Summary
거의 전체 (S)를 포함하는 단백질 마이크로 어레이를 사용하여 cerevisiae의 프로테옴은 병렬 단백질 - 단백질 상호 작용의 수천의 신속한 편견 심문 프로브된다. 이 방법은 단백질 - 소분자, 번역 후 수정 및 높은 처리량의 다른 분석을 위해 이용 될 수있다.
Abstract
~ 4,200 재조합 효모 단백질을 함유하는 고밀도 기능성 단백질 마이크로 어레이는 판독에 대한 V5 에피토프 태그를 함유하는 친 화성 정제 효모 키나제 융합 단백질을 사용하여 키나아제 단백질 - 단백질 상호 작용을 조사한다. 정제 키나제 키나제 V5 융합체는 GAL 유도 성 프로모터 하에서 구축 플라스미드를 함유하는 형질 높은 사본 단백질 생산을 위해 최적화 효모 균주의 배양을 통해 얻어진다. 효모는 2 %의 갈락토오스와 유도 한 다음 6 시간 동안 중립 탄소원과 제한 배지에서 성장시킨다. 그 다음, 배양 물 수거되고 키나제 분석에 사용하기위한 고순도의 단백질 키나아제를 얻었다 표준 친화 크로마토 그래피 기술을 사용하여 정제한다. 정제 키나아제 분석을 위해 적절한 범위로 키나아제 완충액으로 희석하고 단백질 마이크로 어레이는 종래 단백질 마이크로 어레이와 하이브리드 화를 차단한다. 혼성화 후, 어레이는 단클론 V5의 antib로게나ODY은 키나제-V5 단백질에 의해 결합 단백질을 식별합니다. 마지막으로, 어레이는 표준 마이크로 어레이 스캐너를 사용하여 스캔되고, 데이터는 생체 내에서 검증을 위해 하류 단백질 상호 작용의 세트 높은 신뢰도를 결정하기 위해 하류 정보학 분석 1,2- 위해 추출된다.
Introduction
단백질 생화학 및 생체 내에서 결합 활성의 글로벌 분석을 수행 할 필요가 단백질 - 단백질 상호 작용 (프로톤 펌프 억제제) 및 전체 프로테옴 1,3-8의 번역 후 변형 프로파일에 대한 새로운 방법의 발전을 가져왔다. 단백질 마이크로 어레이는 항체 (10, 11)를 포함하는 4-6,8,9 전체 길이 기능성 단백질을 사용하여 기능성 단백질 마이크로 어레이, 또는 분석 단백질 마이크로 어레이로 제조된다. 이들은 12 광범위한 분석을 생화학 실험 실시에 필요한 다양한 조건을 용이하게하기 위해, 표면의 화학 다양한 현미경 슬라이드 상에 배열 된 단백질의 고밀도를 포함하도록 설계된다. 같은 다른 사람 (13) 사이의 친 화성이 부착 그의 - 태그 단백질과 글루타티온를 연결하는 니켈 킬레이트 슬라이드로 라이신 또는 선호도 부착 방법을 통해 화학 부착 니트로 셀룰로오스와 알데히드 표면 화학. 단백질 - 단백질 상호 작용을 검출하는 기능성 단백질 마이크로 어레이를 사용하면 고품질의 기능성 단백질 라이브러리 (14)에 대한 액세스를 필요로한다. S.을 cerevisiae의 높은 처리량 크로마토 그래피 정제 기술과 단백질 구조를 태그 높은 복사 친 화성의 페어링을 통해 이러한 라이브러리를 생산하는 의무가있다. 효모 게놈의 대부분은 서열화되어 거의 전체 프로테옴 정화용 높은 카피 플라스미드로부터 발현 될 수 있으며, 생화학 (12)를 분석한다. 단백질을 수득 및 384- 웰 포맷으로 배열되면, 이들은 빠른 병렬 다중 파라 생화학 및 생물 정보학적인 분석을 가능하게 심문 8,14-16 현미경 슬라이드 상에 인쇄된다. 단백질 마이크로 어레이는 다른 많은 응용들 중 단백질, 지질, 소분자, 핵산과 효소 분석법과의 상호 작용을 위해 사용되어왔다. 프로테옴의 표면에 단백질의 접근성배열은 다음과 같은 분석 검출 다른 유형의 면역 친 화성에 그들이 순종 할 플라즈몬 공명, 형광 및 다른 많은 기술을 표면. 또한,이 생체 내에서 수행하기 어려울 수있는 실험 조건의 미세 조정을 허용한다.
이 프로토콜의 목적은 단백질 - 단백질 상호 작용을 검출하는 기능성 단백질 마이크로 어레이의 적절한 사용을 설명한다. 이 애플리케이션은 관심 고순도 검체 (단백질)를 사용하여 단백질 결합 활동 높은 처리량 병렬 생화학 분석을 가능하게한다. C 말단 (말단 카복시) 관심 V5 미끼 융합 단백질 단백질 정제를 위해 최적화 된 효모 균주에서 높은 카피 플라스미드로부터 생성되는 태그. C 말단 태깅 전장 단백질 번역 한 것을 보장한다. 본 연구에 사용 된 단백질은 His6X 태그를 통해 니켈 친 화성 수지를 사용하여 정제한다 Tda1-V5 융합 단백질 키나아제이다. Tda1-V5 융합 CONSTRUCt는 분석법에 사용하기에 가장 고농축 분획을 용리 이미 다졸 구배를 사용하여 용출을 통해 직렬 정제한다.
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Protocol
1. 프로브 준비
- 문화 다음과 다른 단백질과의 상호 작용을 조사하기 위해 사용 V5 융합 키나제 프로브를 정제 :
- 갓 줄무늬 효모 균주 Y258을 사용 (마타 pep4-3, his4-580, ura3-53, leu2-3,112) (게이트웨이 벡터 pYES-DEST52에서 표현) V5 융합 단백질을 포함. 마이크로 어레이에 프로브로 분리 된 단백질을 사용합니다. 합성 완료 - 우라실 (SC-URA) / 2 % 덱 스트로스 / 한천의 효모 플레이트 및 냉동 문화 (-80 ° C 글리세롤 주)에서 3 일간 30 ℃에서 성장한다.
- 하나의 식민지에서 스타터 문화 (5 ~ 20 ㎖)에 접종하고 30 ℃에서 플랫폼 (220-250 RPM) 또는 휠을 흔들어에 사우스 캐롤라이나 우라 / 2 % 포도당에서 하룻밤 성장.
- 다음 날 아침, 최종 OD 0.1 600에 충분한 스타터 문화와 사우스 캐롤라이나 우라 / 2 %의 라 피노 오스 문화의 400 ml에 접종.
- 0.6 (600)는 V5 키나아제 쿵푸의 갈락토스 유도 다음 OD하기 위해 접종 성장시온 그래서 갈락토스의 최종 농도가 2 % 인 (3)의 인자에 의해 유도 배지를 희석하기에 충분히 첨가하여, 6 % 갈락토스로 보충 3X 효모 추출물 / 펩톤 (YEP)의 용액을 첨가함으로써 발현을 구성.
- 흔들리는 플랫폼에서 6 시간 동안 30 ° C에서 세포를 유도한다. 적절한 통풍을 보장하기 위해 2 L 삼각 플라스크를 사용합니다.
- 4 ° C에서 5 분 동안 1,000 XG에 세포 현탁액 400ml를 회전하여 JA-10 (또는 유사한) 로터를 사용하여 세포를 수확.
- 얼음 50 ml의 차가운 PBS는 버퍼와 50 ML 원뿔 튜브로 전송 한 번 세포를 씻으십시오. 용해를위한 튜브 캡 스냅 ㎖로 2 용해 및 전송에 사용 (세제 또는 기타 첨가제없이) 얼음 차가운 PBS 버퍼에 다시 펠렛을 씻으십시오.
- 펠릿을 피펫 거리 버퍼 4 ° C에서 1 분간 20,000 XG에서 세포를 스핀.
- 얼음에 튜브를 넣고 용해 단계를 진행합니다.
- 를 Lyse 세포 (250-350 μL 펠렛) 0과1 : 1에서 0.5 mm의 지르코니아 비드를 세포 펠렛, 비드, 인산염 완충 식염수 (PBS)를 1 볼륨을 4 ℃에서 2 분 간격으로 버퍼와 소용돌이를 교반 플랫폼을 3 회 사용하여 혼합물을 용해.
- 4 ℃에서 10 분 동안 탁상의 microfuge에 20,000 XG에 해물을 원심 분리기.
- 피펫 폴리 카보네이트 고속 원심 분리기 튜브에 뜨는 4 ° C에서 15 만 XG에 30 분 동안 ulracentrufugation에 의해 명확하게.
- 히스티딘을 캡처 4 ℃에서 2 시간 동안 nutator에 미리 세척 니켈 2 + 친 화성 수지 (~ 100 μL)를 포함하는 튜브에 명확히 해물을 전송하고 부화 (그의) 6X는 V5-융합 단백질 태그.
- 세척 버퍼와 4 ℃에서 10 분 동안 수지 세 번 씻으십시오. 4 ° C에서 1,000 XG에서 5 분을위한 테이블 탑 원심 분리기를 사용하여 수지 펠렛과 뜨는을 대기음. 각 세척 신선한 세척 버퍼를 추가하고 세척하는 동안 튜브를 교반에 대한 nutator을 반환합니다.
- 세척 인트 후PS이 완료, 용출에 대한 신선한 G-25 컬럼 세척 수지를 적용합니다.
- 9 분획의 총 50 밀리미터 단위 500 mM의 이미 다졸을 100 mM의 이미 다졸로 시작 단계적인 방식으로 용출 완충액 25 μl를 적용한다.
- 소듐 도데 실 설페이트 폴리 아크릴 아미드 겔을 사용하여 수집 된 분획을 분석 (SDS-PAGE) 및 분석에서의 사용을 위해 가장 고농축 분획 (들)을 식별하고 -80 ° C에서 30 %와 저장소에 글리세롤을 추가 쿠마시 염색에 사용까지 분석.
2. 배열 프로브
참고 : 분석을 시작하기 전에 항체 용액을 제조하는이 섹션의 단계 2.6을 참조하십시오.
- 상호 작용을 검출하는 프로브 버퍼에 260 ng를 / ㎖로 V5-형광 물질 항체 (예 : AlexaFluor 647)를 희석 흔들어 잘 섞는다.
참고 : 사용하고 nutat에 튜브를 배치 30 분 이전에이 항체 솔루션을 준비또는 또는 휠 완전한 혼합 및 항체의 균질 한 현탁액을 보장합니다. - 5-500 μg의 / ml의 농도 범위 V5 융합 단백질 프로브를 희석.
주 : 프로브 버퍼를 사용하여 각각의 단백질 - 단백질 상호 작용 분석을 위해 최적화. 최적화 버퍼를 조사하기 위해 더 많은 프로브를 추가 포함한다. 일반적으로 10 μg의 / ml의 시작점으로 이용되고, 신호 강도에 기초하여 적절하게 조정. - 냉동 (-20 ℃)에서 단백질 마이크로 어레이를 제거하고 사용하기 직전에 냉장고에 4 ℃에 가져다.
- 누출을 방지하기 위해 파라 필름으로 위쪽 micorarrays 단백질을 함유하는 슬라이드 홀더에 직접 블로킹 완충액 추가 커버. 4 ° C에서 무대에서 50 rpm으로 흔들어 1 시간 동안 버퍼를 차단하는 배열을 차단합니다.
- 차단 한 후, 4 ℃로 냉각 가습 실에 배열을 전송, 직접 배열 표면에 희석 프로브의 90 μl를 추가합니다. 도착 오버레이1.5 시간 동안 4 ℃에서 가습 실에서 제기 리프터 슬립 AYS 및 정적 배양 (NO 떨고).
- 세 50 ML 원뿔 튜브 프로브 버퍼에 1 분마다 배열하는 과정을 3 회 반복한다. 완전히 슬라이드를 봉투에 충분한 사전 냉장 프로브 버퍼를 포함하는 원뿔 튜브 슬라이드를 추가합니다. 리프터 슬립 부드럽게 단백질 마이크로 어레이 (이 어레이의 표면에 손상을 줄 수 있기를 강제로 해제하지 않음)의 미끄러하도록 허용합니다.
- 바로 이전 제기 리프터 슬립 세척 (단계 2.5) 및 오버레이를 완료 한 후 배열에 직접 항체 용액을 적용합니다. 습윤 챔버에서 4 ° C에서 30 분 동안 인큐베이션 배열.
- 실온에서 5 분 동안 원심 탁상 800 XG에 50 ㎖ 원뿔형 튜브에 동일한 워시 (프로브 버퍼에서 1 분 3 회) 전 단계로서, 스핀을 수행한다. 647 nm에서 배열을 스캔하기 전에 30 분 동안 어둠 속에서 슬라이드 홀더에 배열을 공기 - 건조.
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Representative Results
단백질 - 단백질 상호 작용 활성 Tda1-V5 단백질 키나제 융합 약 4,200 고유 S. 함유 효모 기능성 단백질 마이크로 어레이에 대해 미끼 단백질로서 구성 평가하는 표준 칩 판독기를 사용하여 관찰 cerevisiae의 GST 융합 단백질. 제품, GenePix 소프트웨어 또한 심문은 다양한 강도의 이벤트를 바인딩의 다수를 한 것으로 밝혀졌습니다. 친화도는 목표 (V5 키나아제)에 결합 모노클 V5 항체 - 형광 물질로부터 유도 된 신호의 강도 등급에서 계측 하였다. ProCat 스코어링 알고리즘 2 (각 단백질 어레이에 두 번 발견되는) 이중으로 분석 단백질 각각에 대한 두 개의 별도의 단백질 마이크로 어레이에 걸쳐 단백질 - 단백질 상호 작용을 확인하는 데 사용 된 후 임계 컷오프가 관찰 상호 작용을 처치 구 하였다.
하나 4 기술은 복제 (N = 4) INT를 결정하기 위해 사용할 수있는 두 개의 배열을 취득 비교함으로써상관 관계를 통해 ER-분석 변형 배열의 각 단백질의 두 지점의 (R 2). 9 단백질 - 단백질 상호 작용의 총 Tda1-V5 미끼 단백질 및 고유 단백질 키나아제의 상호 작용을 식별하기위한 한 사전 정의 된 임계 값을 사용하여 마이크로 어레이 단백질 사이 확인되었다. 또한, 동일한 단백질은 가양에 기여할 수있다 표면 아티팩트를 평가하기위한 대조군으로서 배열에 걸쳐 서로 다른 위치에서 발견된다. 상이한 키나제 V5 융합 단백질의 다중 결합 프로파일의 비교는 생체 내 테스트에 대한 특정 단백질 키나제 - 단백질 상호 작용의 확인을 가능하게한다.
이 실험에서 우리는 Tda1-V5의 결합 활성을 시험하고 테스트 다른 키나제에 비해 P 값에 의해 평가를 기반으로 여러 가지 통계적으로 유의 한 프로톤 펌프 억제제를 확인했다. 특히 관심의 이전 발표의에서 Tda1의 인산화 대상으로 확인되었습니다 Rim11입니다tudy 9. 대상이 확인되고 나면, 그들은 생체 내 1 생화학 적 및 기능적 활동에 대해 테스트 할 수 있습니다.
그림 1 :. ~ 4,200 전체 길이 GST 융합 단백질과 중복 발견 빈 벡터 제어에 비해 Tda1-V5 효모 단백질 마이크로 어레이 제어 또는 Tda1-V5 프로브와 함께 배양 하였다. 삽입 된 패널은 두 배열에 동일한 지역을 비교합니다. 단백질 - 단백질 상호 작용은 Rim11 및 Tda1-V5 사이에 (파란색 상자)을 검출 하였다.
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Discussion
프로토콜은 원래 생체 한 새로운 키나제 상호 작용 네트워크의 식별 결과 효모 단백질 키나제의 구별과 관련 제품군 간의 결합 활성을 비교하는 (85) 고유의 효모 단백질 키나제 V5 융합 단백질을 사용하여 수행 하였다 선보였다. 신흥 프로테옴 프로파일 링 기술로, 높은 처리량 (HTP) 펩타이드 라이브러리, 진핵 생물과 원핵 생물의 모델 생물 8,17에 의존 단백질 마이크로 어레이를 이용하여 프로테옴의 선별 검사의 개발; 이후, 이러한 분석 플랫폼은 식물과 인간의 5,7- 등의 고급 진핵 세포에 적용 하였다. 현재 어떤 상업적으로 이용 가능한 효모 단백질 어레이는 없다. 그러나 순서는 cDNA를 수집 여러 자원에서 사용할 수있는 검증
기술이 강력 할 수 있지만, 염두에 두어야 하나주의해야 할 점은, 따라서 결과는 오탐 (false positive)이있을 것이다, 분석은 시험 관내에서 수행되는 것을, 그리고. 따라서, optimizinG 분석 조건과 전략적 필터링 방식은 의미있는 데이터를 검색하는 것이 좋습니다. 차세대 단백질 마이크로 어레이 기술은 A. 등 유기체에 걸쳐 다수의 생화학 분석을위한 고도로 정제 된 단백질의 기능적 훨씬 큰 숫자를 포함 장대, S. cerevisiae에, 그리고 호모 사피엔스.
새로운 단백질 마이크로 어레이는 그들로 설계 한 정교한 수준이 수행 될 수있다 생화학 분석 넓은 다양성을 가능하게한다. 거의 전체 프로테옴은 복제 및 S에 대한 정제 된 세레 비지는 단백질 14의 적절한 번역 후 변형을 보장하기 위해 C 말단 태그 라이브러리를 사용. 또한, 분석은 급속한 평행 단백질 마이크로 어레이를 사용하여 단백질 - 단백질 상호 작용과 번역 후 변형 프로파일에 접근을 가능하게 편향 제공.
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Petri Dishes | VWR | NC-10747 | or comparable |
| Bacto yeast extract | Difco | 0217-17 | |
| Bacto peptone | Difco | 0118-17 | |
| Bacto agar | Difco | 0140-01 | |
| Dextrose | Sigma | D9434 | |
| Raffinose | Sigma | R0514 | |
| Galactose | Sigma | G0750 | |
| Sc-Ura drop out media | MP Bio | 114410622 | |
| Small Culture tubes | VWR/Fisher | ||
| Large Erlenmeyer Flask | VWR/Fisher | ||
| Centrifuge JA-10 rotor | |||
| Centrifuge tubes (500 ml) | |||
| Falcon tube (50 ml) | VWR/Fisher | 21008-951 | |
| PBS Tablets | Sigma | P4417 | |
| FastPrep Tubes (2 ml screw cap tube) | |||
| FastPrep Machine | MP Biomedicals | 116004500 | |
| Zircon Beads | BioSpec | 11079105 | |
| Triton X100 | Sigma | P4417 | |
| DTT | Sigma | D9779 | |
| MgCl2 | Sigma | M8266 | |
| NaCl | Sigma | S3014 | |
| Imidazole (pH = 7.4) | Sigma | I5513 | |
| PMSF | Sigma | 93482 | |
| Complete Inhibitor Cocktail (EDTA Free) | Roche | 11873580001 | |
| Phosphatase inhibitor cocktail 1 | sigma | P2850 | |
| BSA | Sigma | A2153 | |
| Tween-20 | Sigma | P1379 | |
| ATP | Sigma | A1852 | |
| Shaking Incubator (30 °C) | |||
| Nickel Affinity Resin | Life Technologies | R901-01 | |
| G25 column | GE life sciences | 27-5325-01 | |
| Nutator | VWR/Fisher | ||
| SDS-PAGE Gel (NuPage) | Life Technologies | ||
| Coomassie Blue Stain | Life Technologies | ||
| Monoclonal V5 Antibody | Life Technologies | R960-25 | |
| Alexa647 Tagged monoclonal V5 Antibody | Life Technologies | 451098 | |
| Protein Microarrays Kit | Life Technologies | PAH0525013 | |
| Genepix Scanner | Molecular Devices | ||
| Lifter Slips | Thomas Scientific | http://www.thomassci.com/Supplies/Microscope-Cover-Glass/_/LIFTER-SLIPS/ | |
| Lysis Buffer: 0.1% Triton X-100, 0.5 mM DTT, 2 mM MgCl2, 500 mM NaCl, 50 mM imidazole (pH 7.4), Complete protease inhibitor cocktail – EDTA-free, Phosphatase inhibitor Cocktail 1, 1 mM PMSF (add just prior to use) |
Add the reagents to 1x PBS (0.01 M phosphate buffer, 0.0027 M potassium chloride, 0.137 M sodium chloride; pH 7.4) to obtain the desired volume of lysis solution | ||
| Blocking Buffer: 1% bovine serum albumin (BSA), 0.1% Tween-20 | Add the reagents to 1x PBS to obtain the desired volume of blocking buffer | ||
| Probe Buffer: 2 mM MgCl2, 0.5 mM DTT, 0.05% Triton X-100, 50 mM NaCl, 500 μM ATP (for kinases), 1% BSA | Add the reagent to 1x PBS to obtain desired volume of probe buffer | ||
| Wash Buffer: 0.1% Triton X-100, 500 mM NaCl, 0.5 mM DTT, 50 mM imidazole (pH 7.4),2 mM MgCl2 | Add the reagent to 1x PBS to obtain desired volume of probe buffer | ||
| Elution Buffer: 0.1% Triton X-100, 0.5 mM DTT, 2 mM MgCl2, 500 mM NaCl, 50 – 500 mM imidazole (pH 7.4), Complete protease inhibitor cocktail – EDTA-free, Phosphatase inhibitor Cocktail 1, 1 mM PMSF (add just prior to use) | Before you begin, it is important to note the concentration gradient of imidazole (50 – 500 mM) and to create separate tubes for each concentration (it is advisable to create the interval using 50 mM increments). Add the reagent to 1x PBS to obtain desired volume of probe buffer | ||
| 3x YEP +6% galactose: Dissolve 30 g of yeast extract and 60 g of peptone in 700 ml of H2O, and autoclave. Add 300 ml of filter sterilized 20% galactose (wt/vol) | Galactose should not be autoclaved |
References
- Fasolo, J., et al. Diverse protein kinase interactions identified by protein microarrays reveal novel connections between cellular processes. Genes. 25, 767-778 (2011).
- Zhu, X., Gerstein, M., Snyder, M. ProCAT: a data analysis approach for protein microarrays. Genome biology. 7, R110 (2006).
- Breitkreutz, A., et al. A global protein kinase and phosphatase interaction network in yeast. Science. 328, 1043-1046 (2010).
- Gavin, A. C., et al. Functional organization of the yeast proteome by systematic analysis of protein complexes. Nature. 415, 141-147 (2002).
- Jeong, J. S., et al. Rapid identification of monospecific monoclonal antibodies using a human proteome microarray. Mol Cell Proteomics. 11 (6), (2012).
- Krogan, N. J., et al. Global landscape of protein complexes in the yeast Saccharomyces cerevisiae. Nature. 440, 637-643 (2006).
- Popescu, S. C., et al. Differential binding of calmodulin-related proteins to their targets revealed through high-density Arabidopsis protein microarrays. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 104, 4730-4735 (2007).
- Zhu, H., et al. Global analysis of protein activities using proteome chips. Science. 293, 2101-2105 (2001).
- Ptacek, J., et al. Global analysis of protein phosphorylation in yeast. Nature. 438, 679-684 (2005).
- Haab, B. B. Antibody arrays in cancer research. Molecular & cellular proteomics. Mol Cell Proteomics. 4 (4), 377-383 (2005).
- Kopf, E., Zharhary, D. Antibody arrays--an emerging tool in cancer proteomics. The international journal of biochemistry & cell biology. 39, 1305-1317 (2007).
- Berrade, L., Garcia, A. E., Camarero, J. A. Protein microarrays: novel developments and applications. Pharmaceutical research. 28, 1480-1499 (2011).
- Balboni, I., Limb, C., Tenenbaum, J. D., Utz, P. J. Evaluation of microarray surfaces and arraying parameters for autoantibody profiling. Proteomics. 8, 3443-3449 (2008).
- Gelperin, D. M., et al. Biochemical and genetic analysis of the yeast proteome with a movable ORF collection. Genes & development. 19, 2816-2826 (2005).
- Fasolo, J., Snyder, M. Protein microarrays. Methods Mol. Biol. 548, 209-222 (2009).
- Im, H., Snyder, M., et al. Preparation of recombinant protein spotted arrays for proteome-wide identification of kinase targets. Current protocols in protein science. Coligan, J. E. 27, Unit 27 24 (2013).
- MacBeath, G., Schreiber, S. L. Printing proteins as microarrays for high-throughput function determination. Science. 289, 1760-1763 (2000).
