Generasjon av transgene<em> Hydra</em> Av Embryo Mikroinjeksjon

Summary

Stably transgenic Hydra are made by microinjection of plasmid DNA into embryos followed by random genomic integration and asexual propagation to establish a uniform line. Transgenic Hydra are used to track cell movements, overexpress genes, study promoter function, or knock down gene expression using RNAi.

Abstract

As a member of the phylum Cnidaria, the sister group to all bilaterians, Hydra can shed light on fundamental biological processes shared among multicellular animals. Hydra is used as a model for the study of regeneration, pattern formation, and stem cells. However, research efforts have been hampered by lack of a reliable method for gene perturbations to study molecular function. The development of transgenic methods has revitalized the study of Hydra biology¹. Transgenic Hydra allow for the tracking of live cells, sorting to yield pure cell populations for biochemical analysis, manipulation of gene function by knockdown and over-expression, and analysis of promoter function. Plasmid DNA injected into early stage embryos randomly integrates into the genome early in development. This results in hatchlings that express transgenes in patches of tissue in one or more of the three lineages (ectodermal epithelial, endodermal epithelial, or interstitial). The success rate of obtaining a hatchling with transgenic tissue is between 10% and 20%. Asexual propagation of the transgenic hatchling is used to establish a uniformly transgenic line in a particular lineage. Generating transgenic Hydra is surprisingly simple and robust, and here we describe a protocol that can be easily implemented at low cost.

Introduction

Hydra har blitt brukt til å studere regenerering, mønsterdannelse, og stamceller i omtrent 250 år ² Hydra har et enkelt legeme plan som består av tre celleslektsnavn:. Ectodermal, endodermal epitelial epithelial og interstitiell. Det rørformede legeme er dannet av ectodermal og endodermal epitelceller i rett linje, hvor hver av disse er en enkeltcellelaget. Alle av de epiteliale celler i kroppen kolonnen er mitotisk. Når epitelceller blir forskjøvet inn i de ^tre ekstremiteter, hodet (munn og tentakler) ved oral ende eller foten (basalplate) ved aboral enden, de arrest i G2-fasen av cellesyklusen, og endrer celle skjebne ^4. Cellene i den interstitielle avstamning ligge innenfor mellomrommene mellom epitelcellene. Denne linjen er støttet av multipotente stamceller som er plassert i den ectodermal epitellaget av legemet kolonne ^5. De interstitielle stamceller gi opphav til tre somatisk celtyper l (nerver, kjertel celler, og nematocytes) og kjønnsceller ^6,7.

Som medlem av phylum Cnidaria, søstergruppe til alle bilaterians, kan Hydra belyse grunnleggende biologiske prosesser delte blant flercellede dyr. Inntil nylig, ble disse forsøk hindret av mangel på pålitelige metoder for endringen av genfunksjon. Men med utviklingen av transgene metodikk ^1, er vi nå i stand til å dra full nytte av Hydra å få en bedre forståelse av de grunnleggende mekanismene er felles for flercellede dyr, for eksempel stamcelle funksjon, gjenfødelse, og mønster. Transgen Hydra linjer etableres ved injeksjon av plasmid-DNA inn i embryo, noe som resulterer i tilfeldig integrasjon og chimeriske ekspresjon i en betydelig frekvens på unger. En linje med enhetlig uttrykk i en bestemt avstamning kan etableres ved aseksuell formering. Evnen til å clonally forplante transgenic Hydra linjer er en fordel i forhold til de fleste dyremodeller, noe som kan formeres bare av seksuell reproduksjon. I tillegg kan transgene celler spores lett in vivo på grunn av gjennomsiktigheten av dyret og fravær av endogene fluorescerende proteiner ^8.

I de sju årene siden den første transgene Hydra linjer ble gjort ^en, slike linjer har blitt brukt i en rekke applikasjoner. Uttrykk av fluorescerende proteiner i ulike celletyper har gjort det mulig å spore celle bevegelse, observere endringer i cellen form, og spore celle skjebner både i vill type forhold og etter kjemisk perturbation ^1,5,9-12. I tillegg, ekspresjon av forskjellige fluorescerende proteiner i de forskjellige linjene gjør det mulig for FACS isolering av spesifikke cellepopulasjoner. Denne teknikken har blitt benyttet for sekvensering av stem-cellespesifikke mRNA og ætt spesifikke RNAer små ^13,14. Mens promotoren aven av de to Hydra aktin gener blitt mest brukte, noen få celletypespesifikke arrangører har blitt identifisert og brukes til å drive uttrykk for GFP i transgen Hydra ^9,11,15,16. I fremtiden vil celle-typespesifikke arrangører tillate observasjon og innsamling av noe bestemt celletype. I tillegg ble en transgen tilnærming med hell brukes til å definere cis-virkende regulatoriske elementer i Wnt3 promoter ^17..

Utviklingen av transgene metoder i Hydra gir en robust tilnærming for å teste funksjonen av gener ved ektopisk uttrykk, overekspresjon, og knockdown. Transgene dyr har blitt gjort som uttrykker fluorescently-merket proteiner for å undersøke både funksjon og cellulær lokalisering ^18-20. I tillegg, ekspresjon av RNA hårnåler i 3'UTR av en GFP-transgenet fører til knockdown av målgener ^21,22. I disse metodene GFP er nødvendig for å identifisereog spore den transgene vev under opprettelsen av den transgene linjen. Imidlertid er det sannsynlig at i noen tilfeller GFP-molekyl ville forstyrre funksjonen til den kodede protein. En fersk studie viser at Hydra gener kan ordnes i et operon konfigurasjon, dvs. er polycistronic transkripsjoner laget, som deretter separert ved trans-skjøtes lederen tillegg og oversatt separat ^23. Ved å plassere et gen som koder for et protein eller et RNA hårnål i oppstrømsposisjon i et operon, og et fluorescerende protein-genet i den nedstrøms posisjon, kan en spore transgent vev uten å tagge genet som koder for protein eller RNA hårnål. Denne metoden har blitt brukt til å uttrykke en RNA hårnål i et operon konfigurasjon med DsRed2 for å oppnå genet knockdown ^14.

Protocol

1. Utarbeidelse av plasmid DNA, Needles, og injeksjon Retter Forbered plasmid DNA ved hjelp av en High Speed ​​Maxi eller Midi kit og konsentrere DNA til 2,5 mg / ml ved hjelp av etanol nedbør. DNA-pelleten oppløses i nukleasefritt deionisert vann. Oppbevar DNA i 10-20 mL alikvoter ved -20 ° C. (Se utfyllende tabell 1 for en liste over tilgjengelige vektorer) Gjør en injeksjon rett med agarose å konstruere et trau for å holde embryoer i en 100 x 15 mm petr…

Representative Results

Etablering av transgene Hydra linjer Mate transgene hatchlings hver 2-3 dager med Artemia nauplier. Hatchlings noen ganger ikke spise for en dag eller to etter klekking. Noen nye hatchlings vil aldri spise, og dermed vil ikke overleve. Dersom hatchling er transgene i enten ectodermal (figur 1A) eller endodermal epitelvev, tillater dyret å knopp og samle knopper som har den mest transgent vev (figur 1B, C). Fortsett å gjøre dette med de nye …

Discussion

Hydra reproduserer rutinemessig aseksuelt, men krever miljømessige stimuli for å begynne å produsere kjønnsceller. Disse stimuli er ikke godt definert for de fleste Hydra arter og kan avvike fra stamme til stamme. En betydelig hinder til produksjon av transgene Hydra er å skaffe embryoer på regelmessig basis, fordi det kan være vanskelig i et laboratorium setting for å indusere Hydra å bli seksuelt. Den AEP stammen ^25, men produserer kjønnscellene lett i laborator…

Materials

AEP Hydra Strain	NA	NA	Email: Celina Juliano at celina.juliano@yale.edu or Hiroshi Shimizu bubuchin2006@yahoo.co.jp
High Speed Maxi Kit	Qiagen	12662
100 x 15 mm Petri Dishes	BD Falcon	351029
75 x 50 mm Glass Microscope Slide	Sigma	CLS294775X50
Microinjection Fish Mold	IBI Scientific	FM-600
Borosilicate Glass with Filament	Sutter Instrument	BF100-50-10	O.D.: 1.0 mm, I.D.: 0.50 mm, 10 cm length
Flaming/Brown Micropipette Puller	Sutter Instrument	P-97
Phenol Red	Sigma	P3532
Jewelers Forceps, Durmont #5	Sigma	F6521
Scalpel Blade #15	Fisher	50-822-421
Mineral oil	Sigma	M8410-500ML
Microinjector	Narishige	IM-9B
Magnetic Stand	Narishige	GJ-1
Iron Plate	Narishige	IP
Joystick Micromanipulator	Narishige	MN-151