Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove

Neuroscience

Snelle Genotypering van dieren Gevolgd door Vaststelling Primaire culturen van neuronen in de hersenen

doi: 10.3791/51879 Published: January 29, 2015
* These authors contributed equally

Summary

We beschrijven procedures voor etikettering en genotypering pasgeboren muizen en het genereren van primaire neuronale kweken van hen. De genotypering is snel, efficiënt en betrouwbaar, en maakt geautomatiseerde nucleïnezuur extractie. Dit is vooral handig neonataal dodelijke muizen en culturen die voorafgaande afronding genotyperen vereisen.

Abstract

Hoge-resolutie analyse van de morfologie en functie van zoogdierneuronen vereist vaak de genotypering van individuele dieren, gevolgd door de analyse van primaire kweken van neuronen. We beschrijven een reeks procedures voor: het labelen van pasgeboren muizen worden gegenotypeerd, snelle genotypering, en tot oprichting van een lage dichtheid culturen van neuronen in de hersenen van deze muizen. Individuele muizen worden gelabeld door tatoeëren, die zorgt voor langdurige identificatie blijvend in de volwassenheid. Genotypering van het beschreven protocol is snel en efficiënt en maakt geautomatiseerde extractie van nucleïnezuur goede betrouwbaarheid. Dit is nuttig in omstandigheden waarin voldoende tijd conventionele genotypering niet beschikbaar, bijvoorbeeld in muizen die lijden neonatale sterfte. Primaire neuronale culturen worden gegenereerd bij een lage dichtheid, die beeldvorming experimenten mogelijk maakt bij een hoge ruimtelijke resolutie. Deze cultuur methode vereist de voorbereiding van gliale feeder lagen voorafgaand aan neuronale plating. De pROTOCOL wordt toegepast in zijn geheel een muismodel van de bewegingsstoornis DYT1 dystonie (AE-Torsina knock-in muizen) en neuronale culturen worden bereid uit de hippocampus, cerebrale cortex en striatum van deze muizen. Dit protocol kan worden toegepast op muizen met andere genetische mutaties, alsmede dieren van andere soorten. Verder kunnen de afzonderlijke componenten van het protocol worden gebruikt voor geïsoleerde deelprojecten. Zo zal dit protocol hebben brede toepassingen, niet alleen in de neurowetenschappen, maar ook in andere gebieden van de biologische en medische wetenschappen.

Introduction

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Knaagdiermodellen van genetische ziekten nuttig bij het vaststellen van de normale fysiologische functies van eiwitten en nucleïnezuren, en de pathofysiologische gevolgen van defecten in deze bewezen. Voorbeelden omvatten muizen deficiënt voor eiwitten die betrokken zijn bij essentiële cellulaire functies, evenals muismodellen van aandoeningen zoals de ziekte van Alzheimer. Toch kunnen bepaalde genetische manipulaties leiden tot neonatale sterfte kort of een paar dagen na de geboorte. In deze gevallen primaire celculturen een belangrijk instrument omdat levende cellen kunnen worden verkregen uit de embryonale of neonatale pups voor sterfte kunnen zij gedurende ten minste enkele weken in vitro, en gedurende deze tijd vroege neuronale ontwikkeling kan worden gevolgd door biochemische, functionele en morfologische experimenten. Voor de primaire kweken, kan het voordelig zijn de neuronen bij lage dichtheid plaat; dit maakt het mogelijk de individuele cellichamen, dendrieten, axonale assen en zenuw beëindiging visualiserennals bij hoge ruimtelijke resolutie. De overleving en differentiatie van neuronen bij lage dichtheid vereist gewoonlijk dat ze uitgeplaat op een gliale feeder layer, samen gekweekt met gliale cellen in afwezigheid van fysiek contact met hen, of gekweekt in medium geconditioneerd door glia 1.

De oprichting van lage dichtheid neuronale culturen gliale feeder lagen kan afhankelijk snelle en betrouwbare genotypering vooraf zijn - binnen een paar uur in tegenstelling tot een paar dagen. Snelheid is vooral belangrijk wanneer de neuronale genotype moet worden aangepast aan die van een gliale feeder layer vooraf voorbereid. Als een praktisch voorbeeld, kan het nodig zijn om te beslissen welke pups waarvan genotype voor gebruik in het genereren culturen, de efficiëntie van een experiment optimaliseren.

Hier laten we zien het werken protocol dat is gebruikt voor een snelle, eenvoudige en betrouwbare muis genotypering in eerdere publicaties 2-6. Muis staarten eneen commercieel verkrijgbare kit gebruikt. Dit protocol omvat één fase extractie van nucleïnezuren uit het weefsel, en vereist noch een nucleïnezuur zuiveringsstap noch het gebruik van een buffer beëindigd ("stop solution). De betrouwbaarheid van deze genotyperingsmethode illustreert waarin de resultaten van een reeks proeven bij verschillen wordt geïntroduceerd ten opzichte van het uitgangsbedrag van de specimens, de leeftijd van de dieren en de lengte van de PCR amplicons. Deze kit biedt de voordelen van geautomatiseerde extractie en betrouwbaarheid.

Omwille van zijn uitgebreid, wordt het gebruik van tatoeage voor identificatie van het genotype muizen lange termijn eveneens aangetoond. Tatoeage wordt bereikt door tatoeage inkt naar de dermis van de huid (onder de epidermis) 7. Een werkwijze wordt beschreven voor het tatoeëren de voetzolen van pasgeboren of 1 dag oude muizen, hoewel tatoeages kunnen worden toegepast op andere delen van het lichaam, zoals staarten en tenen, en Animals van alle leeftijden. Bovendien zullen procedures worden aangetoond plateren en kweken muis neuronen bij een lage dichtheid, gebaseerd op geoptimaliseerde bereiding van verschillende gliale feeder lagen 2,8.

We maken gebruik van een genetische muismodel van de erfelijke neurologische aandoening DYT1 dystonie - een autosomaal-dominante stroming aandoening veroorzaakt door een mutatie in het gen TOR1A (c.904_906delGAG / c.907_909delGAG; p.Glu302del / p.Glu303del) 9. Het gecodeerde eiwit, Torsina, behoort tot de "ATPasen geassocieerd met diverse cellulaire activiteiten" (AAA +) familie van eiwitten, waarvan de leden doorgaans uitgevoerd chaperone-achtige functies, assisteren in: eiwitontvouwende, eiwit-complex demontage, membraantransport en vesikel fusie 10-13. De mutatie leidt tot een in-frame deletie van een codon voor glutaminezuur, en kan leiden tot manifestatie van "early-onset algemene geïsoleerd dystonie '14,15. De padophysiological mechanismen die verantwoordelijk zijn voor deze aandoening blijven slecht begrepen. In een knock-in muismodel, de mutant allel is Tor1a tm2Wtd, hierna genoemd als Tor1a AE. Heterozygote AE-Torsina knock-in muizen zijn levensvatbaar en genetisch bootsen menselijke patiënten met DYT1 dystonie, terwijl homozygote knock-in muizen na de geboorte sterven 16,17, met de latency tot postnatale dood beïnvloed door genetische achtergrond 18. De vroege dood van homozygote knock-in muizen noodzakelijk dat zowel de genotypering van dieren en de instelling van neuronale kweken snel voltooid. Als een ander voorbeeld van genotypering, Tfap2a (transcriptiefactor AP-2α activerende enhancer bindend eiwit 2α) gebruikt. De proteïne gecodeerd door dit gen is belangrijk bij het ​​reguleren meerdere cellulaire processen, zoals proliferatie, differentiatie, overleving en apoptose 19.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

OPMERKING: Alle dierlijke procedures uitgevoerd in dit onderzoek werden goedgekeurd door de Institutional Animal Care en gebruik Comite van de Universiteit van Iowa.

1. Langdurig Identificatie van Muizen met behulp Tatoeëren de voetzolen

  1. Immobiliseren een poot met de poot pad (voetzool) tegenover de experimentator. Houd de poot met de duim en de wijsvinger. Wees voorzichtig de poot niet bekneld raken.
    OPMERKING: Stabiele immobilisatie is belangrijk dat de tatoeage pigment wordt in de dermis van de poot pad, dus permanent 7.
  2. Zwabberen de poot pad met 70% ethanol op een gaasje spons of doekje.
  3. Gelden de huid olie tot een wattenstaafje, en druk de tip tegen het oppervlak van de poot pad meerdere malen. Gebruik slechts een kleine hoeveelheid huidolie; wanneer aanwezig in grote hoeveelheden, zal voorkomen dat de tatoeagepigment de huid bereikt.
  4. Dompel de uiteinden van de tattoo naalden in de tatoeage inkt net voorafgaandte tatoeëren. Gebruik schone, aseptische en scherpe tatoeage naalden, om de pijn en de mogelijkheid van infectie te verminderen en ook om de tatoeage te verhogen.
  5. Terwijl de poot pad oppervlak is bedekt met de huid olie, drukt u op de tattoo naald tips verticaal en licht tegen de huid in het midden van de poot pad, en spuit de inkt meerdere keren. Zie tabel van Materialen / Apparatuur voor informatie over elektrische tatoeëren systeem.
  6. Spray 70% ethanol op een gaas spons, druk hem voorzichtig tegen de poot aan extra tatoeage pigment te verwijderen op het huidoppervlak en inspecteren van de kwaliteit van de tattoo. Controleer of het midden van de poot pad heeft een donkere, ronde plek die afwijkt van de normale pigmentatie van de huid. Als de tatoeage is niet donker of groot genoeg voor gemakkelijk bekijken, herhaalt u de stappen voor het tatoeëren.

2. Genotypering Pasgeboren Muizen Met behulp van een Fast PCR Genotyping Kit

  1. Desinfecteren het distale uiteinde van een muis staart met 70% ethanol, gesneden 5 mm of minder van de staarttip en overgebracht naar een buis van een 8-buis strip van de soort gebruikt voor PCR. Gebruik een ongebruikte scheermesje voor elke pup om kruisbesmetting tussen de monsters te voorkomen. Alternatief, gebruik een schaar, maar in dit geval, voorzichtig en grondig verwijderen restmateriaal op de bladen met 70% ethanol. Controleer voor bloeden. Als bloeden optreedt, gelden druk om de cut deel van de staart met een gaasje spons tot bloeden is gestopt.
  2. Voeg 200 ul van DNA extractie-oplossing aan elke PCR buis die een monster. Zie tabel van Materialen / Apparatuur voor de samenstelling en informatie over de kit.
  3. Plaats de buis contactdoos een PCR thermal cycler en start de DNA extractie met behulp van het volgende programma: 1 cyclus bij 55 ° C gedurende 10 min, 1 cyclus bij 95 ° C gedurende 10 min, en bewaren bij 4 ° C.
    Opmerking: Dit is dezelfde PCR thermische cycler die later wordt gebruikt voor PCR.
  4. Na de DNA-extractie is voltooid, verwijdert u de buis strip uit het PCR-apparaat eennd omkeren 5 keer.
  5. Overdracht 4 pl van de oplossing (DNA-extract) van elk monster aan een niet-gebruikte buis van een 8-buis strip, en meng met: 10 ul van 2X PCR Ready Mix II, 2 pl gemengde vooruit en achteruit primers (aanbevolen bij 0,5 uM zie Tabel Materiaal / Apparatuur voor sequenties), en 4 pl nuclease-vrij H2O voor elk specimen. Spin in het kort (bijvoorbeeld, 3 sec) met behulp van een table-top centrifuge. Houd de buizen op ijs te allen tijde behalve het hanteren.
  6. Voeren thermische fietsen. Zien Tafel van Materialen / Apparatuur voor de thermische programma.
  7. Detecteer geamplificeerde DNA-producten. Laad de totale reactieoplossing uit de PCR (20 ul) direct in een putje van een agarosegel. Laad het molecuulgewicht merkers in een aparte goed. Toepassing van een elektrisch veld.
  8. Verwerven fluorescentie beelden van de banden onder ultraviolet licht.

3. Primaire Cultuur van de hersenen van muizen Neurons op Gliale Feeder Layer

OPMERKING: De procedures voor de hersenen dissectie en celdissociatie (3.1) zijn gemeenschappelijk voor alle verdere procedures. De procedures voor muizen glialculturen (3.2), ratten gliale culturen (3.3) en muis neuronale kweken (3,4) worden afzonderlijk daarna beschreven.

  1. Brain Dissection en Cellulaire Dissocaiation
    1. Offeren een muis of rat pup door onthoofding, het snel verwijderen van de hersenen, en plaats deze in Hanks 'oplossing (zie tabel 1 voor de samenstelling) + 20% foetaal serum (FBS) in een schaal van 35 mm (op ijs bewaard).
    2. Snijd de hersenen door middel van de middellijn in twee hersenhelften. Verwijder het gebied van belang (bijvoorbeeld cerebrale cortex, striatum en hippocampus) van elke hersenhelft. Verwijder de hersenvliezen en grote bloedvaten van het oppervlak. Snijd de hersenen regio in 4-10 dunne plakjes met een chirurgisch mes.
    3. Spoel de plakjes hersenen in een 15 ml centrifugebuis, eens with Hanks 'oplossing + 20% FBS, vervolgens 3 keer met Hanks' oplossing (dus zonder serum) (alle bij 4 ° C). Spoelen, voeg 5-10 ml oplossing, laat de hersenplakken bezinken op de bodem van de buis zuigen de oplossing van boven, en voeg een verse oplossing. Beëindig de spoelen procedure door opzuigen van de oplossing.
    4. Filtreer 2 ml trypsine bevattende digestie oplossing (zie tabel 1 voor samenstelling) met een 3 ml spuit en een 0,2 urn spuitfilter en voeg het filtraat direct in de buis met de hersencoupes. Laat de trypsine verlopen gedurende 13 min bij kamertemperatuur.
    5. Neutraliseer de trypsine oplossing eerst door afzuigen meeste en vervolgens door toevoeging van 7-10 ml Hanks 'oplossing + 20% FBS (4 ° C).
    6. Spoel de hersenen plakjes, tweemaal met Hank's oplossing + 20% FBS, en vervolgens driemaal met Hanks 'oplossing (zonder serum) (alle bij 4 ° C). Beëindig de spoelen procedure door het opzuigen van de solution.
    7. Filtreer 2 ml van de dissociatie oplossing (zie tabel 1 voor samenstelling) met een 3 ml spuit en een 0,2 urn spuitfilter en voeg het filtraat direct aan de buis met de hersencoupes.
    8. Mechanisch dissociëren de cellen door zachtjes wrijven 10-20 maal, totdat zichtbare weefselstukken verdwijnen. Gebruik een katoenen aangesloten, brand gepolijst Pasteur pipet en voorkomen dat bellen tijdens het aanwrijven.
    9. Wacht 3 min voor kleine stukken om te settelen.
    10. Breng de meerderheid van de oplossing (~ 1.5 ml, waardoor enkele oplossing onderaan) aan een 15 ml centrifugebuis dat 3 ml Hanks 'oplossing + 20% FBS oplossing (4 ° C) bevat, met het katoen aangesloten, brand- gepolijste Pasteur pipet. Laat de oplossing niet overdragen omdat de opname van bezinksel op de bodem resulteert typisch in verslechtering van de cultuur.
    11. Centrifugeer gedurende 13 minuten bij ~ 185 g (~ 1100 rpm) bij 4 ° C.
    12. Zuig het supernatant voorzichtigVoeg 1 ml voorverwarmde plaatmedium (37 ° C) om de pellet en resuspendeer door enige malen waarbij katoen aangesloten, vuur gepolijste Pasteur pipet voorzichtig pipetteren.
      OPMERKING: Drie verschillende types van uitplaatmedia worden gebruikt voor verschillende doeleinden cultuur: plaatmedium-1 van muizen gliacellen, plaatmedium-2 voor muis neuronen en plaatmedium-3 voor ratten neuronen en gliacellen (zie tabel 1 voor samenstellingen) .
    13. Neem 10 pi van de celsuspensie, mengen met 10 gl 0,4% trypan blauwe oplossing en meet de dichtheid van levende cellen, met behulp van een hemocytometer of geautomatiseerde celteller.
  2. Muis glialculturen
    1. Was de dekglaasjes te helpen bij het vaststellen gezonde culturen van de muis cellen.
      1. Dompel dekglaasjes (rond, 12 mm diameter) in 70% salpeterzuur in een glazen petrischaal. Beschermen tegen licht met behulp van aluminiumfolie en plaats deze op een schudapparaat O / N.
      2. Spoel het glas coverslips in de petrischaal minstens driemaal met gedestilleerd water. Dompel ze in gedestilleerd water. Zet de schaal op een schudapparaat O / N.
      3. Droog de dekglaasjes op een Whatman 150 mm filter papier in de biologische veiligheid kabinet.
      4. Autoclaaf de dekglaasjes.
      5. Plaats de dekglaasjes in 24-well cultuur schotel.
    2. Label en genotype pasgeboren muizen volgens de stappen 1 en 2.
    3. Haal de hersencellen van de muizen pups, volgens stap 3.1.
      LET OP: Het gebruik van de cerebrale cortex is typerend voor de voorbereiding van de muis gliale feeder-laag. Echter, andere hersengebieden, zoals hippocampus en striatum zal werken en na correctie van celdichtheid door verschillende aantallen en opbrengsten van cellen uit verschillende gebieden.
    4. Voeg ~ 4 ml voorverwarmde plaatmedium-1 aan de uiteindelijke celsuspensie (~ 1 ml). Voor voorverwarmen kweekmedia, plaats de oplossing in de incubator (5% CO2 -95% O2, 37 ° C) O / N teHierdoor kan de temperatuur en de pH te stabiliseren.
    5. Breng de celsuspensie om een ​​niet-gecoate T25 kolf, met behulp van de katoen aangesloten, brand gepolijst Pasteur pipet. Plaats de kolf in de incubator.
    6. 1 dag in vitro (DIV), spoel de gekweekte cellen in de T25 kolf tweemaal met plaatmedium-1 (4 ° C). Plaats de kolf terug in de incubator. Voer spoelen door opzuigen het medium in de hals is met een Pasteur pipet toevoegen ~ 5 ml vers medium en voorzichtig kantelen van de kolf meerdere keren in een wervelende beweging.
    7. Bij 6-9 DIV, (dat wil zeggen, een dag voor trypsinisatie en plating op dekglaasjes, in stappen 3.2.8-3.2.13), plaats 100 ul van het bekledingsmateriaal met extracellulaire matrix eiwitten (zie tabel van Materialen / Apparatuur voor opmerkingen over het deklaagmateriaal) op de dekglaasjes in een kweekschaal, en zet de kweekschaal in de incubator.
    8. 7-10 DIV, wanneer de cellen 20-40% samenvloeiing (ruimtelijk continue), trypsinize hen.
      1. Spoel de kolf eenmaal door afzuigen alle vloeistof in de kolf en het toevoegen van ~ 13 ml Hanks 'oplossing (4 ° C), voorzichtig kantelen de kolf meerdere keren in een wervelende beweging en volledig zuig de oplossing.
      2. Voeg 40 ul DNase oplossing (eindconcentratie 750 eenheden / ml) aan 4 ml trypsine-EDTA-oplossing, laat de oplossing door een 0,2 urn spuitfilter en voeg het filtraat direct op de cellen in de kolf.
      3. Laat de trypsine verlopen gedurende 13 min bij 37 ° C in de incubator.
      4. Neutraliseer de trypsine-oplossing door toevoeging van 2 ml van 100% FBS (4 ° C) aan de kolf.
      5. Breng de cellen getrypsiniseerd een 15 ml centrifugebuis met een 5- tot 10 ml pipet ~ 4 ml Hanks 'oplossing + 20% FBS (4 ° C), centrifugeer bij ~ 185 g en 4 ° C gedurende 13 min en zuig het supernatant.
    9. Resuspendeer de pellet in 1 ml vooraf Warmed plaatmedium-1.
    10. Meet de dichtheid van de cellen volgens stap 3.1.13.
    11. Zuig het bekledingsmateriaal volledig uit de dekglaasjes en plaat ~ 50 ul van de geresuspendeerde gliale cellen op dekglaasjes.
      OPMERKING: Deze cellen zullen de gliale feeder-laag vast te stellen.
    12. Plaats de cultuur schotel met dekglaasjes in de couveuse.
    13. 20-60 min later, voeg 1 ml voorverwarmde plaatmedium-1 aan elk putje, en zet de schaal terug in de incubator. Opmerking: Als het plateren medium wordt toegevoegd, zal het nuttig zijn om een ​​pipet om druk de omtrek van het dekglaasje (waar geen geplateerd cellen), zodat het dekglaasje niet drijven in het medium.
    14. Op 1 DIV van de gliale feeder layer (dat is op de glazen dekglaasje), het medium vervangen door 1 ml voorverwarmde plaatmedium-1, door opzuigen alle oplossing in een goed en vervolgens vullen met vers medium.
    15. 2-3 DIV van de gliale feeder-laag als de CELls zijn 80-100% confluent, voeg Antimitoticum (10 pl van een mengsel van 5-fluor-2'-deoxyuridine + uridine; eindconcentraties van 81,2 en 204,8 uM, respectievelijk) aan elk putje, DNA replicatie en derhalve remmen onderdrukken gliale-celproliferatie.
    16. Bij 7-9 DIV, wanneer de cellen 90-100% confluent (1-2 uur voor uitplaten neuronen op de gliale feeder layer), vervang het kweekmedium met voorverwarmd plaatmedium-2 (37 ° C).
      OPMERKING: Neuronen worden verzilverd op dezelfde dag, met behulp van stap 3.4.
  3. Rat glialculturen
    1. Coat een T25 kolf met dezelfde coating materiaal.
      Opmerking: Dit is nodig voor latere verwijdering van niet-hechtende cellen in stap 3.3.5.
      1. Voeg 2,0 ml van het bekledingsmateriaal aan de kolf en plaats de kolf in de incubator.
      2. Na 2-3 uur, zuig het bekledingsmateriaal volledig, zodat de bodem van de kolf droog.
    2. Het verkrijgen van de cellenvan het jonge ratten, volgens stap 3.1.
      OPMERKING: De CA3-CA1 regio van de hippocampus wordt gebruikt voor het bereiden van de rat gliale feeder-laag. Echter, andere hersengebieden, zoals de cerebrale cortex en striatum, werkt na correctie voor verschillen in celdichtheid door verschillende aantallen en opbrengsten van cellen uit verschillende gebieden.
    3. Voeg ~ 4 ml voorverwarmde plaatmedium-3 aan de uiteindelijke celsuspensie (~ 1 ml).
    4. Breng de celsuspensie in de gecoate T25 kolf, met behulp van de katoen aangesloten, brand gepolijst Pasteur pipet. Plaats de kolf in de incubator (5% CO 2 -95% O 2, 37 ° C).
    5. 2-3 DIV, wanneer cellen 20-40% confluent, verwijder niet-klevende of zwak hechtende cellen, door het sluiten van het deksel stevig schudden van de kolf krachtig ~ 10 keer, opzuigen van de oplossing en toevoeging van 4-5 ml plating middellange-3 (bij 4 ° C). Herhaal eenmaal deze procedure. Onderzoek de gekweekte cellen in de hele fles vloer (bvmet fasecontrastmicroscoop) bevestigen dat die neuronale (dwz waarvoor de buitenrand van het cellichaam weergegeven fase-heldere weergegeven) geheel verwijderd. Herhaal de procedure zo vaak als nodig is om deze cellen te verwijderen, en dan terug de kolf naar de incubator.
      OPMERKING: De kracht en het totale aantal "shakes" noodzakelijk kunnen verschillen tussen individuele onderzoekers. Het belangrijkste is niet om het totaal aantal shakes te houden aan een bepaald aantal, maar om te bevestigen dat neuron-achtige cellen worden geëlimineerd.
    6. 6-8 DIV, wanneer cellen 90-100% confluent, passage de gliacellen door hen trypsinizing als in stap 3.2.8.
    7. Na centrifugatie, resuspendeer de pellet in 1 ml plaatmedium-3 (4 ° C), voeg 10 ml plaatmedium-3 (4 ° C) en breng de cellen getrypsiniseerd een ongecoate T75 kolf en kweken ervan in de incubator.
      OPMERKING: Rat gliacellen zal twee keer worden gepasseerd; daarentegen de muis gliacellen are gepasseerd eenmaal omdat ze ongezond na meerdere passages. Rat gliale cellen worden doorgekweekt in T75 kolven die niet zijn bekleed met een bekledingsmateriaal. De coating geeft rat gliacellen te snel groeien en leveren vele haarcellen (vermeende ependymale cellen), waarbij de neuronale kweekomstandigheid later zal verslechteren.
    8. Op 17-19 DIV van gliale cultuur in een kolf (dwz 11 dagen na de passage en een dag voor trypsinisatie en plating op dekglaasjes door stappen 3.3.9-3.3.14), plaats 100 ul van het bekledingsmateriaal op ongewassen dekglaasjes ( rond, diameter 12 mm) in een kweekschaal, en zet de kweekschaal in de incubator.
      LET OP: Voor rat glialculturen, werd geen verschil opgemerkt in de kweekresultaten met of zonder het wassen van de dekglaasjes.
    9. Bij 18-20 DIV gliale cultuur in een kolf (dwz 12 dagen na passage), bereid de gliale feeder-laag door trypsinizing de gekweekte cellen, volgens step 3.2.8.
    10. Tijdens centrifugeren volledig zuig het bekledingsmateriaal van de dekglaasjes.
    11. Na centrifugatie, resuspendeer de pellet in 1 ml plaatmedium-3 (4 ° C), en meet de celdichtheid, volgens stap 3.1.13.
    12. Pas de gliale dichtheid 10 4 levende cellen / ml, en plaat 100 pl gliale celsuspensie op het beklede dekglaasjes.
      OPMERKING: Deze cellen zullen de gliale feeder-laag vast te stellen.
    13. Plaats de cultuur schotel met dekglaasjes in de incubator voor 20-60 min.
    14. Voeg 1 ml plaatmedium-3 (4 ° C) aan elk putje, en zet de schaal terug in de incubator.
    15. 3-4 DIV van de gliale feeder-laag, wanneer de cellen op het dekglaasje zijn 40-80% confluent, voeg 1 ml van de voorverwarmde kweekmedium (zie tabel 1 voor samenstelling) die cytosine β-D-arabinofuranoside bevat ( AraC, eindconcentratie van 4 uM) aan gliale-celproliferatie stoppen. Plaat neurons bij 7-9 DIV van de gliale feeder-laag wanneer de cellen 60-80% confluent met stap 3.4.
  4. Muis neuronale kweken
    1. Label en genotype pasgeboren muizen volgens de stappen 1 en 2.
    2. Gebruik de muis pups voor stap 3.1.
    3. Pas de densiteit levend celsuspensie ~ 2,0 x 10 5 cellen / ml met voorverwarmd plaatmedium-2 voor plateren op muis gliacellen, of middels plaatmedium-3 voor laag op ratten gliacellen.
    4. Plaat de cellen op de gliale feeder layer, door voorzichtig toevoegen van de celsuspensie aan het kweekmedium van elk putje. Opmerking: Het volume van de celsuspensie worden toegevoegd, wordt bepaald door het vereiste aantal cellen in een kweek ook. Zo plaat ~ 60 ul van celsuspensie tot 12.000 cellen te bereiken / goed.
    5. Merk op dat er geen oplossing veranderingen zijn nodig na de neuronen worden verzilverd. Wees voorzichtig verdampen van de oplossing uit de putjes voorkomen in de loop van de cultuur, door bevochtiging van de binnenkant of de incubator.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Als voorbeeld van de toepassing van dit protocol, worden representatieve resultaten getoond voor het labelen van muizen door tatoeëren, betrouwbare genotypering onder verschillende experimentele omstandigheden, en tot vaststelling van primaire neuronale culturen op gliale feeder lagen.

Tatoeëren

Pasgeboren pups werden bestempeld op de voetzolen met een tatoeage systeem ('Newborn' in figuur 1). De etiketten blijft zichtbaar na 3 weken (3 weken oud) en 32 weken oud ('32 weekse oud). De afzonderlijke muizen uniek kan worden geïdentificeerd door een combinatie van tatoeages op de vier poten (getallen 1-16) en de informatie over het dier kooi of complexere nummerplannen (niet getoond).

Genotypering

Een representatief voorbeeld van genotypering wordt weergegeven (figuur 2). De Tor1a gen van wild-type (Tor1a (Tor1a + / AE) en homozygote (Tor1a AE / AE) AE-Torsina knock-in muizen geamplificeerd uit het genomisch DNA geïsoleerd uit de staart klemmen van pasgeboren pups. Genotypering in dit specifieke voorbeeld is gebaseerd op de aanwezigheid van een 34-basenpaar loxP site in het mutante allel Tor1a mits gunstige Cre recombinatie en verwijdering van een neomycineresistentiecassette 16,18.

Genomisch DNA werd geëxtraheerd met minimale hands-on tijd en veel monsters werden simultaan verwerkt. De extractie volumes constant gehouden, en dus geen aanpassing van het volume op de wijzigingen in geteste omstandigheden tegemoet. De betrouwbaarheid van genotypering werd getest onder vier voorwaarden, zoals hieronder beschreven.

Ten eerste, het gevolg van verschillen in de hoeveelheid uitgangsmateriaal weefsel werd bestudeerd (Figuur 3). Staarten van verschillende lengtes warenbereid uit de heterozygote AE-Torsina knock-in muizen (Tor1a + / AE) bij spenen leeftijd (~ 3 weken). Staart een lengte van 2 tot 5 mm, is het bereik meestal aanbevolen in genotypering protocollen, gaf hetzelfde genotypering resultaat van hoge kwaliteit. De twee banden komen overeen met de wild-type en gemuteerde allelen (Tor1a + en Tor1a AE, respectievelijk).

Ten tweede, de effecten van variatie in dierlijke oud werden onderzocht (Figuur 4). Staarten werden verkregen van pasgeboren, 3 weken oud en ~ 24 weken oude heterozygote AE-Torsina knock-in muizen (Tor1a + / AE). Homozygoten werden niet gebruikt omdat ze sterven enkele dagen na de geboorte 16-18. De twee verwachte bands voor wild-type en gemuteerde Tor1a genen waren zichtbaar ongeacht dier leeftijd (figuur 4A). De algemene toepasbaarheid van dit resultaat werd getest met behulp van een tweede gen, Tfap2a 19 in wild-type muizen (Tfap2a + / +) (Figuur 4B).

Ten derde, de gevolgen van verschillen in lengte van de PCR amplicons werden getest (Figuur 5). Hiervoor werden verschillende primer paren gesynthetiseerd voor een bepaald gen, zodat het geamplificeerde DNA's van verschillende basenparen lengte. De Tfap2a gen werd consistent waargenomen met verschillende lengtes amplicon.

Ten vierde, werden twee DNA-extractie werkwijzen vergeleken (figuur 6). In één werkwijze werden PCR strip buizen en PCR thermische cycler gebruikt (beschreven in stap 2). Dit is een automatisch, parallel meerdere buisjes extractiemethode ("Auto" in figuur 6). Omdat meerdere buizen gelijktijdig worden behandeld strookformaat en een PCR machine wordt gebruikt met een programma om in vier stappen temperatuur, is er geen noodzaak om de buizen dragen handmatig de temperatuur verandert tijdens de extractie of gebruik meerdere stukkenvan apparatuur. Zo is het gemakkelijk om vele monsters te verwerken. Dit werd vergeleken met de tweede methode gebaseerd op handmatige, een buis extractie ("Manual" in figuur 6). Deze maakt gebruik van individuele PCR-buisjes en een aparte niet-PCR-machines (warmte blokken en waterbaden) om de temperatuur te regelen tijdens de DNA-extractie. In dit geval werden meerdere, van buisjes naar een nieuwe temperatuur na elke stap, waarbij meerdere temperatuur controlerende inrichtingen. In beide gevallen werd de Tor1a gen geanalyseerd wild-type, heterozygote en homozygote AE-Torsina knock-in muizen (figuur 6A), en de Tfap2a gen werd geanalyseerd in wild-type muizen (Figuur 6B). De twee extractieprotocollen leverden gelijkwaardige genotypering resultaten.

Samenvattend, de gegevens in figuren 3-6 resultaten tonen dat de genotyperingsmethode robuust, bereiken betrouwbare en reproduceerbare resultaten ondanks variations in weefsel bedrag dier leeftijd, lengte amplicon en de extractie gebruikte protocol.

Neuronale kweken

Voor het kweken van muis neuronen op de muis gliale feeder-laag, de volgorde van de procedures is: (tatoeëren pasgeboren muizen → genotypering voor gliale cultuur →) gliale cultuur → tatoeëren pasgeboren muizen → genotypering voor neuronale cultuur → neuronale cultuur. Gevestigd op het rat gliale feeder laag culturen, de procedures tussen haakjes worden overgeslagen.

We onderzochten de ondersteunende werking van de vooraf geplaatste gliale feeder-laag op neuronale overleving en groei. Neuronen werden verkregen uit de CA3-CA1 regio van de hippocampus, de motor gebied van de cerebrale cortex en het striatum van de pasgeboren wild-type muizen. Ze werden met lage dichtheid van ratten gliale feeder-laag die was verkregen uit de CA3-CA1-gebied van de hippocampus en geënt vóór neuronale plateren volgenshet schema weergegeven in figuur 7 (vereenvoudigde samenvatting van de procedures). Lage dichtheid culturen zijn optimaal voor de beeldvorming van individuele dendrieten, somata 4,6, zenuwuiteinden 2,3,5,8 en axonale assen 5 bij hoge ruimtelijke resolutie. De hippocampale cellen (die zowel neuronen en gliale cellen) werden uitgeplaat op gecoat glas dekglaasjes, hetzij (figuur 8A) of zonder een vooraf vastgestelde gliale feeder layer (Figuur 8B, C) ​​en waargenomen met fasecontrast optiek. In aanwezigheid van een bijna confluente gliale feeder-laag, de neuronen (in elk paneel een pijlpunt wijst één vertegenwoordiger neuron) werden betrekkelijk gedispergeerd 3 en 7 dagen na uitplaten (dagen in vitro, DIV) (figuur 8A). Zij toonden ook tekenen van een goede gezondheid, zoals een duidelijke marge van neuronale somata, verlengd dendrieten, een gebrek aan geclusterde somata, en een gebrek aan gebundelde neurites (sterk vergrotende IMAGes in inlegwerk). Op 14 DIV, deze neuronen vormden een dicht netwerk gekenmerkt door lange neurieten (dendrieten en axonen). Merk op dat gliale proliferatie geremd voor neuronen geplateerd, door toevoeging van groeimedium dat de Antimitoticum AraC (stap 3.3.15).

Daarentegen, in afwezigheid van de gliale feeder-laag op het uitplaten hippocampale neuronen, de groei van de gekweekte hippocampale neuronen werd verminderd, zelfs in afwezigheid van AraC. Op 3 DIV, hebben gliacellen (inbegrepen in de nieuw vergulde hippocampus cellen) niet gevormd een confluente vel (asterisk in bovenste paneel van Figuur 8B). De kweken liet verscheidene tekens die niet geschikt voor hoge-resolutie imaging studies, zoals grote gebieden zonder onderliggende gliacellen (asterisk) zijn, de aanwezigheid van geclusterde somata en de aanwezigheid van gebundelde neurieten in sommige gebieden (gegevens niet getoond). Door 7 DIV, gevormd gliacellen een confluente vel (middelste paneel van Figuur 8C). However neuronen waren minder in aantal dan wanneer de neuronen werden uitgeplaat op een vooraf vastgestelde gliale feeder layer. De overlevende neuronen ontbrak ook lange, netwerkvorming neurites (inzet). De gliacellen waren meer heterogeen kromming en dikte dan die in de feeder laag cultuur, en lijkt daarmee fase-helder. Om het effect van onderdrukken gliale proliferatie neuronen te testen hebben we toegepast AraC-bevattend groeimedium. Toen AraC werd toegevoegd aan 3 of 7 DIV en de cellen werden gekweekt tot 14 DIV en waargenomen op de dag (figuur 8B en C, bodempanelen), gliale cellen omvatte nagenoeg dekglaasje oppervlak. De neuronen nog weinig talrijk, vooral wanneer AraC werd aangebracht met 7 DIV. De overlevende neuronen had slechts korte processen en werden niet uitgebreid aangesloten. Zo is de late toevoeging van AraC- toegestaan ​​een uniform gliale laag te vormen, maar leverde neuronale levensvatbaarheid of neurietverlenging niet bevorderen; in plaats van de ongecontroleerde gliale groeihad schadelijke effecten op neuronen.

Deze gegevens tonen dat de gliale feeder layer is essentieel voor de overleving en groei van neuronen uitgeplaat bij lage dichtheid, en dat de gliale laag aanwezig bij de neuronale plating dan later tijdens neuronale kweek moet worden. Soortgelijke resultaten werden verkregen met kweken van cerebrale cortex (figuur 9) en striatale neuronen (figuur 10).

De kwalitatieve vaststelling van neuronale overleving werd bevestigd door kwantitatieve analyse. Specifiek, het aantal overlevende neuronen in 14 DIV geteld, gebaseerd op fase-contrast beelden van het kweken (figuur 11). Het nummer was het grootst voor neuronen gekweekt op een gliale feeder-laag (bijv., Geplateerd op de gliale feeder layer). Het getal was lager bij neuronen gekweekt bij afwezigheid van een gliale feeder-laag. Het nummer werd verder verlaagd wanneer de cellen werden behandeld met AraC bij eenlater tijdstip. Deze verschillen waren statistisch significant en werden opgemerkt in culturen van neuronen verkregen uit de drie hersengebieden.

De typen overlevende cellen werden geïdentificeerd 14 DIV bij de muis hippocampale kweken uitgeplaat op de rat hippocampale voedsterlaag. Double-immunocytochemie werd uitgevoerd met antilichamen tegen neuronale marker, microtubule geassocieerd proteïne 2 (MAP2), en de astrocytaire gliale cel marker, gliale fibrillaire zuur eiwit (GFAP). De cellen met verlengde werkwijzen waren positief voor MAP2, terwijl de cellen in de onderliggende gliale feeder layer positief voor GFAP (twee representatieve beeldvelden figuur 12A). Deze kleuring was niet een artefact van een specifieke combinatie van primaire en secundaire antilichamen, omdat hetzelfde patroon werd verkregen wanneer een andere set van secundaire antilichamen werd gebruikt (figuur 12B).

Wanneer daarentegen dezelfde kleuring performed de culturen uit slechts een gliale feeder-laag, dat wil zeggen in afwezigheid van toegevoegde muizencellen (twee representatieve beeldvelden figuur 13A), geen cellen waren positief voor MAP2. De cellen van de feeder-laag was altijd positief voor GFAP. Voor een negatieve controle werden zowel primaire antilichamen weggelaten uit de immunocytochemische werkwijze (Figuur 13B). Geen kleuring werd gedetecteerd in deze monsters, hoewel cellen aanwezig waren, zoals blijkt uit het doorgelaten licht optica (differentieel interferentie contrast, DIC) en nucleaire kleuring met Hoechst kleurstof. Aldus, niet-specifieke kleuring in de MAP2 en GFAP kanalen was zeer zwak.

Deze immuuncytochemische gegevens werden ook kwantitatief geanalyseerd (figuur 14). In elk beeld 8-bit, werd de intensiteit gemeten en uitgezet langs een lijn. Overlay percelen onthullen MAP2 vlekken wanneer de muis cellen (monsters die neuronen) werden gekweekt op een gliale feeder laag (Neuron +,glia +, primair antilichaam (1 ° Ab) +), dat een dergelijke kleuring afwezig was in kweken van gliale feeder cellen alleen (Neuron -, glia +, 1 ° Ab +). In een negatieve controle zonder primaire antilichamen, kleuring was te verwaarlozen in culturen van gliale feeder cellen alleen (Neuron -, glia +, 1 ° Ab -). GFAP kleuring was duidelijk in het gliale feeder-laag, ongeacht of muizen cellen werden uitgeplaat (Neuron +, glia +, 1 ° Ab +) of niet (Neuron -, glia +, 1 ° Ab +). Nogmaals, kleuring in de negatieve controle was verwaarloosbaar (Neuron -, glia +, 1 ° Ab -). Deze resultaten tonen dat de rat gliale feeder-laag bestond voornamelijk uit astrocyten, en dat de neuronen aanwezig waren wanneer muizencellen werden toegevoegd. Ze geven ook aan dat deze in deze kweken neuronen afkomstig uitsluitend uit muis.

De resultaten sectie van de online video toont ook het DIC en MAP2 beelden van gekweekte neuronen uitgeplaat op een gliale feeder-laag, both bereid uit de CA3-CA1 hippocampus regio van wildtype muizen.

Voor gedetailleerde controle celkweek, wordt aanbevolen om de dichtheid van levende cellen te meten, zowel voor de beoordeling van de algemene kwaliteit van de hersenen dissectie en cellulaire dissociatie stappen, en uitplaten van de cellen bij de vooraf bepaalde dichtheid. Hieronder zijn vier sets van de typische metingen dichtheid. Merk echter op dat deze aantallen kunnen variëren afhankelijk van de omstandigheden en reagentia cultuur. Zo kan zelfs verschillende partijen van serum van dezelfde leverancier invloed op de resultaten. Daarom moeten deze getallen worden beschouwd als een algemene indicator, in plaats van een absolute leidraad.

Voor cellulaire dissociatie (stap 3.1.13), typische waarden voor de live-celdichtheid verkregen van één pup zijn: ~ 2 x 10 5 cellen / ml (muis motorische cortex en muis CA3-CA1 hippocampus), ~ 5 x 10 5 cellen / ml (muis cerebrale cortex en de rat CA3-CA1 hippocampus), en ~ 1 x 10 6 cells / ml (muis striatum). In al deze gevallen, de fracties van levende cellen> 90% (levensvatbaarheid, gedefinieerd als de verhouding van het aantal levende cellen en het totale aantal cellen). De motor cortex wordt losjes gedefinieerd als het gebied van de cerebrale cortex die onmiddellijk dorsaal ligt het striatum 20. Voor hippocampale culturen, de CA3 en CA1 regio van de hippocampus juiste voorkeur. Het gehele hippocampus bevat bovendien de dentate gyrus, de opneming van die leidt tot vorming van grote zenuwuiteinden van granule cellen en introduceert heterogeniteit in synaptische eigenschappen 21. Het striatum cultuur omvat de caudatus-putamen en de globus pallidus, maar omvat niet de nucleus accumbens, of mediale of laterale septum kernen in de nabijgelegen structuren.

Voor muis gliale cultuur (stap 3.2.11), de beplating dichtheid ~ 10.000 gliale cellen op elke 12-mm rond dekglaasje, met ~ 50 pi celsuspensie bij een dichtheid van 2 x ~10 5 cellen / ml. Gewoonlijk de dichtheid gemeten in het supernatant relatief constant en vereist aanpassing vereisen. Om de dichtheid te zetten op verschillende gebieden, de nuttige informatie die het dekglaasje heeft een diameter van 1,20 cm en een oppervlakte van 1,13 cm2. Zo ~ 10.000 cellen / dekglaasje = ~ 8800 cellen / cm2 op een dekglaasje.

Bij ratten gliale cultuur (stap 3.3.12), de beplating dichtheid ~ 1000 gliale cellen op elke 12-mm rond dekglaasje, met ~ 100 ul celsuspensie bij een dichtheid van ~ 1x10 4 cellen / ml. Derhalve 1000 cellen / dekglaasje = ~ 900 cellen / cm2 op een dekglaasje.

Voor een lage dichtheid muis neuronale cultuur (stap 3.4.4), de beplating dichtheid varieert tussen de 2.000 en 48.000 cellen per putje van een 24-well plaat. Typische waarden wanneer plating neuronen op rat gliacellen zijn: 10,000-24,000 cellen / putje voor cerebrale corticale neuronen, 12,000-24,000 cellen / putje voor CA3-CA1 hippocampus neuronen en 24,000-48,000 cellen / putje voor striatum neuronen. Bij uitplaten op muizen gliacellen, wordt het aantal verminderd, bijvoorbeeld 2000 cellen / putje voor CA3-CA1 hippocampale neuronen. Als een kanttekening, voor plating rat CA3-CA1 hippocampusneuronen op een rat gliale feeder-laag, de beplating dichtheid is 1,000-6,000 cellen / putje. Voor het omzetten van de dichtheid in een put op de dichtheid op een dekglaasje, de nuttige informatie die de inwendige diameter en onderaan 1,56 cm en het gebied 1.91 cm2. Zo 12.000 cellen / putje = 7.100 cellen / dekglaasje = 6.300 cellen / cm2 op een dekglaasje. Deze dichtheden werden gekozen teneinde kweken relatief dun neuronen voor hoge resolutie cellulaire beeldvorming. Onderzoekers moeten hun aantallen die het beste past bij hun experimentele doeleinden kiezen.

Figuur 1
Figuur 1. Tattooed voetzolen van muizen. Newborn muizen werden gelabeld door het tatoeëren van de voetzolen. Ze werden onmiddellijk gefotografeerd na tatoeage (pasgeboren), 3 weken (3 weken oud) en 32 weken (32 weken oud). De labels bleef goed zichtbaar op volwassen leeftijd. Beelden werden genomen van verschillende dieren. Ze zijn niet op dezelfde schaal getoond. Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.

Figuur 2
Figuur 2. Genotypering van wildtype (Tor1a + / +), heterozygote (Tor1a + / AE) en homozygote (Tor1a AE / AE) AE-Torsina knock-in muizen. De Tor1a gen allelen werden wild-type en mutant geanalyseerd vormen, met behulp van DNA geëxtraheerd uit de staarten van de pasgeboren jongen. Tail tips waren ~ 4 mm. DNA werd gekleurd met behulp van SYBR Safe Gel van DNA Stain. Zie de tabel van Materialen / Apparatuur voor de informatie over de primers en thermische fietsen programma voor Tor1a gen. Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.

Figuur 3
Figuur 3. Detectie van genomisch DNA in de context van variatie in de hoeveelheid uitgangsmateriaal. Tail uiteinden van verschillende lengten gebruikt. Geteste dieren 3 weken oud waren, heterozygote AE-Torsina knock-in muizen (Tor1a + / AE). Lanen vertegenwoordigen de staart lengte van 2, 3, 4 en 5 mm, in tweevoud (van links). De staart tips zijn afkomstig van verschillende muizen. Moleculair-gewicht grootte markers in de meest linkse rijstrook vertegenwoordigen DNA lengtes in sTEP's van 100 basenparen. Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.

Figuur 4
Figuur 4. Detectie van genomisch DNA in de context van variatie in dierlijke leeftijd. (A) Tor1a gen. Rijstroken vertegenwoordigen staart tips verkregen uit heterozygote AE-Torsina knock-in muizen (Tor1a + / AE) bij de volgende stappen: pasgeboren, 3 weken oud, en ~ 24 weken oude (in duplo van links) (B). Tfap2a gen. Rijstroken vertegenwoordigen staart tips verkregen van wild-type (Tfap2a + / +) muizen bij de volgende stappen: pasgeboren, 3 weken oud, en ~ 24 weken oude (in duplo van links). Beide genen werden geamplificeerd uit staarten ~ 4 mm. De verwachte PCR-fragment 498 bp. Het PCR-programma wa s het zelfde als die gebruikt voor Tor1a gen. Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.

Figuur 5
Figuur 5. Detectie van genomisch DNA in de context van variatie in lengte van de PCR amplicon. De Tfap2a gen werd geanalyseerd met PCR amplicon lengte van 498 bp (linker lanen), 983 bp (middelste lanen) en 1990 bp (rechter lanen) in duplicaten. Het gen werd geamplificeerd van staarten van 3-weken oude muizen. Moleculair-gewicht grootte markers in de meest linkse en meest rechtse rijstrook van de gel te vertegenwoordigen DNA lengtes in stappen van 100 en 200 basenparen, respectievelijk. Zie de tabel van Materialen / Apparatuur voor informatie over de primers voor verschillende amplicons. 879fig5highres.jpg "target =" _ blank "> Klik hier om een ​​grotere versie van deze afbeelding te bekijken.

Figuur 6
Figuur 6. Detectie van genomisch DNA in de context van variatie in DNA extractiemethode. Resultaten voor de handmatige, een buis extractie (handmatig) en de geautomatiseerde, parallel meerdere buisjes extractiemethoden (automatisch) worden vergeleken. De laatste methode werd gebruikt in dit rapport. Genen werden geamplificeerd uit staarten ~ 4 mm lengte, vanuit pasgeborenen. (A) Tor1a gen bij pasgeborenen pups van AE-Torsina knock-in muizen. Lanen vertegenwoordigen DNA's geëxtraheerd uit wildtype (handmatig en automatisch), heterozygote (handmatig en automatisch) en homozygote muizen (handmatig en automatisch) (van links). (B) Tfap2a gen in 3 weken oude wild-type muizen. De verwachte PCR-fragment 498 bp.jove.com/files/ftp_upload/51879/51879fig6highres.jpg "target =" _ blank "> Klik hier om een ​​grotere versie van deze afbeelding te bekijken.

Figuur 7
Figuur 7. Vereenvoudigde schematische illustratie van de procedures voor plating muis neuronen van muis (A) en rat (B) gliale feeder lagen. Het aantal dagen (dagen in vitro) vermelden cumulatieve dagen na de gliale cellen eerst worden uitgeplaat in kweek kolven. Ze dienen enkel als een ruwe schatting. Voor praktische informatie, zie de Procedures sectie. Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.

Figuur 8
Figuur 8. Ondersteunende effectgliale feeder-laag groei van hippocampale neuronen in een lage dichtheid kweek. Neuronen werden verkregen van de CA3-CA1-gebied van de hippocampus van pasgeboren, wild-type muizen. (A) Muis hippocampale cellen werden op gecoate dekglaasjes die voorgeverfd waren geënt met een rat gliale feeder-laag, verkregen uit de CA3-CA1-gebied van de hippocampus. Neuronen werden verspreid gelijkmatig op een gezonde manier. Kweken werden waargenomen op 3, 7 en 14 DIV. (B, C) ​​Mouse hippocampale cellen werden op gecoate dekglaasjes, die geen vooraf vastgestelde feeder-laag had. Culturen werden waargenomen bij 3 DIV (bovenste paneel in B) en 7 DIV (middelste paneel in C) zonder AraC- behandeling. In andere reeksen kweken werden de cellen behandeld met AraC 3 DIV (onderste paneel in B) en 7 DIV (onderste paneel C), en waargenomen 14 DIV. Alle afbeeldingen vertegenwoordigen de zuster kweken verkregen uit dezelfde pup waarvan neuronen werden uitgeplaat op dezelfde dag. Zie tekst voor details. Voor elk paneel, een exruim van een neuron wordt aangegeven door een witte pijlpunt en vergroot een inzet. Neuronen cel lichamen waarvan de omtrek verschijnt helder wanneer bekeken door fase-contrast optiek, en ze hebben ook dikke processen. Sterretjes geven gebieden zonder gliacellen. De culturen werden live in beeld gebracht op een omgekeerde microscoop met fase-contrast optiek met 20X objectief (numerieke opening van 0,45), zonder een tussenliggende lens (dat wil zeggen, bij 1x). Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.

Figuur 9
Figuur 9. Ondersteunende effect van gliale feeder-laag groei van cerebrale corticale neuronen in een lage dichtheid kweek. Soortgelijke resultaten als in figuur 8, maar met neuronen verkregen uit de motor regio Cerebral cortex. De voorwaarden waaronder labels AC komen overeen met die in figuur 8. Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.

Figuur 10
Figuur 10. Ondersteunende effect van gliale feeder-laag groei van striatale neuronen in een lage dichtheid kweek. Soortgelijke resultaten als in figuren 8 en 9, maar neuronen verkregen uit het striatum. De voorwaarden waaronder labels AC komen overeen met die in figuur 8. Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.

Figuur 11. Ondersteunende effect van gliale feeder-laag op neuronale overleving. Het aantal overlevende neuronen geteld in de in figuur 8 experimenten met beelden opgenomen door fasecontrast microscopie. Beelden voor 14 DIV zijn hier weer getoond, maar met pijlpunten wijzen op voorbeelden van geteld neuronen. Het staafdiagram toont het aantal neuronen per beeldveld (449,0 micrometer x 335,5 micrometer) (gemiddelde ± standaardfout van het gemiddelde, n = 7-24 velden voor elke cultuur conditie). Sterretjes geven significante verschillen 'gliale feeder layer (-), AraC op 3 DIV "en" gliale feeder layer (-), AraC op 7 DIV' van 'gliale feeder layer (+) (* p <0,05, ** p <0,01, ongepaarde Student's t-test). De getallen boven de staven geven de neuronale dichtheid gemeten in montages van meerdere afbeeldingen velden. Beelden warenverkregen met een 20X objectief. Acquisitie vertekening te voorkomen, werden alle beelden die samen een volledige verticale strook, van boven naar beneden van een dekglaasje en door het middelpunt van het dekglaasje benadering. Afzonderlijke beelden had enige overlapping (bijvoorbeeld 1/6 tot 1/4 van een beeldveld boven en onder). Twee werkwijzen werden gebruikt voor de analyse. In één werden neuronen geteld wisselende beelden zodat individuele neuronen niet meer dan een keer geteld. De verkregen getallen werden gebruikt om de staafgrafiek genereren. In de tweede methode werd een montage gemaakt van de afzonderlijke beelden. Ze werden genaaid met behulp van de Microsoft Image Composite Editor of handmatig met behulp van Photoshop. De montages uitgesloten ook meerdere tellingen van dezelfde neuronen. De resulterende cijfers zijn weergegeven boven de staven. In beide werkwijzen werden grote gebieden op het dekglaasje periferie die geen cellen bevatte uitgesloten. Cellen werden geteld als neuronen als ze cellichamen dat heldere verscheen haddoor fase-contrast microscopie, evenals uitgebreide cellulaire processen. Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.

Figuur 12
Figuur 12. Immunocytochemische identificatie van celtypen in neuronale culturen. De cultuur conditie overeenkomt met de bottom-linker afbeelding van figuur 8A. Neuronen werden verkregen uit de CA3-CA1-gebied van de hippocampus van wildtype muizen en uitgeplaat op een gliale feeder layer gegenereerd uit de CA3-CA1 regio hippocampus van wildtype ratten. De gekweekte cellen werden geanalyseerd door immuuncytochemie voor de neuronale marker MAP2, en de astrocytaire gliale cel marker GFAP. Differentieel interferentie contrast (DIC) microscopie werd gebruikt om de algemene morfologie van de afgebeelde gebieden onthullen, 14-17dagen nadat de neuronen werden geplaat op de gliale feeder-laag. (A) Drie-kleuren kleuring, waaronder tegenkleuring met nucleaire marker Hoechst 33342 kleurstof. Twee representatief beeld velden worden getoond. (B) kleuring met twee kleuren, met verschillende combinaties van secundaire antilichamen geconjugeerd met verschillende fluoroforen. In deze experimenten werden de gekweekte cellen gefixeerd met 4% paraformaldehyde en 4% sucrose in Tyrode's oplossing (bevattende, in mM: 125 NaCl, 2 KCl, 2 CaCl2, 2 MgCl2, 30 D-glucose, 25 HEPES, pH 7,4 ingesteld met 5 M NaOH, ~ 310 mOsm zonder aanpassing) gedurende 30 min bij 4 ° C. Na wassen met Tyrode's oplossing, werden ze permeabel gemaakt met 0,1% Triton X-100 in Tyrode's oplossing gedurende 10 min. Ze werden opnieuw gewassen met Tyrode's oplossing en vervolgens geblokkeerd met 2% normaal geit serum in fosfaat gebufferde zoutoplossing (PBS) (blokkerende oplossing) gedurende 60 min bij kamertemperatuur. Daarna werden ze behandeld met het konijn polyklonale anti-MAP2 antilichaam (AB5622, 400x verdunning in blokkeringsoplossing) en muizen monoklonaal anti-GFAP cocktail (NE1015; 1000x verdunning) O / N (15-21 uur) bij 4 ° C. Na wassen met PBS werden de cellen geïncubeerd met geit anti-konijn en anti-muizen IgG antilichaam geconjugeerd met Alexa Fluor 405 (500x verdunning in blokkeringsoplossing), Alexa Fluor 488 (1000x) of Alexa Fluor 568 kleurstof (500x) 60 min bij kamertemperatuur. Ze werden gewassen met PBS en direct waargenomen in PBS. In sommige culturen, na de laatste wasbeurt in de bovenstaande procedures, de cellen werden behandeld met Hoechst 33342 bij 0,5 ug / ml in PBS gedurende 10 min bij kamertemperatuur, en gewassen met PBS voor observatie. Klik hier om een grotere versie van deze foto figuur.

Figuur 13
Afbeelding 13. Immunocytochemical identificatie celtypen gliale feeder-laag kweken. zuster culturen van de rat gliale feeder lagen zoals in figuur 12, maar zonder de beplating van muis neuronen. (A) met de immunocytochemische kleuring procedures in figuur 12A beschreven. Twee representatieve beeldvelden getoond. (B) Kleuring van de gliale feeder-laag met de immunocytochemische procedures beschreven in A, maar met de primaire antilichamen weggelaten. Alle MAP2 beelden in de figuren 12A en 13A, B werden verworven onder dezelfde beeldvorming voorwaarden, en worden getoond op hetzelfde beeldcontrast aan vergelijking van de intensiteit mogelijk te maken. Dezelfde werkwijzen werden gebruikt voor GFAP afbeeldingen in figuren 12A en 13A, B. De gliale feeder-laag kweek werd afgebeeld op dezelfde dag als de kweken in figuur 12. Dus de gliale feeder lagen 13 werden gekweekt in vitro voor dezelfde hoeveelheid tijd. Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.

Figuur 14
Figuur 14. Intensiteit van immunocytochemisch kleuren. Lijnen werden getrokken op de in de figuren 12 en 13 afbeeldingen en de intensiteit langs deze werd uitgezet. Inzetstukken tonen beelden in de bovenste rij van figuur 12A. De drie voorwaarden waren: 1) beplating van muizencellen (neuronen) op een rat voedingslaag en kleuring met de primaire antilichamen (Neuron +, glia +, 1 ° Ab +), 2) gliale feeder layer (alleen niet neuronale plating) en kleuring met de primaire antilichamen (Neuron -, glia +, 1 ° Ab +), en 3) gliale diervoederser lagen alleen (geen neuronale plating) en vlekken zonder primaire antilichamen (Neuron -, glia +, 1 ° Ab -). Neuronale kleuring (MAP2) was alleen aanwezig wanneer muizencellen werden uitgeplaat (voorwaarden 1 vs. 2), en gliale kleuring (GFAP) aanwezig in beide culturen (voorwaarden 1 vs. 2) was. De immunocytochemische kleuring was specifiek voor zowel primaire antilichamen (voorwaarden 1 vs. 3). Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.

OPLOSSINGEN
TAE buffer (50x oplossing)
Tris-base, 486 g
Ijsazijn, 114,2 ml
0.5 M EDTA, pH 8,0, 200 ml
Voeg gedestilleerd water om het totale volume tot 2 L brengen
Make-up in een zuurkast.
Verdun 50-voudig voor gebruik.
Hanks 'oplossing
Hanks 'Balanced Salts, zonder calciumchloride, magnesiumsulfaat en natriumbicarbonaat (1 L)
NaHCO3, 350 mg (eindconcentratie 4.17 mM)
HEPES, 2,38 g (eindconcentratie 10 mM)
Op pH 7,4 met 5 M NaOH.
Pas osmolariteit tot 310 mOsm behulp van sucrose (Osmolariteit neiging om ~ 290 mOsm zonder enige aanpassing).
Voeg gedestilleerd water aan totale volume op 1 L te brengen
Digestion oplossing (voor trypsine behandeling van hersenweefsel)
NaCl, 800,6 mg (eindconcentratie, 137 mM)
KCl, 37.3 mg (final concentratie, 5 mM)
Na 2 HPO 4 · (7H 2 O), 187,6 mg (eindconcentratie, 7 mM)
HEPES, 595,8 mg (eindconcentratie 25 mM)
Glucose, 97.3 mg (eindconcentratie 5,4 mM)
Op pH 7,2 met 5 M NaOH.
Osmolariteit heeft de neiging om ~ 310 mOsm zonder enige aanpassing.
Voeg gedestilleerd water aan totale volume op 100 ml te brengen.
Vlak voor gebruik, voeg 20 mg trypsine (eindconcentratie van 10 mg / ml) en 20 gl DNase (eindconcentratie van 750 eenheden / ml) tot 2 ml digestieoplossing.
Dissociatie oplossing (voor mechanische dissociatie van hersenweefsel)
Hanks 'oplossing
MgSO4 · (7H 2 O), 295,1 mg (laatste concentration, 11.97 mM)
Pas osmolariteit tot 310 mOsm behulp van sucrose.
Totale volume is 100 ml.
Vlak voor gebruik, voeg 20 ul DNase (eindconcentratie van 750 eenheden / ml) tot 2 ml dissociatie oplossing.
Plaatmedium-1 (voor muizen gliacellen)
Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM), 449,5 ml
MITO + Serum Extender, 0,5 ml
FBS, 50 ml
Totale volume is 500 ml.
Plaatmedium-2 (voor muis neuronen)
Neurobasal-A, 485 ml
B27, 10 ml
GlutaMAX-I, 5 ml (eindconcentratie 2 mM)
Totale volume is 500 ml.
Plaatmedium-3 (voor de rat neuronen en gliacellen)
Minimum Essential Media (MEM zonder fenol rood)
Glucose, 2,5 g (eindconcentratie, 27,8 mM)
NaHCO3, 100 mg (eindconcentratie, 2,38 mM)
Transferrine, 50 mg
FBS, 50 ml
GlutaMAX-I, 5 ml (eindconcentratie 2 mM)
Insuline, 12,5 mg
Totale volume is 500 ml.
Groeimedium (voor rat neuronen en gliacellen)
MEM (zonder fenolrood)
Glucose, 2,5 g (eindconcentratie, 27,8 mM)
NaHCO3, 100 mg (eindconcentratie, 2,38 mM)
Transferrine, 50 mg
FBS,25 ml
GlutaMAX-I, 1,25 ml (eindconcentratie 0,5 mM)
B27 of NS21 {Chen, 2008 # 2399}, 10 ml
Cytosine β-D-arabinofuranoside (AraC), 0,56 mg (eindconcentratie 4 uM)
Totale volume is 500 ml.
Algemene opmerkingen
Onze cultuur media geen antibiotica bevatten, omdat ze cytotoxische effecten op gekweekte gliacellen en neuronen (referentie 70, 71) zou kunnen uitoefenen. Dit maakt het vooral belangrijk om zich te houden aan de procedures in cultuurgebonden werk steriel.
Zie de tabel van reagentia voor de gedetailleerde bronnen van chemicaliën.

Tabel 1. Oplossingen

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
REAGENTS - tattooing
Machine Cleanser Animal Identification and Marking Systems, Inc. NMCR3 This is used to clean the needles and the holder after tattooing.
Machine Drying Agent Animal Identification and Marking Systems, Inc. NDAR4 This is used to dry the needles and holder after cleaning.
Neonate Tattoo Black Pigment Animal Identification and Marking Systems, Inc. NBP01
Skin Prep Applicator Animal Identification and Marking Systems, Inc. NSPA1 Q-tip.
Skin Prep solution Animal Identification and Marking Systems, Inc. NSP01 This reagent delivers a thin layer of oil that enhances the efficiency of tattooing and prevents tattoo fading, by (information from vendor): 1) preventing non-tattooed skin from being stained temporarily, thereby allowing the quality of a paw pad tattoo to be easily evaluated before the pup is returned to its home cage – the stained skin surface can be confused with the tattooed skin, 2) reducing skin damage during tattooing – softening the skin and lubricating the needle will help the needle penetrate the skin without causing skin damage, and 3) preventing molecular oxygen from entering the skin, thereby reducing inflammatory responses to reactive oxygen species that can be generated.
REAGENTS - genotyping
EZ Fast Tissue/Tail PCR Genotyping Kit (Strip Tube Format) EZ BioResearch LLC G2001-100
2X PCR Ready Mix II EZ BioResearch LLC G2001-100 A red, loading dye for electrophoresis is included in the 2X PCR Ready Mix solution.
Tissue Lysis Solution A EZ BioResearch LLC G2001-100 Prepare DNA Extraction Solution by mixing 20 µl of Tissue Lysis Solution A and 180 µl of Tissue Lysis Solution B per specimen.
Tissue Lysis Solution B EZ BioResearch LLC G2001-100 Prepare DNA Extraction Solution by mixing 20 µl of Tissue Lysis Solution A and 180 µl of Tissue Lysis Solution B per specimen.
Acetic acid, glacial VWR BDH 3092
Agarose optimized grade, molecular biology grade rpi A20090-500  We use 2% agarose gels in TAE buffer containing the SYBR Safe DNA gel stain (diluted 10,000-fold) or ethidium bromide (0.5 µg/ml gel volume).
Ethidium bromide Sigma-Aldrich E7637-1G
Ethylenediamine tetraacetic acid, disodium salt dihydrate (EDTA) Fisher BP120-500
Filtered Pipet Tips, Aerosol-Free, 0.1-10 µl Dot Scientific Inc UG104-96RS  Use pipette tips that are sterile and free of DNA, RNase and DNase. For all steps involving DNA, use filtered pipette tips to avoid cross-contamination.
Filtered Pipet Tips, Premium Fit Filter Tips, 0.5-20 µl Dot Scientific Inc UG2020-RS Use pipette tips that are sterile and free of DNA, RNase and DNase. For all steps involving DNA, use filtered pipette tips to avoid cross-contamination.
Filtered Pipet Tips, Premium Fit Filter Tips, 1-200 µl Dot Scientific Inc UG2812-RS Use pipette tips that are sterile and free of DNA, RNase and DNase. For all steps involving DNA, use filtered pipette tips to avoid cross-contamination.
Molecular weight marker, EZ DNA Even Ladders 100 bp EZ BioResearch LLC L1001 We use either of these three molecular weight markers.
Molecular weight marker, EZ DNA Even Ladders 1000 bp EZ BioResearch LLC L1010
Molecular weight marker, TrackIt, 100 bp DNA Ladder GIBCO-Invitrogen 10488-058
PCR tubes, 8-tube strips with individually attached dome top caps, natural, 0.2 ml  USA Scientific 1402-2900 Use tubes that are sterile and free of DNA, RNase and DNase. An 8-tube strip is easy to handle and to group the specimens than individual tubes.
PCR tubes, Ultraflux Individual  rpi 145660 Use tubes that are sterile and free of DNA, RNase and DNase.
Seal-Rite 0.5 ml microcentrifuge tube, natural USA Scientific 1605-0000 Use tubes that are sterile and free of DNA, RNase and DNase.
SYBR Safe DNA gel stain * 10,000x concentration in DMSO GIBCO-Invitrogen S33102
Tris base rpi T60040-1000
Primers for amplifying Tor1a gene in ΔE-torsinA knock-in mice 5'-AGT CTG TGG CTG GCT CTC CC-3' (forward) and 5'-CCT CAG GCT GCT CAC AAC CAC-3' (reverse) (reference 18). These primers were used at a final concentration of 1.0 ng/µl (~0.16 µM) (reference 2).
Primers for amplifying Tfap2a gene in wild-type mice 5'-GAA AGG TGT AGG CAG AAG TTT GTC AGG GC-3' (forward), 5'-CGT GTG GCT GTT GGG GTT GTT GCT GAG GTA-3' (reverse) for the 498-bp amplicon, 5'-CAC CCT ATC AGG GGA GGA CAA CTT TCG-3' (forward), 5'-AGA CAC TCG GGC TTT GGA GAT CAT TC-3' (reverse) for the 983-bp amplicon, and 5'-CAC CCT ATC AGG GGA GGA CAA CTT TCG-3' (forward), 5'-ACA GTG TAG TAA GGC AAA GCA AGG AG-3' (reverse) for the 1990-bp amplicon. These primers are used at 0.5 µM.
REAGENTS - cell culture
5-Fluoro-2′-deoxyuridine Sigma-Aldrich F0503-100MG See comments section of uridine for more information.
B-27 supplement GIBCO-Invitrogen 17504-044
Cell Culture Dishes 35 x 10 mm Dishes, Tissue Culture-treated BD falcon 353001
Cell Culture Flasks, T25, Tissue Culture-treated, Canted-neck, plug-seal cap, 25 cm2 Growth Area, 70 ml BD falcon 353082
Cell Culture Flasks, T75, Tissue Culture-treated, Canted-neck, vented cap, 75 cm2 Growth Area, 250 ml BD falcon 353136
Conical Tube, polypropylene, 15 ml BD falcon 352095
Countess (cell number counter) chamber slides GIBCO-Invitrogen C10312
Cytosine β-D-Arabinofuranoside hydrochloride (Ara-C hydrochloride) Sigma-Aldrich C6645-100mg
D-(+)-Glucose (Dextrose) anhydrous, SigmaUltra, 99.5% (GC) Sigma-Aldrich G7528-250G
Dish, Petri glass 100 x 15 mm Pyrex 3160-101
Distilled water GIBCO-Invitrogen 15230-147
DNase Type II Sigma-Aldrich D4527-200KU Stock solution is prepared at 1,500 units/20 μl = 75,000 units/ml in distilled water.
Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM), high glucose, GlutaMAX, pyruvate GIBCO-Invitrogen 10569-010, 500 ml
Fast PES Filter Unit, 250 ml, 50 mm diameter membrane, 0.2 µm Pore Size Nalgene 568-0020
Fast PES Filter Unit, 500 ml, 90 mm diameter membrane, 0.2 µm Pore Size Nalgene 569-0020
Fetal bovine serum (FBS) GIBCO-Invitrogen 26140-079
Glass coverslip, 12 mm Round, thickness 0.09–0.12 mm, No. 0 Carolina 633017
GlutaMAX-I GIBCO-Invitrogen 35050-061
Hanks' Balanced Salts Sigma-Aldrich H2387-10X
HEPES, ≥99.5% (titration) Sigma-Aldrich H3375-250G
Hydrochloric acid, 37%, A.C.S reagent Sigma-Aldrich 258148-100 ML
Insulin Sigma-Aldrich I5500-250 mg
Magnesium sulfate heptahydrate, MgSO4•(7H2O), BioUltra, ≥99.5% (Fluka) Sigma-Aldrich 63138-250G
Matrigel Basement Membrane Matrix solution, Phenol Red-Free BD Biosciences 356237 This is the coating material for coverslips and flasks. 1) To prepare it, thaw the Matrigel Basement Membrane Matrix solution on ice, which usually takes ~1 day. Using a pre-cooled pipette, aliquot the thawed solution into pre-cooled T25 flasks on ice, and store the flasks at -20 °C. To prepare the working Matrigel solution, thaw the aliquotted Matrigel in a flask on ice, dilute 50-fold by adding pre-cooled MEM solution and keep the diluted solution at 4 °C. It is important to pre-cool all cultureware and media that come into contact with Matrigel, except during and after the coating of coverslips, to prevent it from prematurely forming a gel. 2) To coat the glass coverslips or culture flasks with Matrigel, apply the Matrigel solution to the surface. Before plating cells, it is important to completely dry up the surface. For this purpose, it might be helpful to aspirate Matrigel during the cellular centrifugation immediately before plating the cells and to allow enough time for drying.
Minimum Essential Medium (MEM) GIBCO-Invitrogen 51200-038
MITO+ Serum Extender, 5 ml BD Biosciences 355006
Multiwell Plates, Tissue Culture-treated 24-well plate BD falcon 353047
Multiwell Plates, Tissue Culture-treated 6-well plate BD falcon 353046
Neurobasal-A Medium (1X), liquid GIBCO-Invitrogen 10888-022
Nitric Acid VWR bdh 3044
NS (Neuronal Supplement) 21  prepared in the lab Source: reference 69
Pasteur pipets, 5 ¾”  Fisher 13-678-6A Use this cotton-plugged 5 ¾” Pasteur pipette for cellular trituration. Fire-polish the tip beforehand to smooth the cut surface and to reduce the internal diameter to 50-80% of the original. Too small a tip will disrupt the cells and reduce cell viability, but too large a tip will decrease the efficiency of trituration.
Pasteur pipets, 9”  Fisher 13-678-6B
Potassium chloride (KCl), SigmaUltra, ≥99.0% Sigma-Aldrich P9333-500G
Serological pipet, 2 ml BD falcon 357507
Serological pipet, 5 ml  BD falcon 357543
Serological pipet, 10 ml BD falcon 357551
Serological pipet, 25 ml BD falcon 357525
Serological pipet, 50 ml  BD falcon 357550
Sodium bicarbonate (NaHCO3, Sodium hydrogen carbonate), SigmaUltra, ≥99.5% Sigma-Aldrich S6297-250G
Sodium chloride (NaCl), SigmaUltra, ≥99.5% Sigma-Aldrich S7653-250G
Sodium hydroxide (NaOH), pellets, 99.998% trace metals basis Sigma-Aldrich 480878-250G
Sodium phosphate dibasic heptahydrate (Na2HPO4•(7H2O)), ≥99.99%, Aldrich Sigma-Aldrich 431478-250G
Sucrose, SigmaUltra, ≥99.5% (GC) Sigma-Aldrich S7903-250G
Syringe filter, sterile, 0.2 µm Corning 431219
Syringe, 3 ml BD falcon 309585
Transferrin, Holo, bovine plasma Calbiochem 616420
Trypan Blue stain, 0.4% GIBCO-Invitrogen T10282 This is used for counting live/dead cells. Renew an old trypan blue solution if it is re-used many times (e.g. several times a week for several weeks), because it will form precipitates and result in erroneous readouts of cellular density.
Trypsin, type XI Sigma-Aldrich T1005-5G
Trypsin-EDTA solution, 0.25%  GIBCO-Invitrogen 25200-056
Uridine Sigma-Aldrich U3003-5G Stock solution is prepared at 50-mg 5-fluoro-2'-deoxyuridine and 125 mg uridine in 25 ml DMEM (8.12 and 20.48 mM, respectively).
REAGENTS - immunocytochemistry
Antibody, rabbit polyclonal anti-MAP2 Merck Millipore AB5622
Antibody, mouse monoclonal anti-GFAP cocktail Merck Millipore NE1015
EQUIPMENT - tattooing
AIMS Animal Identification and Marking Systems, Inc. NEO–9 This Neonate Rodent Tattooing System is an electric system that works by rapidly moving 1- or 3-point tattoo needles vertically into the skin. Activate the tattoo machine once for approximately 0.5 sec, while the tattoo needle tips are kept perpendicular to the skin surface. We prefer three-needle tattooing to maximize the tattooed area, but one-needle tattooing is effective on narrower areas, e.g. the toes, or if fine mechanical control is necessary, e.g. when numbers are tattooed. Two rounds of tattooing at the slowest speed (setting "1" out of 3 steps) are typically sufficient to produce a visible and long-lasting tattoo of the paw pads.
EQUIPMENT - genotyping
Electrophoresis system, horizontal, Wide Mini–Sub Cell GT BIO–RAD 170–4405 Typical electrophoresis parameters are electrical field strength at 6 V/cm and 25 min duration for a 10 cm gel.
FluorChem 8800 ProteinSimple FluorChem 8800
PCR, MJ Mini Thermal Cycler BIO-RAD PTC-1148EDU Our PCR reactions for the Tor1a gene in ΔE-torsinA knock-in mice are as follows: 1 cycle of denaturation at 94 °C for 3 min, 35 cycles of denaturation at 94 °C for 30 sec, annealing at 58 °C for 30 sec, extension at 72 °C for 2 min. This is followed by final extension at 72 °C for 10 min, and holding at 4 °C.
Power supply, PowerPac Basic BIO-RAD 164-5050
EQUIPMENT - cell culture
Automated cell counter, Countess GIBCO-Invitrogen C10310 This automated cell counter separately measures the densities of live and dead cells (non stained and stained by trypan blue, respectively). It is important to know the optimal range of density measurements: the counter that we use has the highest accuracy in the range from 1 x 105 to 4 x 106 cells/ml. If the measured cell density values fall outside the recommended range, adjust the resuspension volume appropriately.
Biological Safety Cabinet, Class II, Type A2 NUAIRE NU-425-400 This hood is used for all cell culture procedures, except for brain dissection.
CO2 Incubator, AutoFlow, Humidity Control Water Jacket NUAIRE NU-4850
Horizontal Clean Bench NUAIRE NU-201-330 This clean bench is used for brain dissection (steps 3.1.1 and 3.1.2 of "Brain Dissection and Cellular Dissociation)".
Orbit LS Low Speed Shaker Labnet S2030-LS-B
SORVALL RC-6 Plus Superspeed Centrifuge Fisher 46910 (centrifuge)/46922 (rotor)

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Goslin, K., Asmussen, H., Banker, G. Ch. 13. Culturing Nerve Cells. Banker, G., Goslin, K. MIT Press. 339-370 (1998).
  2. Kakazu, Y., Koh, J. Y., Ho, K. W., Gonzalez-Alegre, P., Harata, N. C. Synaptic vesicle recycling is enhanced by torsinA that harbors the DYT1 dystonia mutation. Synapse. 66, 453-464 (2012).
  3. Kakazu, Y., Koh, J. Y., Iwabuchi, S., Gonzalez-Alegre, P., Harata, N. C. Miniature release events of glutamate from hippocampal neurons are influenced by the dystonia-associated protein torsinA. Synapse. 66, 807-822 (2012).
  4. Iwabuchi, S., Kakazu, Y., Koh, J. Y., Harata, N. C. Abnormal cytoplasmic calcium dynamics in central neurons of a dystonia mouse model. Neurosci. Lett. 548, 61-66 (2013).
  5. Koh, J. Y., Iwabuchi, S., Harata, N. C. Dystonia-associated protein torsinA is not detectable at the nerve terminals of central neurons. Neuroscience. 253C, 316-329 (2013).
  6. Iwabuchi, S., Koh, J. Y., Wang, K., Ho, K. W., Harata, N. C. Minimal change in the cytoplasmic calcium dynamics in striatal GABAergic neurons of a DYT1 dystonia knock-in mouse model. PLoS One. 8, e80793 (2013).
  7. Dahlborn, K., Bugnon, P., Nevalainen, T., Raspa, M., Verbost, P., Spangenberg, E. Report of the Federation of European Laboratory Animal Science Associations Working Group on animal identification. Lab. Anim. 47, 2-11 (2013).
  8. Kawano, H., et al. Long-term culture of astrocytes attenuates the readily releasable pool of synaptic vesicles. PLoS One. 7, e48034 (2012).
  9. Ozelius, L. J., et al. The early-onset torsion dystonia gene (DYT1) encodes an ATP-binding protein. Nat. Genet. 17, 40-48 (1997).
  10. Hanson, P. I., Whiteheart, S. W. AAA+ proteins: have engine, will work. Nat. Rev. Mol. Cell. Biol. 6, 519-529 (2005).
  11. White, S. R., Lauring, B. AAA+ ATPases: achieving diversity of function with conserved machinery. Traffic. 8, 1657-1667 (2007).
  12. Burdette, A. J., Churchill, P. F., Caldwell, G. A., Caldwell, K. A. The early-onset torsion dystonia-associated protein, torsinA, displays molecular chaperone activity in vitro. Cell Stress Chaperones. 15, 605-617 (2010).
  13. Zhao, C., Brown, R. S., Chase, A. R., Eisele, M. R., Schlieker, C. Regulation of Torsin ATPases by LAP1 and LULL1. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 110, E1545-1554 (2013).
  14. Ozelius, L. J., Lubarr, N., Bressman, S. B. Milestones in dystonia. Mov. Disord. 26, 1106-1126 (2011).
  15. Albanese, A., et al. Phenomenology and classification of dystonia: a consensus update. Mov. Disord. 28, 863-873 (2013).
  16. Goodchild, R. E., Kim, C. E., Dauer, W. T. Loss of the dystonia-associated protein torsinA selectively disrupts the neuronal nuclear envelope. Neuron. 48, 923-932 (2005).
  17. Dang, M. T., et al. Generation and characterization of Dyt1 ΔGAG knock-in mouse as a model for early-onset dystonia. Exp. Neurol. 196, 452-463 (2005).
  18. Tanabe, L. M., Martin, C., Dauer, W. T. Genetic background modulates the phenotype of a mouse model of DYT1 dystonia. PLoS One. 7, e32245 (2012).
  19. Huang, Z., Xu, H., Sandell, L. Negative regulation of chondrocyte differentiation by transcription factor AP-2α. J. Bone Miner. Res. 19, 245-255 (2004).
  20. Hall, R. D., Lindholm, E. P. Organization of motor and somatosensory neocortex in the albino rat. Brain Res. 66, 23-38 (1974).
  21. Kavalali, E. T., Klingauf, J., Tsien, R. W. Activity-dependent regulation of synaptic clustering in a hippocampal culture system. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 96, 12893-12900 (1999).
  22. Iwaki, S., Matsuo, A., Kast, A. Identification of newborn rats by tattooing. Lab. Anim. 23, 361-364 (1989).
  23. Wang, L. A primer on rodent identification methods. Lab. Anim. 34, 64-67 (2005).
  24. Deacon, R. M. Housing, husbandry and handling of rodents for behavioral experiments). Nat. Protoc. 1, 936-946 (2006).
  25. Castelhano-Carlos, M. J., Sousa, N., Ohl, F., Baumans, V. Identification methods in newborn C57BL/6 mice: a developmental and behavioural evaluation. Lab. Anim. 44, 88-103 (2010).
  26. Schaefer, D. C., Asner, I. N., Seifert, B., Burki, K., Cinelli, P. Analysis of physiological and behavioural parameters in mice after toe clipping as newborns. Lab. Anim. 44, 7-13 (2010).
  27. Doan, L., Monuki, E. S. Rapid genotyping of mouse tissue using Sigma's Extract-N-Amp Tissue PCR. Kit. J. Vis. Exp. e626 (2008).
  28. Chum, P. Y., Haimes, J. D., Andre, C. P., Kuusisto, P. K., Kelley, M. L. Genotyping of plant and animal samples without prior DNA purification. J. Vis. Exp. e3844 (2012).
  29. Demeestere, I., et al. Follicle-stimulating hormone accelerates mouse oocyte development in vivo. Biol. Reprod. 87, (3), 1-11 (2012).
  30. Warner, D. R., Wells, J. P., Greene, R. M., Pisano, M. M. Gene expression changes in the secondary palate and mandible of Prdm16-/- mice. Cell Tissue Res. 351, 445-452 (2013).
  31. Higgins, D., Banker, G. Ch. 3. Culturing Nerve Cells. Banker, G., Goslin, K. MIT Press. 37-78 (1998).
  32. Ahlemeyer, B., Baumgart-Vogt, E. Optimized protocols for the simultaneous preparation of primary neuronal cultures of the neocortex, hippocampus and cerebellum from individual newborn (P0.5) C57Bl/6J mice. J. Neurosci. Methods. 149, 110-120 (2005).
  33. Nunez, J. Primary culture of hippocampal neurons from P0 newborn rats. J. Vis. Exp. e895. (19), e895 (2008).
  34. Viesselmann, C., Ballweg, J., Lumbard, D., Dent, E. W. Nucleofection and primary culture of embryonic mouse hippocampal and cortical neurons. J. Vis. Exp. e2373 (2011).
  35. Leach, M. K., et al. The culture of primary motor and sensory neurons in defined media on electrospun poly-L-lactide nanofiber scaffolds. J. Vis. Exp. e2389 (2011).
  36. Beaudoin, G. M. 3rd, et al. Culturing pyramidal neurons from the early postnatal mouse hippocampus and cortex. Nat. Protoc. 7, 1741-1754 (2012).
  37. Seibenhener, M. L., Wooten, M. W. Isolation and culture of hippocampal neurons from prenatal mice. J. Vis. Exp. e3634 (2012).
  38. Pacifici, M., Peruzzi, F. Isolation and culture of rat embryonic neural cells: a quick protocol. J. Vis. Exp. e3965 (2012).
  39. Tischbirek, C. H., et al. Use-dependent inhibition of synaptic transmission by the secretion of intravesicularly accumulated antipsychotic drugs. Neuron. 74, 830-844 (2012).
  40. Nakanishi, K., Nakanishi, M., Kukita, F. Dual intracellular recording of neocortical neurons in a neuron-glia co-culture system. Brain Res. Brain Res. Protoc. 4, 105-114 (1999).
  41. Kaech, S., Banker, G. Culturing hippocampal neurons. Nat. Protoc. 1, 2406-2415 (2006).
  42. Kaech, S., Huang, C. F., Banker, G. General considerations for live imaging of developing hippocampal neurons in culture. Cold Spring Harb. Protoc. 2012, (3), 312-318 (2012).
  43. Song, H., Stevens, C. F., Gage, F. H. Astroglia induce neurogenesis from adult neural stem cells. Nature. 417, 39-44 (2002).
  44. Tang, X., et al. Astroglial cells regulate the developmental timeline of human neurons differentiated from induced pluripotent stem cells. Stem Cell Res. 11, 743-757 (2013).
  45. Ivkovic, S., Ehrlich, M. E. Expression of the striatal DARPP-32/ARPP-21 phenotype in GABAergic neurons requires neurotrophins in vivo and in vitro. J. Neurosci. 19, 5409-5419 (1999).
  46. Kaneko, A., Sankai, Y. Long-term culture of rat hippocampal neurons at low density in serum-free medium: combination of the sandwich culture technique with the three-dimensional nanofibrous hydrogel PuraMatrix. PLoS One. 9, e102703 (2014).
  47. Wang, X. F., Cynader, M. S. Effects of astrocytes on neuronal attachment and survival shown in a serum-free co-culture system. Brain Res. Brain Res. Protoc. 4, 209-216 (1999).
  48. Fath, T., Ke, Y. D., Gunning, P., Gotz, J., Ittner, L. M. Primary support cultures of hippocampal and substantia nigra neurons. Nat. Protoc. 4, 78-85 (2009).
  49. Shimizu, S., Abt, A., Meucci, O. Bilaminar co-culture of primary rat cortical neurons and glia. J. Vis. Exp. e3257 (2011).
  50. Mennerick, S., Que, J., Benz, A., Zorumski, C. F. Passive and synaptic properties of hippocampal neurons grown in microcultures and in mass cultures. J. Neurophysiol. 73, 320-332 (1995).
  51. Chen, G., Harata, N. C., Tsien, R. W. Paired-pulse depression of unitary quantal amplitude at single hippocampal synapses. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 101, 1063-1068 (2004).
  52. Albuquerque, C., Joseph, D. J., Choudhury, P., MacDermott, A. B. Dissection, plating, and maintenance of dorsal horn neuron cultures. Cold Spring Harb. Protoc. 2009, (2009).
  53. Xu, H. P., Gou, L., Dong, H. W. Study glial cell heterogeneity influence on axon growth using a new coculture method. J. Vis. Exp. e2111 (2010).
  54. Daniel, J. A., Galbraith, S., Iacovitti, L., Abdipranoto, A., Vissel, B. Functional heterogeneity at dopamine release sites. J. Neurosci. 29, 14670-14680 (2009).
  55. Calakos, N., Schoch, S., Sudhof, T. C., Malenka, R. C. Multiple roles for the active zone protein RIM1α in late stages of neurotransmitter release. Neuron. 42, 889-896 (2004).
  56. Garcia-Junco-Clemente, P., et al. Cysteine string protein-α prevents activity-dependent degeneration in GABAergic synapses. J. Neurosci. 30, 7377-7391 (2010).
  57. Hogins, J., Crawford, D. C., Zorumski, C. F., Mennerick, S. Excitotoxicity triggered by Neurobasal culture medium. PLoS One. 6, e25633 (2011).
  58. Panatier, A., Vallee, J., Haber, M., Murai, K. K., Lacaille, J. C., Robitaille, R. Astrocytes are endogenous regulators of basal transmission at central synapses. Cell. 146, 785-798 (2011).
  59. Noble, M., Mayer-Proschel, M. Ch. 18. Culturing Nerve Cells. Banker, G., Goslin, K. MIT Press. 499-543 (1998).
  60. Ahlemeyer, B., Kehr, K., Richter, E., Hirz, M., Baumgart-Vogt, E., Herden, C. Phenotype, differentiation, and function differ in rat and mouse neocortical astrocytes cultured under the same conditions. J. Neurosci. Methods. 212, 156-164 (2013).
  61. Malgaroli, A., Tsien, R. W. Glutamate-induced long-term potentiation of the frequency of miniature synaptic currents in cultured hippocampal neurons. Nature. 357, 134-139 (1992).
  62. Ryan, T. A., Reuter, H., Wendland, B., Schweizer, F. E., Tsien, R. W., Smith, S. J. The kinetics of synaptic vesicle recycling measured at single presynaptic boutons. Neuron. 11, 713-724 (1993).
  63. Harata, N. C., Choi, S., Pyle, J. L., Aravanis, A. M., Tsien, R. W. Frequency-dependent kinetics and prevalence of kiss-and-run and reuse at hippocampal synapses studied with novel quenching methods. Neuron. 49, 243-256 (2006).
  64. Yamamoto, M., Steinbusch, H. W., Jessell, T. M. Differentiated properties of identified serotonin neurons in dissociated cultures of embryonic rat brain stem. J. Cell Biol. 91, 142-152 (1981).
  65. Nakajima, Y., Masuko, S. A technique for culturing brain nuclei from postnatal rats. Neurosci. Res. 26, 195-203 (1996).
  66. Arttamangkul, S., Torrecilla, M., Kobayashi, K., Okano, H., Williams, J. T. Separation of μ-opioid receptor desensitization and internalization: endogenous receptors in primary neuronal cultures. J. Neurosci. 26, 4118-4125 (2006).
  67. O'Farrell, C. A., Martin, K. L., Hutton, M., Delatycki, M. B., Cookson, M. R., Lockhart, P. J. Mutant torsinA interacts with tyrosine hydroxylase in cultured cells. Neuroscience. 164, 1127-1137 (2009).
  68. Jiang, M., Deng, L., Chen, G. High Ca2+-phosphate transfection efficiency enables single neuron gene analysis. Gene Ther. 11, 1303-1311 (2004).
  69. Chen, Y., Stevens, B., Chang, J., Milbrandt, J., Barres, B. A., Hell, J. W. NS21: re-defined and modified supplement B27 for neuronal cultures. J. Neurosci. Methods. 171, 239-247 (2008).
  70. Robert, F., Hevor, T. K. Abnormal organelles in cultured astrocytes are largely enhanced by streptomycin and intensively by gentamicin. Neuroscience. 144, 191-197 (2007).
  71. Robert, F., Cloix, J. F., Hevor, T. Ultrastructural characterization of rat neurons in primary culture. Neuroscience. 200, 248-260 (2012).
Snelle Genotypering van dieren Gevolgd door Vaststelling Primaire culturen van neuronen in de hersenen
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Koh, J. Y., Iwabuchi, S., Huang, Z., Harata, N. C. Rapid Genotyping of Animals Followed by Establishing Primary Cultures of Brain Neurons. J. Vis. Exp. (95), e51879, doi:10.3791/51879 (2015).More

Koh, J. Y., Iwabuchi, S., Huang, Z., Harata, N. C. Rapid Genotyping of Animals Followed by Establishing Primary Cultures of Brain Neurons. J. Vis. Exp. (95), e51879, doi:10.3791/51879 (2015).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
simple hit counter