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Neuroscience

Rápido Genotipado de animales seguidas del establecimiento de cultivos primarios de neuronas cerebrales

doi: 10.3791/51879 Published: January 29, 2015
* These authors contributed equally

Summary

Se describe procedimientos para el etiquetado y la genotipificación ratones recién nacidos y la generación de cultivos primarios de neuronas de ellos. La genotipificación es rápida, eficiente y fiable, y permite la extracción automatizada de ácido nucleico. Esto es especialmente útil para los ratones neonatally letales y sus culturas que requieren previa cumplimentación del genotipado.

Abstract

Análisis de alta resolución de la morfología y función de las neuronas de mamíferos a menudo requiere la determinación del genotipo de los animales individuales, seguido por el análisis de cultivos primarios de neuronas. Se describe un conjunto de procedimientos para: etiquetado de los ratones recién nacidos que se genotipo, genotipificación rápida, y el establecimiento de cultivos de baja densidad de las neuronas del cerebro de estos ratones. Ratones individuales están etiquetados por los tatuajes, que permite la identificación a largo plazo que dura hasta la edad adulta. Genotipado por el protocolo descrito es rápido y eficiente, y permite la extracción automatizada de ácido nucleico con una buena fiabilidad. Esto es útil en circunstancias donde el tiempo suficiente para el genotipado convencional no está disponible, por ejemplo, en los ratones que sufren de letalidad neonatal. Cultivos primarios de neuronas se generan a baja densidad, que permite a los experimentos de imagen a alta resolución espacial. Este método de cultivo requiere la preparación de capas de alimentación gliales antes de chapado neuronal. El protocol se aplica en su totalidad a un modelo de ratón de la distonía trastorno del movimiento DYT1 (AE-torsinA ratones knock-in), y cultivos neuronales se prepara a partir del hipocampo, la corteza cerebral y el estriado de estos ratones. Este protocolo se puede aplicar a los ratones con otras mutaciones genéticas, así como a animales de otras especies. Además, los componentes individuales del protocolo se pueden utilizar para los sub-proyectos aislados. Por lo tanto este protocolo tendrá amplias aplicaciones, no sólo en la neurociencia, sino también en otros campos de las ciencias biológicas y médicas.

Introduction

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Modelos de roedores de enfermedades genéticas han demostrado ser útiles en el establecimiento de las funciones fisiológicas de las proteínas normales y ácidos nucleicos, así como las consecuencias fisiopatológicas de defectos en estos. Los ejemplos incluyen ratones deficientes para proteínas implicadas en funciones celulares clave, así como modelos de ratón de trastornos tales como la enfermedad de Alzheimer. Sin embargo, ciertas manipulaciones genéticas pueden conducir a la letalidad neonatal poco o unos pocos días después del nacimiento. En estos casos, los cultivos celulares primarios son una herramienta importante porque las células vivas se pueden obtener de las crías de embriones o neonatales antes de la muerte, que pueden mantenerse durante al menos un par de semanas in vitro, y durante este tiempo el desarrollo neuronal temprana pueden ser seguidos por experimentos bioquímicos, morfológicos y funcionales. Para los cultivos primarios, puede ser beneficioso para la placa de las neuronas a baja densidad; esto hace que sea posible visualizar la somata individual, dendritas, árboles axonal y termi nervionales en alta resolución espacial. Sin embargo, la supervivencia y la diferenciación de las neuronas a baja densidad típicamente requiere que se colocan en una capa alimentadora glial, co-cultivadas con células gliales en la ausencia de contacto físico con ellos, o se cultivaron en medio acondicionado por células gliales 1.

El establecimiento de cultivos neuronales de baja densidad en capas alimentadoras gliales puede depender de rápido y fiable de genotipado de antemano - dentro de unas pocas horas en contraste con unos pocos días. La velocidad es especialmente importante cuando el genotipo neuronal necesita ser adaptada a la de una capa alimentadora glial preparado de antemano. Como un ejemplo más práctico, puede ser necesario decidir que las crías de que el genotipo para usar en cultivos de generación, para optimizar la eficiencia de un experimento.

Aquí demostramos el protocolo de trabajo que se ha utilizado para una rápida y simplificada y fiable de genotipado de ratón en publicaciones anteriores 2-6. Colas de ratón yse utilizó un kit disponible comercialmente. Este protocolo incluye la extracción de una sola etapa de los ácidos nucleicos a partir del tejido, y no requiere ni una etapa de purificación de ácido nucleico ni el uso de un tampón de terminación ("solución de parada '). La fiabilidad de este método de genotipificación se ilustra mediante la presentación de los resultados de una serie de pruebas cuando se introducen las diferencias con respecto a la cantidad de partida de los especímenes, la edad de los animales y la longitud de los amplicones de PCR. Este kit ofrece las ventajas de la extracción y la fiabilidad automatizado.

Por el bien de ser integral, también se demuestra el uso de los tatuajes para la identificación a largo plazo de los ratones con genotipo. El tatuaje se logra mediante la aplicación de la tinta de tatuaje en la dermis de la piel (debajo de la epidermis) 7. Se describe un procedimiento para el tatuaje las almohadillas de las patas de ratones recién nacidos o 1 día de edad, aunque los tatuajes se pueden aplicar a otras partes del cuerpo, tales como colas y dedos de los pies, y para animals, de todas las edades. Además, los procedimientos se demostrarán para el recubrimiento y el cultivo de neuronas de ratón a una densidad baja, basado en la preparación optimizada de diferentes tipos de capas de alimentación gliales 2,8.

Usamos un modelo genético de ratón de la enfermedad neurológica DYT1 distonía heredado - un trastorno de movimiento autosómica dominante causada por una mutación en el gen TOR1A (c.904_906delGAG / c.907_909delGAG; p.Glu302del / p.Glu303del) 9. La proteína codificada, torsinA, pertenece a los "ATPasas asociados a diversas actividades celulares" (AAA +) familia de proteínas, cuyos miembros en general, desempeñará las funciones de tipo chaperón, la asistencia en: proteína que se desarrollan, desmontaje-proteína compleja, el tráfico de membrana, y la fusión de vesículas 10-13. La mutación en un marco de supresión de un codón para el ácido glutámico, y pueden llevar a la manifestación de "inicio temprano generalizado aislado distonía '14,15. Sin embargo, el caminomecanismos ophysiological responsables de este trastorno siguen siendo poco conocidos. En un modelo de ratón knock-in, el alelo mutante es TOR1A tm2Wtd, mencionado en lo sucesivo como TOR1A AE. Heterocigota? E-torsinA knock-en ratones son pacientes humanos viables genéticamente y mímicas con distonía DYT1, mientras homocigotos ronda en ratones mueren después del nacimiento 16,17, con la latencia a la muerte postnatal afectados por los antecedentes genéticos 18. La temprana muerte de homocigotos ratones knock-in requiere que tanto la determinación del genotipo de los animales y el establecimiento de cultivos neuronales se completan rápidamente. Como otro ejemplo de genotipado, TFAP2A (factor de transcripción AP-2α, la activación de la proteína de unión a 2α potenciador) se utilizará. La proteína codificada por este gen es importante en la regulación de múltiples procesos celulares, tales como la proliferación, la diferenciación, la supervivencia y apoptosis 19.

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Protocol

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NOTA: Todos los animales procedimientos realizados en este estudio fueron aprobados por el Comité de Cuidado y Uso de Animales Institucional de la Universidad de Iowa.

Identificación 1. a largo plazo de ratones utilizando Tatuaje las almohadillas de las patas

  1. Inmovilizar una pata con la (superficie plantar) almohadilla plantar cara al experimentador. Sostenga la pata con el pulgar y el dedo índice. Tenga cuidado de no pellizcar la pata.
    NOTA: inmovilización estable es importante asegurarse de que el pigmento del tatuaje se coloca en la dermis de la almohadilla de la pata, y por lo tanto es permanente 7.
  2. Limpiar la almohadilla de la pata con etanol al 70% sobre una esponja de gasa o hisopo.
  3. Aplicar aceite de la piel a un aplicador con punta de algodón, y presionar suavemente la punta contra la superficie de la almohadilla de la pata varias veces. Utilice sólo una pequeña cantidad de aceite de la piel; cuando está presente en grandes cantidades, se evitará que el pigmento del tatuaje de llegar a la piel.
  4. Sumerja las puntas de las agujas de tatuaje en la tinta de tatuaje justo antesa los tatuajes. Utilice limpia, aséptica y agujas de tatuaje afilados, para disminuir el dolor y la posibilidad de infección, y también para aumentar la eficiencia de tatuaje.
  5. Mientras que la superficie de la almohadilla de la pata se cubre con el aceite de la piel, presione la punta de aguja del tatuaje vertical y ligeramente contra la piel en el centro de la almohadilla de la pata, y se inyecta la tinta en múltiples ocasiones. Vea la Tabla de Materiales / Equipo para la información sobre el sistema de tatuaje eléctrica.
  6. Rocíe etanol al 70% en una esponja de gasa, presione suavemente contra la pata de eliminar pigmento del tatuaje extra en la superficie de la piel, e inspeccionar la calidad del tatuaje. Compruebe que el medio de la almohadilla de la pata tiene un punto oscuro, redondo que difiere de la pigmentación normal de la piel. Si el tatuaje no es oscuro o lo suficientemente grande como para facilitar la visualización, repita los pasos anteriores para tatuajes.

2. Los ratones recién nacidos Genotipado utilizando un kit de PCR genotipificación rápida

  1. Desinfectar el extremo distal de una cola de ratón con etanol al 70%, corte 5 mm o menos de la colala punta y la transfiere a un tubo de una tira 8 de tubo del tipo utilizado para la PCR. Use una hoja de afeitar no-utilizado para cada cachorro para evitar la contaminación cruzada entre las muestras. Alternativamente, utilice un par de tijeras, pero en este caso, con cuidado y eliminar completamente el tejido restante en las palas utilizando etanol al 70%. Compruebe si hay sangrado. Si se produce sangrado, aplique presión en la parte de corte de la cola con una esponja de gasa hasta que el sangrado se ha detenido.
  2. Añadir 200 l de solución de extracción de ADN a cada tubo de PCR que contiene una muestra. Vea la Tabla de Materiales / Equipo para su composición e información sobre el kit.
  3. Coloque la tira tubo en un termociclador de PCR, y comenzar la extracción de ADN utilizando el siguiente programa: 1 ciclo a 55 ° C durante 10 min, 1 ciclo a 95 ° C durante 10 minutos, y mantenimiento a 4 ° C.
    NOTA: Este es el mismo termociclador de PCR que se utiliza después para PCR.
  4. Una vez finalizada la extracción de ADN, retire la tira del tubo del termociclador unnd invertir 5 veces.
  5. Transferencia de 4 l de la solución (extracto de ADN) de cada muestra a un un-tubo utilizado de una tira de 8 tubos y mezclar con: 10 l de 2X PCR Ready Mix II, 2 l de mezclado adelante y atrás primers (se recomienda 0,5 M; véase la Tabla de Materiales / Equipo de secuencias), y 4 l de nucleasa libre de H 2 O, para cada muestra. Centrifugado brevemente (por ejemplo, 3 segundos) usando una centrífuga de mesa. Mantener los tubos en hielo en todo momento excepto durante la manipulación.
  6. Realizar ciclos térmicos. Ver Tabla de Materiales / Equipo para el programa térmico.
  7. Detectar los productos de ADN amplificados. Cargar la solución de reacción total de la PCR (20 l) directamente en un pocillo de un gel de agarosa. Cargar los marcadores de peso molecular en un pozo separado. Aplicar un campo eléctrico.
  8. Adquirir imágenes de fluorescencia de las bandas bajo la luz ultravioleta.

3. cultivo primario de cerebro de ratón Neuronas en glial conexión de la capa

NOTA: Los procedimientos para la disección de cerebro y de disociación de células (3,1) son comunes a todos los procedimientos posteriores. Los procedimientos de culturas gliales ratón (3.2), las culturas gliales de rata (3,3), y cultivos neuronales de ratón (3.4) se describen por separado después.

  1. Cerebro Disección y Celular Dissocaiation
    1. Sacrificar un ratón o una rata crías por decapitación, retire rápidamente el cerebro, y lo coloca en una solución de Hanks (ver Tabla 1 para la composición) + 20% de suero fetal bovino (SFB) en una placa de 35 mm (conservado en hielo).
    2. Cortar el cerebro a través de la línea media en dos hemisferios. Retire la región de interés (por ejemplo, la corteza cerebral, cuerpo estriado e hipocampo) de cada hemisferio del cerebro. Retire las meninges y los principales vasos sanguíneos de la superficie. Cortar la región del cerebro en 4-10 rodajas finas utilizando una cuchilla quirúrgica.
    3. Enjuague las rodajas de cerebro en un tubo de centrifugación de 15 ml, una vez que el ingenioLa solución de + 20% de FBS, y luego 3 veces con la Hanks 'h Hanks solución (es decir, sin suero) (todos a 4 ° C). Para enjuagar, añadir solución de 5-10 ml, dejar que el cerebro rebanadas se depositan en el fondo del tubo, aspirar la solución desde la parte superior, y añadir una solución fresca. Finalice el procedimiento de enjuague mediante la aspiración de la solución.
    4. Filtra 2 ml de la solución de digestión que contiene tripsina (véase la Tabla 1 para la composición) usando una jeringa de 3 ml y un filtro de jeringa de 0,2 micras, y añadir el filtrado directamente en el tubo que contiene las rodajas de cerebro. Deje que el tratamiento con tripsina proceder durante 13 minutos a temperatura ambiente.
    5. Neutralizar la solución de tripsina primero mediante la aspiración de la mayor parte de ella y luego mediante la adición de 7-10 ml de solución de Hanks '+ 20% FBS (4 ° C).
    6. Enjuagar las rodajas de cerebro, dos veces con Hanks '+ solución de FBS al 20%, y luego tres veces con la Hanks' solución (es decir, sin suero) (todos a 4 ° C). Finalice el procedimiento de enjuague aspirando el solutde iones.
    7. Filtra 2 ml de la solución de disociación (véase la Tabla 1 para la composición) usando una jeringa de 3 ml y un filtro de jeringa de 0,2 micras, y añadir el filtrado directamente al tubo con las rodajas de cerebro.
    8. Mecánicamente disociar las células por trituración suave 10-20 veces, hasta que las piezas de tejido visibles desaparecen. Use una pipeta Pasteur pulida al fuego algodón tapado y evitar hacer burbujas durante la trituración.
    9. Espere 3 minutos para piezas pequeñas para establecerse.
    10. Transferir la mayoría de la solución (~ 1,5 ml, dejando un poco de solución en la parte inferior) a un tubo de 15 ml de centrifugación que contiene 3 ml de solución de Hanks solución de FBS + 20% (4 ° C), utilizando el algodón enchufado, fuego pulido pipeta Pasteur. No transfiera toda la solución, porque la inserción de ningún sedimento en el fondo general resulta en el deterioro de la cultura.
    11. Se centrifuga durante 13 min a ~ 185 g (~ 1100 rpm) a 4 ° C.
    12. Aspirar el sobrenadante con cuidado,añadir 1 ml de pre-calentado medio de baño (37 ° C) al sedimento, y resuspender que pipeteando suavemente varias veces utilizando el algodón enchufado, pipeta Pasteur pulida al fuego.
      NOTA: Hay tres tipos diferentes de chapado medios se utilizan para diferentes propósitos cultura: chapado medio-1 para las células gliales del ratón, enchapado medio-2 para las neuronas de ratón, y enchapado medio-3 para las neuronas de rata y células gliales (ver Tabla 1 para las composiciones) .
    13. Sacar 10 l de la suspensión celular, se mezcla con 10 l de solución de azul de tripano al 0,4%, y medir la densidad de células vivas, utilizando un hemocitómetro o un contador de células automatizado.
  2. Culturas del ratón gliales
    1. Lavar los cubreobjetos para ayudar a establecer culturas saludables de células de ratón.
      1. Sumerja cubreobjetos de vidrio (redondo, diámetro 12 mm) en ácido nítrico al 70% en una placa de Petri de vidrio. Proteger de la luz utilizando papel de aluminio y colocarlo en un orbital agitador O / N.
      2. Enjuague el vaso coverslips en la placa de Petri al menos tres veces con agua destilada. Sumergir en agua destilada. Coloque el plato en un orbital agitador O / N.
      3. Seque el cubreobjetos sobre un papel de filtro Whatman 150 mm en la cabina de seguridad biológica.
      4. Autoclave los cubreobjetos.
      5. Coloque el cubreobjetos en 24 pocillos placa de cultivo.
    2. Etiqueta y genotipo ratones recién nacidos de acuerdo con los pasos 1 y 2.
    3. Obtener las células cerebrales de las crías de ratón, según el paso 3.1.
      NOTA: El uso de la corteza cerebral es típico para la preparación de la capa alimentadora glial ratón. Sin embargo, otras regiones del cerebro, como el hipocampo y el cuerpo estriado, trabajarán después del ajuste adecuado de la densidad celular debido a diferentes números y los rendimientos de las células de diferentes regiones.
    4. Añadir ~ 4 ml de pre-calentado chapado medio-1 a la suspensión final de células (~ 1 ml). Para pre-calentamiento medios de cultivo, colocar la solución en la incubadora de cultivo (5% de CO 2 -95% O 2, 37 ° C) O / N, parapermiten que los valores de temperatura y de pH se estabilice.
    5. Transferir la suspensión celular a un matraz de cultivo T25 sin revestir, usando el algodón enchufado, pipeta Pasteur pulida al fuego. Colocar el frasco en la incubadora de cultivo.
    6. En 1 día in vitro (DIV), enjuagar las células cultivadas en el frasco T25 dos veces con medio de baño-1 (4 ° C). Colocar el matraz de nuevo en la incubadora. Realizar aclarado por aspiración el medio interior del matraz completamente con una pipeta Pasteur, añadiendo ~ 5 ml de medio fresco y inclinando suavemente el matraz varias veces en un movimiento de torbellino.
    7. En 6-9 DIV, (es decir, un día antes de la tripsinización y enchapado en cubreobjetos, en pasos 3.2.8-3.2.13), colocar 100 l de material de recubrimiento con proteínas de la matriz extracelular (véase la Tabla de Materiales / Equipo para comentarios acerca de el material de revestimiento) en los cubreobjetos de vidrio en una placa de cultivo, y coloque la placa de cultivo en el incubador de cultivo.
    8. En 7-10 DIV, cuando las células son 20-40% confluentes (espacialmente continua), trypsinize ellos.
      1. Lavar el matraz una vez, por aspiración de toda la solución en el matraz y la adición de ~ 13 ml de solución de Hanks (4 ° C), inclinar suavemente el matraz varias veces en un movimiento de torbellino, y aspirar la solución completamente.
      2. Añadir 40 l de solución de DNasa (concentración final, 750 unidades / ml) a 4 ml de solución de tripsina-EDTA, pasar la solución a través de un filtro de jeringa de 0,2 micras, y añadir el filtrado directamente a las células en el matraz.
      3. Deje que el tratamiento con tripsina proceder durante 13 minutos a 37 ° C en la incubadora.
      4. Neutralizar la solución de tripsina mediante la adición de 2 ml de 100% de SFB (4 ° C) en el matraz.
      5. Transferencia de las células tratadas con tripsina a un tubo de 15 ml utilizando una centrifugación de 5 a 10 ml pipeta, añadir ~ 4 ml de solución de Hanks '+ 20% FBS (4 ° C), se centrifuga a ~ 185 g y 4 ° C durante 13 min y aspirar el sobrenadante.
    9. Resuspender el precipitado en 1 ml de pre-Warmemedio-1 d chapado.
    10. Medir la densidad de las células de acuerdo con la etapa 3.1.13.
    11. Aspirar el material de revestimiento completamente de los cubreobjetos de vidrio, y la placa de ~ 50 l de las células gliales se volvieron a suspender en cubreobjetos.
      NOTA: Estas células establecerán la capa alimentadora glial.
    12. Coloque la placa de cultivo con cubreobjetos en la incubadora.
    13. 20-60 min después, añadir 1 ml de pre-calentado medio de baño-1 a cada pocillo, y colocar el plato de nuevo en la incubadora. Nota: Mientras se añade el medio de recubrimiento, será útil usar otra pipeta para presionar hacia abajo la periferia del cubreobjetos (donde no hay células sembradas), de modo que el cubreobjetos no flotar en el medio.
    14. En DIV 1 de la capa alimentadora glial (es decir, en el cubreobjetos de vidrio), sustituir el medio con 1 ml de pre-calentado chapado medio-1, mediante la aspiración de toda la solución en un pozo y después de llenarlo con medio fresco.
    15. En 2-3 DIV de la capa alimentadora glial cuando el cells son 80-100% confluentes, añadir inhibidor mitótico (10 l de una mezcla de 5-fluoro-2 'desoxiuridina + uridina; concentraciones finales de 81,2 y 204,8 mu M, respectivamente) a cada pocillo, para inhibir la replicación del ADN y por lo tanto suprimir la proliferación de células gliales.
    16. En 7-9 DIV, cuando las células son 90-100% de confluencia (1-2 h antes de chapado neuronas en la capa alimentadora glial), sustituir el medio de cultivo con pre-calentado chapado medio-2 (37 ° C).
      NOTA: Las neuronas se sembraron en el mismo día, con el paso 3.4.
  3. Culturas Rata gliales
    1. Escudo un matraz de cultivo T25 con el mismo material de recubrimiento.
      NOTA: Esto es necesario para la posterior extracción de las células no adherentes en el paso 3.3.5.
      1. Añadir 2,0 ml del material de revestimiento al matraz, y colocar el matraz en el incubador de cultivo.
      2. Después de 2-3 horas, aspirar el material de recubrimiento por completo, de tal manera que el suelo del matraz se vuelve seca.
    2. Obtener las célulasde las crías de rata, según la etapa 3.1.
      NOTA: La región CA3-CA1 del hipocampo se utiliza para la preparación de la capa alimentadora glial de rata. Sin embargo, otras regiones del cerebro, tales como la corteza cerebral y el cuerpo estriado, trabajarán después de ajustar por diferencias en la densidad celular debido a diferentes números y rendimientos de células de diferentes regiones.
    3. Añadir ~ 4 ml de pre-calentado chapado medio-3 a la suspensión final de células (~ 1 ml).
    4. Transferir la suspensión celular en el matraz de cultivo T25 recubiertos, usando el algodón enchufado, pipeta Pasteur pulida al fuego. Colocar el frasco en la incubadora de cultivo (5% de CO 2 -95% de O 2, 37 ° C).
    5. En 2-3 DIV, cuando las células son 20-40% de confluencia, retire no adherente o débilmente células adherentes, mediante el cierre de la tapa con fuerza, agitando el matraz vigorosamente ~ 10 veces, aspirando la solución, y la adición de 4-5 ml de chapado medio-3 (a 4 ° C). Repita este procedimiento una vez. Examinar las células cultivadas a través de toda la planta matraz (por ejemplo,usando microscopio de contraste de fase) para confirmar que los que aparecen neuronal (es decir, aquellos para los que el borde exterior del cuerpo celular aparece en fase brillante) se elimina por completo. Repita el procedimiento con la frecuencia necesaria para eliminar estas células y, a continuación, devolver el frasco a la incubadora.
      NOTA: La fuerza y ​​el número total de 'sacudidas' requeridas pueden variar entre los experimentadores individuales. Lo importante no es mantener el número total de batidos a un número determinado, pero para confirmar que las células tipo neuronas son eliminados.
    6. En 6-8 DIV, cuando las células son 90-100% de confluencia, el paso de las células gliales por tripsinización como en el paso 3.2.8.
    7. Después de la centrifugación, resuspender el precipitado en 1 ml de medio de baño-3 (4 ° C), añadir 10 ml de medio de baño-3 (4 ° C), la transferencia de las células tratadas con tripsina a un matraz T75-un recubiertos, y la cultura en la incubadora.
      NOTA: Las células gliales de rata se pasaron dos veces; en contraste las células gliales del ratón are pases sólo una vez porque se vuelven poco saludable después de varios pasajes. Las células gliales de rata se pasaron en matraces T75 que no están recubiertos con cualquier material de recubrimiento. El recubrimiento permite que las células gliales de rata crezcan demasiado rápido y producen muchas células ciliadas (células ependimarias putativos), que se deterioran las condiciones de cultivo neuronal después.
    8. En 17-19 DIV de la cultura glial en un matraz (es decir, 11 días después de pases y un día antes de la tripsinización y enchapado en cubreobjetos por pasos 3.3.9-3.3.14), 100 l de colocar el material de revestimiento en cubreobjetos de vidrio sin lavar ( redonda, 12 mm de diámetro) en una placa de cultivo, y coloque la placa de cultivo en el incubador de cultivo.
      NOTA: Para los cultivos gliales de rata, una diferencia no se observó en los resultados de los cultivos con o sin lavarse los cubreobjetos.
    9. En 18-20 DIV de la cultura glial en un matraz (es decir, 12 días después de los pases), preparar la capa alimentadora glial por trypsinizing las células cultivadas, según step 3.2.8.
    10. Durante la centrifugación, aspirar el material de revestimiento completamente de los cubreobjetos de vidrio.
    11. Después de la centrifugación, resuspender el precipitado en 1 ml de medio de chapado-3 (4 ° C), y medir la densidad celular, según la etapa 3.1.13.
    12. Ajuste la densidad glial a 10 4 células / ml en vivo, y la placa 100 l de la suspensión de células gliales en los cubreobjetos de vidrio recubiertos.
      NOTA: Estas células establecerán la capa alimentadora glial.
    13. Coloque la placa de cultivo con cubreobjetos en la incubadora durante 20-60 min.
    14. Añadir 1 ml de medio de chapado-3 (4 ° C) a cada pocillo, y colocar el plato de nuevo en la incubadora.
    15. En 3-4 DIV de la capa alimentadora glial, cuando las células sobre cubreobjetos son 40-80% de confluencia, añadir 1 ml del medio de crecimiento pre-calentado (véase la Tabla 1 para la composición) que contiene citosina β-D-arabinofuranósido ( AraC, concentración final de 4 mM) para detener la proliferación de células gliales. Neurona Plates a 7-9 DIV de la capa alimentadora glial cuando las células son 60-80% de confluencia, con el paso 3.4.
  4. Culturas del ratón neuronales
    1. Etiqueta y genotipo ratones recién nacidos de acuerdo con los pasos 1 y 2.
    2. Utilice las crías de ratón para el paso 3.1.
    3. Ajuste la densidad de la suspensión de células vivas a ~ 2,0 x 10 5 células / ml utilizando pre-calentado chapado medio-2 para el recubrimiento sobre las células gliales del ratón, o el uso de chapado medio-3 para el recubrimiento sobre las células gliales de rata.
    4. Placa de las células en la capa alimentadora glial, añadiendo suavemente la suspensión celular al medio de cultivo de cada pocillo. Nota: El volumen de la suspensión celular que se añade será determinado por el número de destino de las células en un pocillo de cultivo. Por ejemplo, la placa de ~ 60 l de suspensión de células para alcanzar 12.000 células / pocillo.
    5. Tenga en cuenta que no hay solución cambios son necesarios después de que las neuronas se sembraron. Tenga cuidado para evitar la evaporación de la solución de los pozos en el transcurso de la cultura, por humidificar el interior of la incubadora de cultivo.

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Representative Results

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Como ejemplo de la aplicación de este protocolo, los resultados representativos se muestran para el etiquetado de los ratones por los tatuajes, genotipificación fiable en diversas condiciones experimentales, y el establecimiento de cultivos primarios de neuronas en capas de alimentación gliales.

El tatuaje

Los cachorros recién nacidos fueron marcadas en las almohadillas de las patas utilizando un sistema de tatuajes ('recién nacido' en la Figura 1). Las etiquetas se mantuvo claramente visible a las 3 semanas 32 semanas de edad ('3 semanas de edad') y ('32 -Semana de edad "). El ratones individuales puede ser identificada por una combinación de tatuajes en las cuatro patas (números 1-16) y por la información acerca de la jaula animal, o esquemas de numeración más complejos (no mostrado).

Genotipado

Un ejemplo representativo de genotipado se muestra (Figura 2). El gen TOR1A de tipo salvaje (TOR1A (TOR1A + / AE) y homocigotos (TOR1A? E / AE) AE-torsinA ratones knock-in se amplificó a partir del ADN genómico aislado de los clips de la cola de los cachorros recién nacidos. Genotipado en este ejemplo específico se basa en la presencia de un solo sitio loxP de 34 pares de bases en el alelo mutante TOR1A después exitosa recombinación Cre y la supresión de un casete de resistencia a la neomicina 16,18.

ADN genómico fue extraído con práctica en un tiempo mínimo, y muchas muestras fueron procesadas simultáneamente. Los volúmenes de extracción se mantuvieron constantes, y por lo tanto ningún ajuste del volumen era necesario para dar cabida a los cambios en las condiciones ensayadas. La fiabilidad de genotipado se puso a prueba en cuatro condiciones, como se detalla a continuación.

Primero, el efecto de las diferencias en la cantidad de tejido de partida fue examinado (Figura 3). Colas de diferentes longitudes eranpreparado a partir del heterocigoto? E-torsinA ronda en ratones (TOR1A + / AE) a la edad de destete (~ 3 semanas). Longitudes de cola de 2 a 5 mm, la gama normalmente se recomienda en protocolos de genotipado, dieron el mismo resultado genotipado de alta calidad. Las dos bandas corresponden a la de tipo salvaje y alelos mutados (TOR1A + y TOR1A? E, respectivamente).

En segundo lugar, los efectos de la variabilidad en la edad del animal fueron examinados (Figura 4). Las colas se obtuvieron de recién nacido, 3 semanas de edad y ~ 24 semanas de edad? E-torsinA heterocigóticos knock-en ratones (TOR1A + / AE). Los homocigotos no se utilizaron porque mueren varios días después del nacimiento 16-18. Las dos bandas esperadas para la de tipo salvaje y genes mutados TOR1A eran visibles, independientemente de la edad del animal (Figura 4A). La aplicabilidad general de este resultado fue probada usando un segundo gen, TFAP2A 19 en salvaje-tratones ipo (TFAP2A + / +) (Figura 4B).

En tercer lugar, los efectos de las diferencias en la longitud de los amplicones de PCR fueron probados (Figura 5). Para este propósito, los diferentes pares de cebadores fueron sintetizados para un determinado gen, de tal manera que los ADN amplificados son de diferentes longitudes de pares de bases. El gen TFAP2A fue detectado consistentemente con diferentes longitudes de amplicón.

En cuarto lugar, dos métodos de extracción de ADN se compararon (Figura 6). En un método, se utilizaron tiras de tubos de PCR y el termociclador PCR (descrito en el paso 2). Este es un método de extracción automatizado paralelo multi-tubo ("Auto" en la Figura 6). Debido a que múltiples tubos se pueden manejar simultáneamente en formato de tira, y una máquina de PCR se utiliza con un programa para operar en cuatro pasos de temperatura, no hay necesidad de transferir los tubos, manualmente cambiar la temperatura durante la extracción o utilizar múltiples piezasde los equipos. Por lo tanto, es fácil de procesar muchas muestras. Esto se comparó con el segundo método basado en la extracción de un solo tubo manual ('Manual' en la Figura 6). Esto utiliza tubos individuales de PCR y máquinas no PCR separadas (bloques de calor y baños de agua) para controlar la temperatura durante la extracción de ADN. En este caso, tubos múltiples, individuales fueron trasladados a una nueva temperatura después de cada paso, que requiere múltiples aparatos de control de temperatura. En ambos casos, el gen TOR1A se analizó en de tipo silvestre, heterocigotos y homocigotos? E-torsinA knock-en ratones (Figura 6A), y el gen TFAP2A se analizó en ratones de tipo salvaje (Figura 6B). Los dos protocolos de extracción dieron resultados de genotipado equivalentes.

En resumen, los resultados presentados en las Figuras 3 a 6 demuestran que el método de genotipificación es robusto, la obtención de resultados fiables y reproducibles a pesar de VAriaciones en cantidad de tejido, la edad del animal, la longitud de amplificación, y el protocolo de extracción utilizado.

Cultivos neuronales

Para el cultivo de neuronas de ratón en la capa alimentadora glial ratón, el orden de los procedimientos es: (tatuaje recién nacido ratones → genotipado para la cultura glial →) cultura glial → tatuaje ratones recién nacidos → genotipado para la cultura neuronal → cultivo neuronal. Para los cultivos establecidos en la capa alimentadora glial de rata, los procedimientos en paréntesis se omiten.

Se examinó el efecto de apoyo de la capa alimentadora glial pre cabeza de serie en la supervivencia neuronal y el crecimiento. Las neuronas se obtuvieron de la región CA3-CA1 del hipocampo, la región del motor de la corteza cerebral, y el cuerpo estriado de los ratones de tipo salvaje recién nacidos. Ellos se sembraron a baja densidad en la capa alimentadora glial de rata que se había obtenido de la región CA3-CA1 del hipocampo y sin semillas antes de chapado neuronal, segúnel esquema ilustrado en la Figura 7 (resumen simplificado de los procedimientos). Culturas de baja densidad son óptimas para la obtención de imágenes de dendritas individuales, somata 4,6, terminales nerviosas 2,3,5,8 y 5 ejes axonal en alta resolución espacial. Las células del hipocampo (que contiene tanto las neuronas y células gliales) se sembraron en cubreobjetos de vidrio recubiertos, ya sea con (Figura 8A) o sin una capa alimentadora glial pre-establecido (Figura 8B, C) ​​y se observaron con óptica de contraste de fase. En presencia de una capa alimentadora glial casi confluentes, las neuronas (en cada panel, una punta de flecha indica una neurona representante) fueron relativamente dispersos 3 y 7 días después de la siembra (días in vitro, DIV) (Figura 8A). También mostraron signos de buena salud, como un claro margen de somata neuronal, dendritas extendidas, la falta de somata agrupado, y la falta de neuritas en paquete (imag de gran aumentoes en inserciones). A los 14 DIV, estas neuronas forman una densa red caracterizada por neuritas largas (dendritas y axones). Tenga en cuenta que la proliferación glial se inhibió antes se sembraron neuronas, mediante la adición de medio de crecimiento que contiene el AraC inhibidor mitótico (paso 3.3.15).

En contraste, en la ausencia de la capa alimentadora glial en el momento de la siembra las neuronas del hipocampo, el crecimiento de las neuronas del hipocampo en cultivo se vio afectada, incluso en ausencia de AraC. A las 3 de DIV, las células gliales (incluidas en las células del hipocampo recién chapados) no han formado una lámina confluente (asterisco en el panel superior de la Figura 8B). Los cultivos se mostraron varios signos que no son apropiados para los estudios de imágenes de alta resolución, como amplias zonas sin células gliales subyacentes (asterisco), la presencia de somata agrupado y la presencia de neuritas agrupados en algunas áreas (datos no mostrados). Por 7 DIV, las células gliales forman una lámina confluente (panel central de la Figura 8C). Sin embarer, las neuronas eran menos numerosos que cuando las neuronas se sembraron en una capa alimentadora glial preestablecido. Las neuronas supervivientes también carecían de neuritas, la red de formación de largas (recuadro). Las células gliales fueron más heterogénea en la curvatura y el espesor que los de la cultura capa alimentadora, apareciendo por lo tanto en fase brillante. Con el fin de probar los efectos de la supresión de la proliferación glial en las neuronas, se aplicó AraC que contiene medio de crecimiento. Cuando se añadió AraC en 3 o 7 DIV y las células se cultivaron hasta 14 DIV y se observa en este día (Figura 8B y C, paneles inferiores), las células gliales cubrían la mayor parte de la superficie de cubreobjetos. Sin embargo, las neuronas eran todavía pocos en número, especialmente cuando AraC se aplicó a 7 DIV. Las neuronas supervivientes tenían sólo los procesos cortos y no estaban conectados ampliamente. Por lo tanto, el difunto adición de AraC permitió una capa glial uniforme para formar pero no promovió la viabilidad neuronal o la extensión de neuritas; más bien el crecimiento glial incontroladatenido efectos deletéreos sobre las neuronas.

Estos datos muestran que la capa alimentadora glial es crítico para la supervivencia y crecimiento de las neuronas chapados a baja densidad, y que la capa glial debe estar presente en el momento de la siembra neuronal en lugar de más tarde durante el cultivo neuronal. Resultados similares fueron obtenidos a partir de cultivos de la corteza cerebral (Figura 9) y las neuronas del cuerpo estriado (Figura 10).

La observación cualitativa sobre la supervivencia neuronal se confirmó por análisis cuantitativo. Específicamente, se contó el número de neuronas supervivientes en 14 DIV, basado en imágenes de contraste de fase de las culturas (Figura 11). El número fue mayor para las neuronas cultivadas sobre una capa alimentadora glial (es decir., Chapados en la capa alimentadora glial). El número fue menor en el caso de las neuronas cultivadas en ausencia de una capa alimentadora glial. El número se redujo aún más cuando las células fueron tratadas con AraC en unatiempo más tarde. Estas diferencias fueron estadísticamente significativas, y se observaron en cultivos de neuronas obtenidas de las tres regiones del cerebro.

Se identificaron los tipos de células supervivientes en 14 DIV en el ratón cultivos de hipocampo en placas en la capa de alimentación de hipocampo de rata. Doble inmunocitoquímica se realizó usando anticuerpos contra el marcador neuronal, la proteína asociada a microtúbulos 2 (MAP2), y el astrocytic marcador de células glial, proteína ácida fibrilar glial (GFAP). Las células con procesos largos fueron positivas para MAP2, mientras que las células en la capa alimentadora glial subyacente fueron positivos para GFAP (dos campos de imagen representativos, Figura 12A). Esta tinción no era un artefacto de una combinación específica de anticuerpos primarios y secundarios, ya que se obtuvo el mismo patrón cuando se usó un conjunto diferente de anticuerpos secundarios (Figura 12B).

En contraste, cuando se perfo la misma tinciónrma en las culturas que consta de sólo una capa alimentadora glial, es decir, en ausencia de células de ratón añadido (dos campos de imagen representativos, Figura 13A), no hay células fueron positivas para MAP2. Las células de la capa alimentadora fueron sistemáticamente positiva para GFAP. Para un control negativo, ambos anticuerpos primarios se omitieron del procedimiento de inmunocitoquímica (Figura 13B). No se detectó tinción en estas muestras, aunque las células estaban presentes, como se desprende de la óptica de luz transmitida (contraste de interferencia diferencial, DIC) y tinción nuclear con colorante Hoechst. Por lo tanto, la tinción no específica en los canales MAP2 y GFAP era muy débil.

Estos datos inmunocitoquímicos También se analizaron cuantitativamente (Figura 14). En cada imagen de 8 bits, se midió la intensidad y representa a lo largo de una línea. Parcelas superpuestas revelan tinción MAP2 cuando las células de ratón (muestras que contienen neuronas) se cultivaron en una capa alimentadora glial (neurona +,glia +, anticuerpo primario (1 ° Ab) +), mientras que tal tinción en cultivos de células alimentadoras glial solos (neurona estaba ausente -, + glia, 1 ° Ab +). En un control negativo sin anticuerpos primarios, la tinción era insignificante en cultivos de células alimentadoras glial solos (Neuron -, + glia, 1 ° Ab -). La tinción GFAP fue evidente en la capa alimentadora glial, independientemente de si se sembraron células de ratón (neurona +, + glia, 1 ° Ab +) o no (neurona -, + glia, 1 ° Ab +). Una vez más, la tinción en el control negativo fue insignificante (neurona -, + glia, 1 ° Ab -). Estos resultados muestran que la capa alimentadora glial de rata se compone sobre todo de los astrocitos, y que las neuronas sólo estaban presentes cuando se añadieron las células de ratón. También indican que las neuronas presentes en estos cultivos se originaron únicamente a partir de ratón.

La Sección de Resultados del video en línea también muestra las imágenes DIC y MAP2 de neuronas cultivadas chapada en una capa alimentadora glial, boº preparó a partir de la región del hipocampo CA3-CA1 de ratones de tipo salvaje.

Para el control detallado de cultivo celular, se recomienda para medir la densidad de células vivas, tanto para evaluar la calidad general de la disección del cerebro y los pasos de disociación celular, y para el recubrimiento de las células a la densidad predeterminada. A continuación se enumeran cuatro conjuntos de mediciones típicas densidad. Nótese, sin embargo, que estos números pueden variar dependiendo de las condiciones de cultivo y reactivos. Por ejemplo, incluso diferentes lotes de suero del mismo fabricante pueden afectar los resultados. Por lo tanto, estas cifras deben considerarse un indicador general, en lugar de una pauta absoluta.

Para la disociación celular (paso 3.1.13), los valores típicos para la densidad de células vivas obtenido de una cría son: ~ 2 x 10 5 células / ml (ratón corteza motora y CA3-CA1 del hipocampo del ratón), ~ 5 x 10 5 células / ml (corteza cerebral de ratón y de rata hipocampo CA3-CA1), y ~ 1 x 10 6 canas / ml (cuerpo estriado del ratón). En todos estos casos, las fracciones de células vivas fueron> 90% (viabilidad, definida como la relación entre el número de células vivas a la del número total de células). La corteza motora es vagamente definido como la región de la corteza cerebral que yace dorsal inmediatamente al estriado 20. Para cultivos de hipocampo, adecuada se prefieren las regiones CA3 y CA1 del hipocampo. Todo el hipocampo incluye adicionalmente el giro dentado, la inclusión de los cuales conduce a la formación de grandes terminales nerviosas de las células granulares y presenta heterogeneidad en propiedades sinápticas 21. La cultura del estriado incluye el caudado-putamen y globo pálido, pero no incluye el núcleo accumbens, o medial o núcleos septales laterales en las estructuras cercanas.

Para el cultivo glial de ratón (paso 3.2.11), la densidad de placas es ~ 10.000 células gliales de cada 12 mm cubreobjetos redondos, utilizando ~ 50 l de suspensión celular a una densidad de ~ 2 x10 5 células / ml. Por lo general, la densidad medida en el sobrenadante es relativamente constante y no requiere ajuste. Para convertir la densidad sobre diferentes áreas, la información útil es que el cubreobjetos tiene un diámetro de 1,20 cm y un área de 1,13 cm 2. Por lo tanto, ~ 10.000 células / cubreobjetos = ~ 8800 células / cm 2 en un cubreobjetos.

Para rata cultura glial (paso 3.3.12), la densidad de placas es de ~ 1000 células gliales de cada 12 mm cubreobjetos redondo, utilizando ~ 100 l de suspensión celular a una densidad de 1x10 ~ 4 células / ml. Por lo tanto, 1.000 células / cubreobjetos = ~ 900 células / cm 2 en un cubreobjetos.

Para ratón de baja densidad de cultivo neuronal (paso 3.4.4), la densidad de placas oscila entre 2.000 y 48.000 células por pocillo de una placa de 24 pocillos. Los valores típicos cuando enchapado neuronas en las células gliales de rata son: 10,000-24,000 células / pocillo para las neuronas de la corteza cerebral, 12.000-24.000 células / pocillo para CA3-CA1 neuronas del hipocampo y 24,000-48,000 células / pocillo para las neuronas del cuerpo estriado. Cuando en placas sobre células gliales de ratón, el número se reduce, por ejemplo, 2000 células / pocillo para CA3-CA1 neuronas del hipocampo. Como nota al margen, para el recubrimiento de rata CA3-CA1 neuronas del hipocampo en una capa alimentadora glial de rata, la densidad de placas es 1.000-6.000 células /. Para la conversión de la densidad en un pozo para la densidad de un cubreobjetos, la información útil es que el diámetro interno bien en la parte inferior es 1,56 cm y su área es de 1,91 cm 2. Así, por ejemplo, 12.000 células / pocillo = 7100 células / cubreobjetos = 6300 células / cm 2 en un cubreobjetos. Estas densidades se eligieron con el objetivo de cultivar neuronas relativamente escasa para la formación de imágenes celulares de alta resolución. Los investigadores deben elegir sus números que mejor se adapten a sus objetivos experimentales.

Figura 1
Figura 1. almohadillas de las patas tatuadas de ratones. Nratones ewborn fueron etiquetados por tatuarse las almohadillas de las patas. Ellos se fotografiaron inmediatamente después de tatuaje (recién nacido), a las 3 semanas de edad (3-semanas de edad) y a las 32 semanas de edad (de 32 semanas de edad). Las etiquetas se mantuvo visible durante la edad adulta. Las imágenes fueron tomadas de diferentes animales. Ellos no aparecen en la misma escala. Por favor, haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 2
Figura 2. Genotipado de tipo salvaje (TOR1A + / +), heterocigotos (TOR1A + / AE) y homocigotos (TOR1A? E / AE) AE-torsinA ronda en ratones. Se analizaron los alelos del gen TOR1A de tipo salvaje y mutante formas, utilizando ADN extraído de las colas de los cachorros recién nacidos. Tconsejos ail eran ~ 4 mm de longitud. ADN se tiñó utilizando SYBR seguro ADN Gel manchas. Vea la Tabla de Materiales / Equipo para la información acerca de los cebadores y programa ciclos térmicos para gen TOR1A. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 3
Se han usado Figura 3. Detección de ADN genómico en el contexto de la variación en la cantidad de material de partida. Puntas de la cola de diferentes longitudes. Animales probados fueron 3 semanas de edad, heterocigotos? E-torsinA ronda en ratones (TOR1A + / AE). Lanes representan las longitudes de la cola de 2, 3, 4 y 5 mm, por duplicado (desde la izquierda). Las puntas de la cola se obtuvieron a partir de diferentes ratones. Marcadores de tamaño de peso molecular en el carril de la izquierda representan ADN longitudes en steps de 100 pares de bases. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 4
Figura 4. Detección de ADN genómico en el contexto de la variación en la edad del animal. Gen (A) TOR1A. Lanes representan cola consejos obtenidos de heterocigotos? E-torsinA ronda en ratones (TOR1A + / AE) en las siguientes etapas: recién nacido, 3 semanas de edad, y ~ 24 semanas de edad (por duplicado desde la izquierda) (B). TFAP2A gen. Lanes representan cola consejos obtenidos de tipo salvaje (TFAP2A + / +) ratones en las siguientes etapas: recién nacido, 3 semanas de edad, y ~ 24 semanas de edad (por duplicado desde la izquierda). Ambos genes se amplificaron a partir de colas ~ 4 mm de longitud. El fragmento de PCR esperado es 498 pb. El programa de PCR wa Es el mismo que el utilizado para el gen TOR1A. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 5
Figura 5. Detección de ADN genómico en el contexto de la variación en la longitud del amplicón de PCR. El gen TFAP2A se analizó con longitudes de amplicón de PCR de 498 pb (carriles de la izquierda), 983 pb (carriles centrales) y 1990 pb (carriles de la derecha) en duplicados. El gen se amplificó a partir de colas de ratones de 3 semanas de edad. Marcadores de tamaño de peso molecular en los carriles izquierdo y derecho del gel representan longitudes de ADN en pasos de 100 y 200 pares de bases, respectivamente. Vea la Tabla de Materiales / Equipo para información sobre los cebadores para diferentes amplicones. 879fig5highres.jpg "target =" _ blank "> Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 6
Figura 6. Detección de ADN genómico en el contexto de la variación en el método de extracción de ADN. Los resultados para el manual, la extracción de un solo tubo (Manual) y los métodos paralelos, de extracción de múltiples tubos automatizados (Auto) se comparan. Este último método se utiliza en este informe. Los genes fueron amplificados de colas ~ 4 mm de largo, recogido de los recién nacidos. (A) gen TOR1A en los cachorros recién nacidos de AE-torsinA knock-en ratones. Lanes representan los ADN extraídos de tipo salvaje (manual y automático), heterocigotos (manual y automático), y los ratones homocigotos (manual y automática) (desde la izquierda). (B) de genes TFAP2A en ratones de tipo salvaje 3 semanas de edad. El fragmento de PCR esperado es 498 pb.jove.com/files/ftp_upload/51879/51879fig6highres.jpg "target =" _ blank "> Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 7
Figura 7. simplificado, ilustración esquemática de los procedimientos para el recubrimiento de las neuronas de ratón en el ratón (A) y la rata (B) capas de alimentación gliales. Los números de días (días in vitro) se refieren a los días acumulativos después de las células gliales se sembraron por primera vez en la cultura frascos. Sirven sólo como una estimación aproximada. Para más detalles prácticos, ver los Procedimientos de sección. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 8
Figura 8. Efecto de apoyode capa alimentadora glial en el crecimiento de las neuronas del hipocampo en un cultivo de baja densidad. Las neuronas se obtuvieron de la región CA3-CA1 del hipocampo de ratones recién nacidos, de tipo salvaje. células del hipocampo (A) de ratón se sembraron en cubreobjetos de vidrio recubiertos, que había sido pre-siembra con una capa alimentadora glial de rata obtenido a partir de la región CA3-CA1 del hipocampo. Las neuronas se dispersan uniformemente de una manera sana. Los cultivos se observaron a los 3, 7 y 14 DIV. Células del hipocampo (B, C) ​​de ratón se cultivaron en cubreobjetos de vidrio recubiertos, que no tenían ninguna capa alimentadora preestablecido. Los cultivos se observaron en 3 DIV (panel superior en B) y 7 DIV (panel central en C) sin tratamiento AraC. En otros conjuntos de cultivos, las células fueron tratadas con AraC en 3 DIV (panel inferior en B) y 7 DIV (panel inferior en C), y se observaron a los 14 DIV. Todas las imágenes representan los cultivos hermanos obtenidos de la misma pup, cuyas neuronas se sembraron en el mismo día. Ver texto para más detalles. Para cada grupo, un examplio de una neurona se indica con una punta de flecha blanca y engrandecido en un recuadro. Las neuronas tienen cuerpos celulares cuyo perímetro aparece brillante cuando se ve por la óptica de contraste de fase, y también tienen procesos de espesor. Los asteriscos indican las áreas sin células gliales. Los cultivos fueron imágenes en directo en un microscopio invertido utilizando la óptica de contraste de fase con 20X lente objetivo (apertura numérica de 0,45) y sin un objetivo intermedio (es decir, a 1x). Por favor, haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 9
Figura 9. efecto de apoyo de la capa alimentadora glial en el crecimiento de las neuronas corticales cerebrales en un cultivo de baja densidad. Resultados similares como en la Figura 8, pero con las neuronas obtenidas a partir de la región de motor de ccorteza erebral. Las condiciones bajo las etiquetas AC corresponden a los de la Figura 8. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 10
Figura 10. Efecto de apoyo de capa alimentadora glial en el crecimiento de las neuronas del cuerpo estriado en un cultivo de baja densidad. Resultados similares como en las Figuras 8 y 9, pero con las neuronas obtenidas a partir del cuerpo estriado. Las condiciones bajo las etiquetas AC corresponden a los de la Figura 8. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 11. Efecto de apoyo de capa alimentadora glial en la supervivencia neuronal. El número de neuronas supervivientes se contó en los experimentos mostrados en la Figura 8, el uso de las imágenes adquiridas por microscopía de contraste de fase. Imágenes en 14 DIV se muestran aquí de nuevo, pero con puntas de flecha que apunta a ejemplos de neuronas contados. El gráfico de barras muestra el número de neuronas por campo de imagen (m x 449,0 335,5 m) (media ± error estándar de la media, n = 7-24 campos para cada condición de cultivo). Los asteriscos indican diferencias estadísticamente significativas de 'capa alimentadora glial (-), AraC el 3 DIV "y" capa alimentadora glial (-), AraC el 7 DIV' de 'capa glial de alimentación (+)' (* p <0,05, ** p <0,01, prueba t de Student). Los números sobre las barras indican la densidad neuronal medido en montajes de múltiples campos de imagen. Imágenes fueronadquirida utilizando una lente objetivo de 20X. Para evitar el sesgo de adquisición, todas las imágenes se adquirieron a lo largo de una tira vertical completa, desde la parte superior a la parte inferior de un cubreobjetos y pasa a través del centro aproximado del cubreobjetos. Las imágenes individuales tenían cierta superposición (por ejemplo, 1.6 a 1.4 de un campo de imagen en la parte superior e inferior). Se utilizaron dos métodos para el análisis. En uno, se contaron las neuronas en la alternancia de imágenes para garantizar que las neuronas individuales no se contaron más de una vez. Los números resultantes se usaron para generar el gráfico de barras. En el segundo método, un solo montaje fue creado a partir de las imágenes individuales. Ellos fueron cosidos utilizando la imagen Microsoft Composite Editor o manualmente usando Photoshop. Los montajes también excluidos múltiples cargos de las mismas neuronas. Los números resultantes se enumeran arriba de las barras. En ambos métodos, se excluyeron las zonas de ancho en la periferia cubreobjetos que no contenían ninguna célula. Las células fueron contados como neuronas si tenían cuerpos celulares que parecían brillantespor microscopía de contraste de fase, así como los procesos celulares extendidos. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 12
Figura 12. Identificación inmunocitoquímica de tipos de células en cultivos neuronales. La condición de cultivo corresponde a la imagen inferior izquierda de la figura 8A. Las neuronas se obtuvieron de la región CA3-CA1 del hipocampo de ratones de tipo salvaje, y se sembraron en una capa alimentadora glial generada a partir de la región CA3-CA1 del hipocampo de ratas de tipo salvaje. Las células cultivadas se analizaron mediante inmunocitoquímica para el marcador neuronal MAP2, y la astrocytic glial GFAP marcador de células. Contraste de interferencia diferencial (DIC) de microscopía se utilizó para revelar la morfología general de los campos fotografiados, 14-17días después de las neuronas se sembraron en la capa alimentadora glial. tinción (A) de tres colores, incluyendo la contratinción con el marcador nuclear Hoechst 33342 tinte. Dos campos de imagen representativos se muestran. Tinción (B) dos colores, con diferentes combinaciones de anticuerpos secundarios conjugados con diferentes fluoróforos. En estos experimentos, las células cultivadas fueron fijadas con paraformaldehído al 4% y 4% de sacarosa en solución de Tyrode (que contiene, en mM: 125 NaCl, 2 KCl, 2 CaCl2, 2 MgCl2, 30 D-glucosa, 25 HEPES, pH 7,4 ajustado con NaOH 5 M, ~ 310 mOsm sin ajuste) durante 30 min a 4 ° C. Después de ser lavado con solución de Tyrode, que se permeabilizaron con 0,1% Triton X-100 en solución de Tyrode durante 10 min. Se lavaron de nuevo con solución de Tyrode y luego se bloquearon con 2% de suero de cabra normal en solución salina tamponada con fosfato (PBS) (solución de bloqueo) durante 60 min a TA. A partir de entonces fueron tratados con el poli conejoanticuerpo monoclonal anti-MAP2 (AB5622; 400x dilución en solución de bloqueo), y anticuerpo monoclonal de ratón anti-GFAP cóctel (NE1015; 1.000 x dilución) O / N (15-21 h) a 4 ° C. Después de lavados con PBS, las células se incubaron con anticuerpo de cabra anti-conejo y el anticuerpo IgG anti-ratón conjugado con Alexa Fluor 405 (500x de dilución en solución de bloqueo), Alexa Fluor 488 (1,000x) o Alexa Fluor 568 colorante (500x) para 60 min a TA. Se lavaron con PBS y se observaron directamente en PBS. En algunas culturas, después del lavado final en los procedimientos anteriores, las células fueron tratadas con Hoechst 33342 a 0,5 mg / ml en PBS durante 10 minutos a temperatura ambiente, y se lavaron con PBS antes de la observación. Por favor, haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 13
Figura 13. Immunocytochemical identificación de tipos de células en cultivos de capa de alimentación gliales. cultivos hermanos de las capas de alimentación gliales de rata como en la Figura 12, pero sin el recubrimiento de las neuronas de ratón. (A) tinción utilizando los procedimientos inmunocitoquímicos descritos en la Figura 12A. Dos campos de imagen representativos se muestran. (B) Tinción de la capa alimentadora glial utilizando los procedimientos inmunocitoquímicos descritos en A, pero con los anticuerpos primarios omitidos. Todas las imágenes MAP2 en las figuras 12A y 13A, B se adquirieron en las mismas condiciones de la imagen, y se muestran al mismo contraste de la imagen para permitir la comparación de la intensidad. Los mismos procedimientos se utilizaron para imágenes GFAP en las figuras 12A y 13A, B. La cultura capa alimentadora glial fue fotografiada en el mismo día que los cultivos en la Figura 12. Así, las capas de alimentación gliales en 13 se cultivaron in vitro para la misma cantidad de tiempo. Por favor, haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 14
Figura 14. La intensidad de la tinción inmunocitoquímica. Se trazaban líneas en las imágenes que se muestran en las figuras 12 y 13, y la intensidad a lo largo de estos se representaron. El recuadro muestra imágenes en la fila superior de la figura 12A. Las tres condiciones fueron: 1) de chapado de células de ratón (neuronas que contienen) en una capa de alimentación de rata y tinción con los anticuerpos primarios (neurona +, + glia, 1 ° Ab +), 2) capa alimentadora glial sólo (sin recubrimiento neuronal) y la tinción con los anticuerpos primarios (neurona -, glia +, 1 ° Ab +), y 3) la alimentación de la glíaer capa única (sin recubrimiento neuronal) y la tinción sin anticuerpos primarios (neurona -, + glia, 1 ° Ab -). Tinción neuronal (MAP2) estuvo presente sólo cuando las células de ratón se sembraron (condiciones 1 vs 2), y la tinción glial (GFAP) estuvo presente en ambos grupos de culturas (condiciones 1 vs 2). La tinción inmunocitoquímica fue específico a ambos anticuerpos primarios (condiciones 1 vs 3). Por favor, haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

SOLUCIONES
Tampón TAE (50x solución)
Base de Tris, 486 g
El ácido acético glacial, 114,2 ml
0,5 M EDTA, pH 8,0, 200 ml
Añada agua destilada para que el volumen total de 2 l
Make up en una campana de extracción química.
Diluir 50 veces antes de su uso.
Solución de Hanks
Las sales equilibrada de Hanks, sin cloruro de calcio, sulfato de magnesio y bicarbonato de sodio (para 1 L)
NaHCO 3, 350 mg (4,17 mM concentración final)
HEPES, 2,38 g (concentración final, 10 mM)
Ajustar a pH 7,4 usando NaOH 5 M.
Ajuste osmolaridad de 310 mOsm usando sacarosa (osmolaridad tiende a ~ 290 mOsm sin ningún ajuste).
Añada agua destilada para llevar el volumen total a 1 L
Solución de digestión (por tratamiento con tripsina de tejido cerebral)
NaCl, 800,6 mg (concentración final, 137 mM)
KCl, 37,3 mg (fconcentración inal, 5 mM)
Na 2 HPO 4 · (7H 2 O), 187,6 mg (concentración final, 7 mM)
HEPES, 595,8 mg (concentración final, 25 mM)
Glucosa, 97,3 mg (concentración final, 5,4 mM)
Ajustar a pH 7,2 usando NaOH 5 M.
Osmolaridad tiende a ~ 310 mOsm sin ningún ajuste.
Añada agua destilada para llevar el volumen total a 100 ml.
Justo antes del uso, añadir 20 mg de tripsina (concentración final de 10 mg / ml) y 20 l de DNasa (concentración final de 750 unidades / ml) a 2 ml de solución de digestión.
Solución de disociación (por disociación mecánica del tejido cerebral)
Solución de Hanks
MgSO 4 · (7H 2 O), 295,1 mg (concentrati definitivaen, 11,97 mM)
Ajuste osmolaridad de 310 mOsm usando sacarosa.
El volumen total es de 100 ml.
Justo antes del uso, añadir 20 l de DNasa (concentración final de 750 unidades / ml) a 2 ml de solución de disociación.
Plating medio-1 (para células gliales ratón)
Medio Eagle Modificado de Dulbecco (DMEM), 449,5 ml
MITO + Serum Extender, 0,5 ml
FBS, 50 ml
El volumen total es de 500 ml.
Plating medio-2 (para las neuronas de ratón)
Neurobasal-A, 485 ml
B27, 10 ml
GlutaMAX-I, 5 ml (concentración final, 2 mM)
El volumen total es de 500 ml.
Plating medio-3 (por neuronas de rata y células gliales)
Medios Esencial Mínimo (MEM, sin rojo fenol)
La glucosa, 2,5 g (concentración final, 27,8 mM)
NaHCO 3, 100 mg (concentración final, 2,38 mM)
Transferrina, 50 mg
FBS, 50 ml
GlutaMAX-I, 5 ml (concentración final, 2 mM)
La insulina, 12,5 mg
El volumen total es de 500 ml.
El medio de crecimiento (por neuronas de rata y células gliales)
MEM (sin rojo fenol)
La glucosa, 2,5 g (concentración final, 27,8 mM)
NaHCO 3, 100 mg (concentración final, 2,38 mM)
Transferrina, 50 mg
FBS,25 ml
GlutaMAX-I, 1,25 ml (concentración final, 0,5 mM)
B27 o NS21 {Chen, 2008 # 2399}, 10 ml
Β-D-arabinofuranósido de citosina (AraC), 0,56 mg (concentración final, 4 M)
El volumen total es de 500 ml.
Comentarios generales
Nuestros medios de cultivo no contienen antibióticos, ya que podrían ejercer efectos citotóxicos en las células cultivadas gliales y neuronas (referencia 70, 71). Esto hace que sea especialmente importante para adherirse a los procedimientos estériles en el trabajo relacionado con la cultura.
Consulte la tabla de Reactivos para las fuentes detalladas de los productos químicos.

Tabla 1. Soluciones

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Discussion

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El protocolo que aquí se presenta incluye procedimientos para tatuar etiquetar / identificar los ratones, para el genotipado de los ratones de cola consejos, y para el cultivo de neuronas del cerebro del ratón en baja densidad. En una ronda de experimentos utilizando 6-8 crías, estos procedimientos requieren típicamente ~ 0,5 h, ~ 4 horas y ~ 2 h, respectivamente, en un total de 07.06 h. Esto hace que sea práctico para un solo experimentador para completar todos los trámites necesarios desde el momento del nacimiento de los cachorros 'al forro de cultivos neuronales - en menos de un día de trabajo (con la excepción de la preparación previa de capas de alimentación gliales).

El tatuaje

Identificación a largo plazo de los animales es necesario para los fines de cría y los estudios científicos tales como análisis de la histología, la función de las células y el comportamiento animal. Tatuaje animales recién nacidos es ventajoso porque puede llevarse a cabo rápidamente y dura durante gran parte de la vida del animal 7,22-25. Tattooing en las almohadillas de las patas puede ser mejor que los pies de recorte 23 con respecto a la preservación de los comportamientos comprobables, por ejemplo, en suspensión o de agarre 22,26, aunque algunos estudios no han observado tales deficiencias (por ejemplo, 25). No hubo casos de madres que rechazan o canibalizar crías después de tatuar. Para otros métodos de identificación a largo plazo de los animales, ver los últimos comentarios 7,23,24.

Genotipado

Una característica crítica en nuestro protocolo es el uso de un método de genotipificación rápida. Aunque los métodos de genotipificación similares se describen en los informes anteriores (por ejemplo, 27,28), el sistema descrito aquí tiene al menos dos mejoras. En primer lugar, puede tolerar ciertas variaciones en la cantidad de tejido de partida, la edad de los animales, y la longitud de amplificación. Por lo tanto, la genotipificación éxito se puede lograr utilizando ratones tan jóvenes como de 1 día y tan antiguos como 6 meses de edad, y se puede llevar a cabo utilizando unamplia gama de pares de cebadores. En segundo lugar, este método no requiere una solución de parada para la etapa de extracción de ADN. Esto elimina la manipulación tubo excesiva y de pipeteado, y permite la automatización de múltiples tubos paralelos del proceso con una máquina de PCR. El número de muestras se puede escalar hacia arriba (por ejemplo, 96 muestras) aún procesa fácil y simultáneamente. También el tipo de muestra no se limita a los clips de la cola; otros tipos de muestras que podrían ser utilizados incluyen golpes de oído, recortes de dedo del pie, embriones tempranos enteros, y tejidos de la placenta 2-4,29,30. También se pueden usar diferentes especies animales. Así, los procedimientos de genotipado son fiables (repetible con baja variación intra-ensayo) y reproducible (baja variación inter-ensayo entre corridas o entre laboratorios), y tienen la ventaja de una alta escalabilidad.

Tenga en cuenta que se requiere una cierta prudencia para lograr la calidad esperada de los resultados. En primer lugar, durante la extracción de ADN, una gran variación en el protocolo puede degradar los resultados.Por ejemplo, una reducción significativa en el volumen de solución de extracción de ADN (por ejemplo, de 200 a 100 l en el paso 2.2) todavía permite el genotipado, pero puede reducir la fiabilidad y resultar en la variación en los resultados de PCR. Bajo tales condiciones, se recomienda para reducir el volumen del extracto de ADN de 4 a 2 l, y aumentar el volumen de H 2 O de 2 a 4 l para compensar el cambio de volumen durante las reacciones de PCR (paso 2.5). En segundo lugar, al final de la extracción de ADN, la solución se puede utilizar para PCR inmediatamente sin centrifugación en la mayoría de los casos, aunque la cola retendrá su estructura general y no se descompuso totalmente. Sin embargo, la inversión descrita de los tubos es esencial para el propósito de disociar el ADN genómico a partir del tejido (paso 2.4). También es importante utilizar la parte superior, la parte clara de la solución, con exclusión de los desechos en la parte inferior del tubo, debido a la inclusión de este último dará lugar a resultados de la PCR no concluyentes. Estospasos serán eficaces con un mínimo de tiempo y esfuerzo. Igualmente buenos resultados se pueden obtener por agitación activamente la muestra (en lugar de las inversiones) seguido por centrifugación y el uso del sobrenadante. En tercer lugar, después de la extracción de ADN, el ADN se puede almacenar durante largo plazo (por ejemplo,> dos semanas). Se recomienda centrifugar la solución utilizando una microcentrífuga (por ejemplo, 3,000-13,000 ga 4 ° C durante 2 min), la transferencia de los sobrenadantes a tubos nuevos, y almacenarlos a -80 ° C. Cuando el extracto de almacenado es para ser utilizado para el genotipado, centrifugar brevemente el espécimen después de la descongelación, y utilizar el sobrenadante.

Cultivos neuronales

Otra característica crítica de nuestro protocolo es el uso de una capa alimentadora glial para establecer cultivos neuronales a una densidad baja de chapado. Típicamente, en cultivos primarios de neuronas del cerebro de mamíferos, las células se sembraron con una densidad relativamente alta, sobre cubreobjetos recubiertos sin glial capa de alimentación (por ejemplo, 31-39). Cuando la densidad de placas de neuronas se reduce utilizando este método, la falta inicial de hoja glial conduce a un pobre crecimiento neuronal y la extensión dendríticas (paneles B, C en las figuras 8-10), como se informó anteriormente 40-42, probablemente debido a la mala glial 43,44 crecimiento.

, Cultivos neuronales de baja densidad exitosos pueden ser generados por al menos tres grandes tipos de métodos. En un enfoque, Neurobasal media se utiliza como un medio de cultivo. Esto hace que sea posible a las neuronas de cultivo en ausencia de una capa alimentadora glial, y se puede utilizar para baja densidad cultivos neuronales 45,46. En un segundo enfoque ("tipo Banker y su modificación), las células gliales son co-cultivadas con las neuronas en el mismo pozo, pero están físicamente separados de ellos. En este contexto, las células gliales proporcionan 'apoyo trófico "a las neuronas sin ponerse en contacto con ellos directamente1,41,42,47-49. En el tercer enfoque, las neuronas se cultivaron en una capa alimentadora glial pre-establecido que apoya el crecimiento neuronal (por ejemplo, 50-53) (Figuras 8-10). Específicamente, las neuronas del cerebro de ratón se cultivaron en una capa alimentadora glial preparado a partir de ratones o ratas 8,34,54 41,55,56.

Nosotros preferimos el último de los tres enfoques de la cultura de baja densidad, debido a que el Medio Neurobasal puede afectar a la supervivencia neuronal 57, las células gliales astrocíticos serán esenciales en la regulación de las funciones neuronales 8,58, y el contacto físico entre las neuronas y las células gliales puede estar importante. Los procedimientos para el cultivo de las células de ratón y de rata gliales son similares 59,60, pero los hemos modificado ligeramente para dar cabida a la más rápido crecimiento in vitro de ratas vs células gliales ratón. Los procedimientos para el cultivo de células de rata fueron modificados 61-63. El uso de un alimentador de Laye glialr para cultivos neuronales de baja densidad hace que sea necesario para llevar a cabo el genotipado rápido, con el fin de que coincida con el genotipo de la capa de alimentación a la de las neuronas dentro del período entre los nacimientos los cachorros y de las muertes neonatales o el final de la ventana de cultivo (1 -2 días después del parto).

Cultura de baja densidad en una capa alimentadora glial es también un método importante cuando se trata de neuronas de cultivo de pequeños núcleos en el cerebro (por ejemplo, el locus coeruleus de liberación de norepinefrina, y la sustancia nigra liberadoras de dopamina). Esos núcleos contienen sólo un pequeño número de neuronas y producirían inevitablemente culturas de baja densidad 64-67.

Los cultivos primarios se preparan habitualmente en nuestro laboratorio a partir de la región CA3-CA1 del hipocampo, la región motora de la corteza cerebral y el cuerpo estriado de los ratones. Los mismos procedimientos se pueden utilizar para preparar cultivos neuronales que representa otras regiones del cerebro, por ejemplo el conjunto hipocampo (including la circunvolución dentada) y toda la corteza cerebral. Neuronas de rata de regiones del cerebro tales como el hipocampo y el locus coeruleus se cultivan de manera similar, utilizando la capa alimentadora glial de rata. Estas neuronas cultivadas se utilizan por lo general en 1-4 semanas in vitro, con la edad exacta de la cultura dependiendo de la finalidad del experimento. Es de notar que algunas neuronas cultivadas en una capa alimentadora glial pueden sobrevivir durante más de 10 semanas 34,68.

Un problema potencial de cultivos neuronales de baja densidad es que las propiedades neuronales pueden ser diferentes de los que en cultivos de alta densidad o en las neuronas in situ. La comparación de estos sistemas ofrece una interesante oportunidad de estudiar cómo neuronal desarrollo y la maduración se ve afectada por múltiples factores, tales como la densidad neuronal, los factores solubles secretadas a partir de las neuronas, el contacto neurona a neurona, y las interacciones gliales neuronal.

En resumen, el tattooietiquetado del ratón basado en ng es de larga duración, el método de genotipificación es rápida, y el método de cultivo permite para el recubrimiento de las neuronas de ratón a baja densidad. El protocolo descrito aquí se puede aplicar en su totalidad a otras especies animales que albergan otras mutaciones genéticas. Además, los pasos individuales del protocolo se puede utilizar para otros fines. Así, el protocolo se puede utilizar en una amplia gama de aplicaciones basadas en las necesidades de los experimentadores.

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Materials

Name Company Catalog Number Comments
REAGENTS - tattooing
Machine Cleanser Animal Identification and Marking Systems, Inc. NMCR3 This is used to clean the needles and the holder after tattooing.
Machine Drying Agent Animal Identification and Marking Systems, Inc. NDAR4 This is used to dry the needles and holder after cleaning.
Neonate Tattoo Black Pigment Animal Identification and Marking Systems, Inc. NBP01
Skin Prep Applicator Animal Identification and Marking Systems, Inc. NSPA1 Q-tip.
Skin Prep solution Animal Identification and Marking Systems, Inc. NSP01 This reagent delivers a thin layer of oil that enhances the efficiency of tattooing and prevents tattoo fading, by (information from vendor): 1) preventing non-tattooed skin from being stained temporarily, thereby allowing the quality of a paw pad tattoo to be easily evaluated before the pup is returned to its home cage – the stained skin surface can be confused with the tattooed skin, 2) reducing skin damage during tattooing – softening the skin and lubricating the needle will help the needle penetrate the skin without causing skin damage, and 3) preventing molecular oxygen from entering the skin, thereby reducing inflammatory responses to reactive oxygen species that can be generated.
REAGENTS - genotyping
EZ Fast Tissue/Tail PCR Genotyping Kit (Strip Tube Format) EZ BioResearch LLC G2001-100
2X PCR Ready Mix II EZ BioResearch LLC G2001-100 A red, loading dye for electrophoresis is included in the 2X PCR Ready Mix solution.
Tissue Lysis Solution A EZ BioResearch LLC G2001-100 Prepare DNA Extraction Solution by mixing 20 µl of Tissue Lysis Solution A and 180 µl of Tissue Lysis Solution B per specimen.
Tissue Lysis Solution B EZ BioResearch LLC G2001-100 Prepare DNA Extraction Solution by mixing 20 µl of Tissue Lysis Solution A and 180 µl of Tissue Lysis Solution B per specimen.
Acetic acid, glacial VWR BDH 3092
Agarose optimized grade, molecular biology grade rpi A20090-500  We use 2% agarose gels in TAE buffer containing the SYBR Safe DNA gel stain (diluted 10,000-fold) or ethidium bromide (0.5 µg/ml gel volume).
Ethidium bromide Sigma-Aldrich E7637-1G
Ethylenediamine tetraacetic acid, disodium salt dihydrate (EDTA) Fisher BP120-500
Filtered Pipet Tips, Aerosol-Free, 0.1-10 µl Dot Scientific Inc UG104-96RS  Use pipette tips that are sterile and free of DNA, RNase and DNase. For all steps involving DNA, use filtered pipette tips to avoid cross-contamination.
Filtered Pipet Tips, Premium Fit Filter Tips, 0.5-20 µl Dot Scientific Inc UG2020-RS Use pipette tips that are sterile and free of DNA, RNase and DNase. For all steps involving DNA, use filtered pipette tips to avoid cross-contamination.
Filtered Pipet Tips, Premium Fit Filter Tips, 1-200 µl Dot Scientific Inc UG2812-RS Use pipette tips that are sterile and free of DNA, RNase and DNase. For all steps involving DNA, use filtered pipette tips to avoid cross-contamination.
Molecular weight marker, EZ DNA Even Ladders 100 bp EZ BioResearch LLC L1001 We use either of these three molecular weight markers.
Molecular weight marker, EZ DNA Even Ladders 1000 bp EZ BioResearch LLC L1010
Molecular weight marker, TrackIt, 100 bp DNA Ladder GIBCO-Invitrogen 10488-058
PCR tubes, 8-tube strips with individually attached dome top caps, natural, 0.2 ml  USA Scientific 1402-2900 Use tubes that are sterile and free of DNA, RNase and DNase. An 8-tube strip is easy to handle and to group the specimens than individual tubes.
PCR tubes, Ultraflux Individual  rpi 145660 Use tubes that are sterile and free of DNA, RNase and DNase.
Seal-Rite 0.5 ml microcentrifuge tube, natural USA Scientific 1605-0000 Use tubes that are sterile and free of DNA, RNase and DNase.
SYBR Safe DNA gel stain * 10,000x concentration in DMSO GIBCO-Invitrogen S33102
Tris base rpi T60040-1000
Primers for amplifying Tor1a gene in ΔE-torsinA knock-in mice 5'-AGT CTG TGG CTG GCT CTC CC-3' (forward) and 5'-CCT CAG GCT GCT CAC AAC CAC-3' (reverse) (reference 18). These primers were used at a final concentration of 1.0 ng/µl (~0.16 µM) (reference 2).
Primers for amplifying Tfap2a gene in wild-type mice 5'-GAA AGG TGT AGG CAG AAG TTT GTC AGG GC-3' (forward), 5'-CGT GTG GCT GTT GGG GTT GTT GCT GAG GTA-3' (reverse) for the 498-bp amplicon, 5'-CAC CCT ATC AGG GGA GGA CAA CTT TCG-3' (forward), 5'-AGA CAC TCG GGC TTT GGA GAT CAT TC-3' (reverse) for the 983-bp amplicon, and 5'-CAC CCT ATC AGG GGA GGA CAA CTT TCG-3' (forward), 5'-ACA GTG TAG TAA GGC AAA GCA AGG AG-3' (reverse) for the 1990-bp amplicon. These primers are used at 0.5 µM.
REAGENTS - cell culture
5-Fluoro-2′-deoxyuridine Sigma-Aldrich F0503-100MG See comments section of uridine for more information.
B-27 supplement GIBCO-Invitrogen 17504-044
Cell Culture Dishes 35 x 10 mm Dishes, Tissue Culture-treated BD falcon 353001
Cell Culture Flasks, T25, Tissue Culture-treated, Canted-neck, plug-seal cap, 25 cm2 Growth Area, 70 ml BD falcon 353082
Cell Culture Flasks, T75, Tissue Culture-treated, Canted-neck, vented cap, 75 cm2 Growth Area, 250 ml BD falcon 353136
Conical Tube, polypropylene, 15 ml BD falcon 352095
Countess (cell number counter) chamber slides GIBCO-Invitrogen C10312
Cytosine β-D-Arabinofuranoside hydrochloride (Ara-C hydrochloride) Sigma-Aldrich C6645-100mg
D-(+)-Glucose (Dextrose) anhydrous, SigmaUltra, 99.5% (GC) Sigma-Aldrich G7528-250G
Dish, Petri glass 100 x 15 mm Pyrex 3160-101
Distilled water GIBCO-Invitrogen 15230-147
DNase Type II Sigma-Aldrich D4527-200KU Stock solution is prepared at 1,500 units/20 μl = 75,000 units/ml in distilled water.
Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM), high glucose, GlutaMAX, pyruvate GIBCO-Invitrogen 10569-010, 500 ml
Fast PES Filter Unit, 250 ml, 50 mm diameter membrane, 0.2 µm Pore Size Nalgene 568-0020
Fast PES Filter Unit, 500 ml, 90 mm diameter membrane, 0.2 µm Pore Size Nalgene 569-0020
Fetal bovine serum (FBS) GIBCO-Invitrogen 26140-079
Glass coverslip, 12 mm Round, thickness 0.09–0.12 mm, No. 0 Carolina 633017
GlutaMAX-I GIBCO-Invitrogen 35050-061
Hanks' Balanced Salts Sigma-Aldrich H2387-10X
HEPES, ≥99.5% (titration) Sigma-Aldrich H3375-250G
Hydrochloric acid, 37%, A.C.S reagent Sigma-Aldrich 258148-100 ML
Insulin Sigma-Aldrich I5500-250 mg
Magnesium sulfate heptahydrate, MgSO4•(7H2O), BioUltra, ≥99.5% (Fluka) Sigma-Aldrich 63138-250G
Matrigel Basement Membrane Matrix solution, Phenol Red-Free BD Biosciences 356237 This is the coating material for coverslips and flasks. 1) To prepare it, thaw the Matrigel Basement Membrane Matrix solution on ice, which usually takes ~1 day. Using a pre-cooled pipette, aliquot the thawed solution into pre-cooled T25 flasks on ice, and store the flasks at -20 °C. To prepare the working Matrigel solution, thaw the aliquotted Matrigel in a flask on ice, dilute 50-fold by adding pre-cooled MEM solution and keep the diluted solution at 4 °C. It is important to pre-cool all cultureware and media that come into contact with Matrigel, except during and after the coating of coverslips, to prevent it from prematurely forming a gel. 2) To coat the glass coverslips or culture flasks with Matrigel, apply the Matrigel solution to the surface. Before plating cells, it is important to completely dry up the surface. For this purpose, it might be helpful to aspirate Matrigel during the cellular centrifugation immediately before plating the cells and to allow enough time for drying.
Minimum Essential Medium (MEM) GIBCO-Invitrogen 51200-038
MITO+ Serum Extender, 5 ml BD Biosciences 355006
Multiwell Plates, Tissue Culture-treated 24-well plate BD falcon 353047
Multiwell Plates, Tissue Culture-treated 6-well plate BD falcon 353046
Neurobasal-A Medium (1X), liquid GIBCO-Invitrogen 10888-022
Nitric Acid VWR bdh 3044
NS (Neuronal Supplement) 21  prepared in the lab Source: reference 69
Pasteur pipets, 5 ¾”  Fisher 13-678-6A Use this cotton-plugged 5 ¾” Pasteur pipette for cellular trituration. Fire-polish the tip beforehand to smooth the cut surface and to reduce the internal diameter to 50-80% of the original. Too small a tip will disrupt the cells and reduce cell viability, but too large a tip will decrease the efficiency of trituration.
Pasteur pipets, 9”  Fisher 13-678-6B
Potassium chloride (KCl), SigmaUltra, ≥99.0% Sigma-Aldrich P9333-500G
Serological pipet, 2 ml BD falcon 357507
Serological pipet, 5 ml  BD falcon 357543
Serological pipet, 10 ml BD falcon 357551
Serological pipet, 25 ml BD falcon 357525
Serological pipet, 50 ml  BD falcon 357550
Sodium bicarbonate (NaHCO3, Sodium hydrogen carbonate), SigmaUltra, ≥99.5% Sigma-Aldrich S6297-250G
Sodium chloride (NaCl), SigmaUltra, ≥99.5% Sigma-Aldrich S7653-250G
Sodium hydroxide (NaOH), pellets, 99.998% trace metals basis Sigma-Aldrich 480878-250G
Sodium phosphate dibasic heptahydrate (Na2HPO4•(7H2O)), ≥99.99%, Aldrich Sigma-Aldrich 431478-250G
Sucrose, SigmaUltra, ≥99.5% (GC) Sigma-Aldrich S7903-250G
Syringe filter, sterile, 0.2 µm Corning 431219
Syringe, 3 ml BD falcon 309585
Transferrin, Holo, bovine plasma Calbiochem 616420
Trypan Blue stain, 0.4% GIBCO-Invitrogen T10282 This is used for counting live/dead cells. Renew an old trypan blue solution if it is re-used many times (e.g. several times a week for several weeks), because it will form precipitates and result in erroneous readouts of cellular density.
Trypsin, type XI Sigma-Aldrich T1005-5G
Trypsin-EDTA solution, 0.25%  GIBCO-Invitrogen 25200-056
Uridine Sigma-Aldrich U3003-5G Stock solution is prepared at 50-mg 5-fluoro-2'-deoxyuridine and 125 mg uridine in 25 ml DMEM (8.12 and 20.48 mM, respectively).
REAGENTS - immunocytochemistry
Antibody, rabbit polyclonal anti-MAP2 Merck Millipore AB5622
Antibody, mouse monoclonal anti-GFAP cocktail Merck Millipore NE1015
EQUIPMENT - tattooing
AIMS Animal Identification and Marking Systems, Inc. NEO–9 This Neonate Rodent Tattooing System is an electric system that works by rapidly moving 1- or 3-point tattoo needles vertically into the skin. Activate the tattoo machine once for approximately 0.5 sec, while the tattoo needle tips are kept perpendicular to the skin surface. We prefer three-needle tattooing to maximize the tattooed area, but one-needle tattooing is effective on narrower areas, e.g. the toes, or if fine mechanical control is necessary, e.g. when numbers are tattooed. Two rounds of tattooing at the slowest speed (setting "1" out of 3 steps) are typically sufficient to produce a visible and long-lasting tattoo of the paw pads.
EQUIPMENT - genotyping
Electrophoresis system, horizontal, Wide Mini–Sub Cell GT BIO–RAD 170–4405 Typical electrophoresis parameters are electrical field strength at 6 V/cm and 25 min duration for a 10 cm gel.
FluorChem 8800 ProteinSimple FluorChem 8800
PCR, MJ Mini Thermal Cycler BIO-RAD PTC-1148EDU Our PCR reactions for the Tor1a gene in ΔE-torsinA knock-in mice are as follows: 1 cycle of denaturation at 94 °C for 3 min, 35 cycles of denaturation at 94 °C for 30 sec, annealing at 58 °C for 30 sec, extension at 72 °C for 2 min. This is followed by final extension at 72 °C for 10 min, and holding at 4 °C.
Power supply, PowerPac Basic BIO-RAD 164-5050
EQUIPMENT - cell culture
Automated cell counter, Countess GIBCO-Invitrogen C10310 This automated cell counter separately measures the densities of live and dead cells (non stained and stained by trypan blue, respectively). It is important to know the optimal range of density measurements: the counter that we use has the highest accuracy in the range from 1 x 105 to 4 x 106 cells/ml. If the measured cell density values fall outside the recommended range, adjust the resuspension volume appropriately.
Biological Safety Cabinet, Class II, Type A2 NUAIRE NU-425-400 This hood is used for all cell culture procedures, except for brain dissection.
CO2 Incubator, AutoFlow, Humidity Control Water Jacket NUAIRE NU-4850
Horizontal Clean Bench NUAIRE NU-201-330 This clean bench is used for brain dissection (steps 3.1.1 and 3.1.2 of "Brain Dissection and Cellular Dissociation)".
Orbit LS Low Speed Shaker Labnet S2030-LS-B
SORVALL RC-6 Plus Superspeed Centrifuge Fisher 46910 (centrifuge)/46922 (rotor)

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

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Rápido Genotipado de animales seguidas del establecimiento de cultivos primarios de neuronas cerebrales
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Koh, J. Y., Iwabuchi, S., Huang, Z., Harata, N. C. Rapid Genotyping of Animals Followed by Establishing Primary Cultures of Brain Neurons. J. Vis. Exp. (95), e51879, doi:10.3791/51879 (2015).More

Koh, J. Y., Iwabuchi, S., Huang, Z., Harata, N. C. Rapid Genotyping of Animals Followed by Establishing Primary Cultures of Brain Neurons. J. Vis. Exp. (95), e51879, doi:10.3791/51879 (2015).

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