Stably transgenic Hydra are made by microinjection of plasmid DNA into embryos followed by random genomic integration and asexual propagation to establish a uniform line. Transgenic Hydra are used to track cell movements, overexpress genes, study promoter function, or knock down gene expression using RNAi.
As a member of the phylum Cnidaria, the sister group to all bilaterians, Hydra can shed light on fundamental biological processes shared among multicellular animals. Hydra is used as a model for the study of regeneration, pattern formation, and stem cells. However, research efforts have been hampered by lack of a reliable method for gene perturbations to study molecular function. The development of transgenic methods has revitalized the study of Hydra biology1. Transgenic Hydra allow for the tracking of live cells, sorting to yield pure cell populations for biochemical analysis, manipulation of gene function by knockdown and over-expression, and analysis of promoter function. Plasmid DNA injected into early stage embryos randomly integrates into the genome early in development. This results in hatchlings that express transgenes in patches of tissue in one or more of the three lineages (ectodermal epithelial, endodermal epithelial, or interstitial). The success rate of obtaining a hatchling with transgenic tissue is between 10% and 20%. Asexual propagation of the transgenic hatchling is used to establish a uniformly transgenic line in a particular lineage. Generating transgenic Hydra is surprisingly simple and robust, and here we describe a protocol that can be easily implemented at low cost.
Hydra er blevet brugt til at studere regeneration, mønsterdannelse og stamceller til cirka 250 år 2 Hydra har en enkel kropsplan bestående af tre cellelinier:. Ektodermal epitel, endoderm epitel og interstitiel. Det rørformede legeme er dannet af ektodermal og endodermale epiteliale cellelinier, som hver er et enkelt cellelag. Alle de epiteliale celler i kroppen kolonnen er mitotisk. Når epitelceller forskydes i ekstremiteterne 3, hovedet (mund og fangarme) ved den mundtlige ende eller foden (basal disk) i aboral ende, de arrestere i G2-fasen af cellens cyklus og ændre celle skæbne 4. Cellerne i det interstitielle afstamning opholde sig mellemrummene mellem epitelceller. Denne slægt understøttes af multipotente stamceller, der er placeret i det ektodermale epitel lag af kroppen kolonne 5. De interstitielle stamceller giver anledning til tre somatiske cell typer (nerver, kirtel celler og nematocytes) og kønsceller 6,7.
Som medlem af phylum Cnidaria, søster gruppe til alle bilaterians kan Hydra kaste lys over de grundlæggende biologiske processer deles blandt flercellede dyr. Indtil for nylig blev disse bestræbelser hæmmes af manglen på pålidelige metoder til forstyrrelse af genfunktion. Men med udviklingen af transgene metode 1, er vi nu i stand til at drage fuld fordel af Hydra at få en bedre forståelse af de grundlæggende mekanismer er fælles for flercellede dyr, såsom stamceller funktion, regenerering og mønster. Transgene Hydra linjer er etableret ved injektion af plasmid DNA i embryoer, hvilket resulterer i tilfældig integration og kimære ekspression i en betydelig hyppighed af larver. En linje med ensartet udtryk i en bestemt slægt kan etableres ved ukønnet formering. Evnen til klonalt forplante transgENIC Hydra linjer er en fordel i forhold til flertallet af dyremodeller, som kan formeres kun ved seksuel reproduktion. Endvidere kan transgene celler spores let in vivo på grund af gennemsigtigheden af dyret og fraværet af endogene fluorescerende proteiner 8.
I de syv år, siden den første transgene Hydra linjer blev foretaget 1, sådanne linjer er blevet brugt til en lang række applikationer. Ekspression af fluorescerende proteiner i forskellige celletyper har gjort det muligt at spore celle bevægelse, observere ændringer i celleform og spore celleskæbner både vildtype betingelser og efter kemisk forstyrrelse 1,5,9-12. Desuden ekspressionen af forskellige fluorescerende proteiner i de forskellige afstamninger muliggør FACS isolering af specifikke cellepopulationer. Denne teknik er blevet anvendt til sekventering af stamceller specifikke mRNA og slægt-specifikke små RNA 13,14. Mens promotorenen af de to Hydra aktin gener har været mest udbredt, et par celletype-specifikke promotorer er blevet identificeret og anvendt til at drive ekspression af GFP i transgen Hydra 9,11,15,16. I fremtiden vil celletype-specifikke promotorer tillader observation og indsamling af en specifik celletype. Desuden blev en transgen tilgang med held anvendt til at definere de cis-virkende regulatoriske elementer af det Wnt3 promotoren 17.
Udviklingen af transgene metoder Hydra giver en robust metode til at teste funktionen af gener ved ektopisk ekspression, overekspression og knockdown. Transgene dyr er blevet gjort, som udtrykker fluorescens-mærkede proteiner for at undersøge både funktion og cellulær lokalisering 18-20. Hertil kommer, at ekspressionen af RNA-hårnåle i 3'UTR af GFP transgen fører til knockdown af målgener 21,22. I disse fremgangsmåder er påkrævet GFP at identificereog spore transgene væv under oprettelsen af den transgene linje. Det er imidlertid sandsynligt, at GFP-molekylet i nogle tilfælde ville interferere med funktionen af det mærkede protein. En nylig undersøgelse viser, at Hydra gener kan være anbragt i en operon-konfiguration, dvs er polycistroniske transkripter fremstillet, som derefter separeres ved trans-splejset leder tilsætning og oversat separat 23. Ved at placere et gen, der koder et protein eller et RNA hårnål i opstrøms position en operon og en fluorescerende protein-gen i den nedstrøms position, kan man spore transgene væv uden at mærke det gen der koder for proteinet eller RNA hårnål. Denne metode er blevet anvendt til at udtrykke en RNA hårnål i en operon konfiguration med DsRed2 for at opnå genet Knockdown 14.
Hydra rutinemæssigt gengiver ukønnet, men kræver miljømæssige stimuli at begynde at producere kønsceller. Disse stimuli ikke veldefineret for de fleste Hydra arter og kan afvige fra stamme til stamme. En væsentlig hindring for produktionen af transgene Hydra er at opnå embryoner på en regelmæssig basis, fordi det kan være svært i et laboratorium indstilling til at fremkalde Hydra at blive seksuelt. AEP-stamme 25, producerer imidlertid mælke let i laboratoriet, …
The authors have nothing to disclose.
Dette arbejde blev støttet af en G. Harold & Leila Y. Mathers Award til HL og en NIH tilskud (R24 GM080527) til RESCEJ var en NRSA postdoc (NIH F32GM9037222), og er i øjeblikket støttes af en mentored Forsker Udvikling Award fra National Institute on Aging (K01AG04435). Vi vil gerne takke de korrekturlæsere for nyttige kommentarer.
AEP Hydra Strain | NA | NA | Email: Celina Juliano at celina.juliano@yale.edu or Hiroshi Shimizu bubuchin2006@yahoo.co.jp |
High Speed Maxi Kit | Qiagen | 12662 | |
100 x 15 mm Petri Dishes | BD Falcon | 351029 | |
75 x 50 mm Glass Microscope Slide | Sigma | CLS294775X50 | |
Microinjection Fish Mold | IBI Scientific | FM-600 | |
Borosilicate Glass with Filament | Sutter Instrument | BF100-50-10 | O.D.: 1.0 mm, I.D.: 0.50 mm, 10 cm length |
Flaming/Brown Micropipette Puller | Sutter Instrument | P-97 | |
Phenol Red | Sigma | P3532 | |
Jewelers Forceps, Durmont #5 | Sigma | F6521 | |
Scalpel Blade #15 | Fisher | 50-822-421 | |
Mineral oil | Sigma | M8410-500ML | |
Microinjector | Narishige | IM-9B | |
Magnetic Stand | Narishige | GJ-1 | |
Iron Plate | Narishige | IP | |
Joystick Micromanipulator | Narishige | MN-151 |