – 500 mM) and to create separate tubes for each concentration (it is advisable to create the interval using 50 mM increments). Add the reagent to 1x PBS to obtain desired volume of probe buffer | ||
| 3x YEP +6% galactose: Dissolve 30 g of yeast extract and 60 g of peptone in 700 ml of H2O, and autoclave. Add 300 ml of filter sterilized 20% galactose (wt/vol) | Galactose should not be autoclaved |
References
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