Создание трансгенных<em> Hydra</em> По эмбрионов микроинъекции
Summary
Stably transgenic Hydra are made by microinjection of plasmid DNA into embryos followed by random genomic integration and asexual propagation to establish a uniform line. Transgenic Hydra are used to track cell movements, overexpress genes, study promoter function, or knock down gene expression using RNAi.
Abstract
As a member of the phylum Cnidaria, the sister group to all bilaterians, Hydra can shed light on fundamental biological processes shared among multicellular animals. Hydra is used as a model for the study of regeneration, pattern formation, and stem cells. However, research efforts have been hampered by lack of a reliable method for gene perturbations to study molecular function. The development of transgenic methods has revitalized the study of Hydra biology1. Transgenic Hydra allow for the tracking of live cells, sorting to yield pure cell populations for biochemical analysis, manipulation of gene function by knockdown and over-expression, and analysis of promoter function. Plasmid DNA injected into early stage embryos randomly integrates into the genome early in development. This results in hatchlings that express transgenes in patches of tissue in one or more of the three lineages (ectodermal epithelial, endodermal epithelial, or interstitial). The success rate of obtaining a hatchling with transgenic tissue is between 10% and 20%. Asexual propagation of the transgenic hatchling is used to establish a uniformly transgenic line in a particular lineage. Generating transgenic Hydra is surprisingly simple and robust, and here we describe a protocol that can be easily implemented at low cost.
Introduction
Hydra был использован для изучения регенерации, образование паттерна, и стволовые клетки в течение примерно 250 лет 2 Hydra имеет простой план тела, состоящий из трех линиях клеток:. Эктодермального эпителиальные, эндодермального эпителиальных и интерстициальных. Трубчатый корпус образован эктодермального и энтодермальных эпителиальных линий, каждая из которых представляет собой один слой клеток. Все эпителиальных клеток в колонке тела являются митотический. Когда эпителиальные клетки смещаются в конечностях 3, глава (рот и щупальца) в полости рта конца или ноги (базальной) диска на спинной конце концов, они задержать в G2-фазе клеточного цикла и изменить судьбу клетки 4. Клетки линии интерстициального находятся в промежутках между эпителиальными клетками. Эта линия поддерживается мультипотентных стволовых клеток, которые расположены в эктодермальном эпителиального пласта колонны тела 5. Промежуточные стволовые клетки дают начало трем соматической сотовыхтипы л (нервы, железы клетки и nematocytes) и половые клетки 6,7.
Как член филюма Cnidaria, сестра группа для всех bilaterians, Гидра может пролить свет на фундаментальные биологические процессы разделены среди многоклеточных животных. До недавнего времени эти усилия не были препятствует отсутствие надежных методов возмущения функции гена. Тем не менее, с развитием трансгенных методологии 1, мы теперь в состоянии в полной мере воспользоваться Hydra, чтобы получить лучшее понимание основных механизмов, общих для многоклеточных животных, таких как функции стволовых клеток, регенерации, и кучность стрельбы. Трансгенные линии Hydra установлены путем инъекции плазмидной ДНК в эмбрионы, что приводит к случайной интеграции и экспрессии химерного в значительной частотой птенцов. Линии с равномерным экспрессии в конкретной линии может быть установлен бесполым распространения. Возможность клонально распространяться transgЕНИК Hydra линии является преимуществом по сравнению с большинством моделей животных, которые могут быть распространены только полового размножения. Кроме того, трансгенные клетки могут быть легко отслеживаются в естественных вследствие прозрачности животного и отсутствие эндогенного флуоресцирующих белков 8.
За семь лет с момента первых трансгенных линий Hydra были сделаны 1, такие линии были использованы для различных применений. Выражение флуоресцентных белков в различных типах клеток позволило отслеживать движение клетки, наблюдать за изменениями в форме клеток, а также отслеживать клеточные судьбы как в диких условиях типа и после химической возмущения 1,5,9-12. Кроме того, выражение различных флуоресцентных белков в различных линий позволяет FACS изоляции конкретных клеточных популяций. Эта техника была использована для секвенирования специфических мРНК стволовых клеток и клон-специфических малых РНК 13,14. В то время как промоутеродин из двух генов актина Hydra была наиболее широко используемым, а некоторые промоторы клеток типа были идентифицированы и использованы для управления экспрессией GFP в трансгенных Hydra 9,11,15,16. В будущем, промоторы клеток типа позволит для наблюдения и сбора любого конкретного типа клеток. Кроме того, трансгенные подход был успешно использован для определения цис-действующие регуляторные элементы промотора Wnt3 17.
Развитие трансгенных методов в Hydra обеспечивает надежную подход для проверки функции генов с помощью эктопической экспрессии, избыточная экспрессия и нокдаун. Трансгенные животные были сделаны, что выразить флуоресцентно-меченных белков с целью изучения как функцию и клеточную локализацию 18-20. Кроме того, выражение РНК шпильки в 3'-UTR о GFP трансгена приводит к нокдауна генов-мишеней 21,22. В этих подходов GFP, требуется, чтобы идентифицироватьи отслеживать трансгенной ткани при создании трансгенной линии. Тем не менее, вполне вероятно, что в некоторых случаях молекулы GFP будет мешать функции меченого белка. Недавнее исследование показывает, что Hydra гены могут быть расположены в конфигурации оперона, т.е. полицистронного транскрипты сделаны, которые затем разделяются транс-сплайсинга лидера того и переведены в отдельности 23. Размещая ген, кодирующий белок или РНК шпильку в верхнем положении оперона, и ген флуоресцентного белка в нижнем положении, то можно отслеживать трансгенной ткани без того, чтобы пометить гена, кодирующего белок или РНК шпильку. Этот метод был использован, чтобы выразить РНК шпильку в конфигурации оперона с DsRed2 для достижения ген нокдаун 14.
Protocol
Representative Results
Discussion
Гидра постоянно воспроизводит бесполым, но требует внешних стимулов, чтобы начать производить гаметы. Эти стимулы не хорошо определены для большинства видов Hydra и могут отличаться от штамма к штамму. Существенным препятствием к производству трансгенных Hydra является пол?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Эта работа была поддержана Г. Гарольд & Leila Y. Mathers премии к HL и гранта NIH (R24 GM080527) к RESCEJ был АЯРБ постдокторант (NIH F32GM9037222) и в настоящее время поддерживается наставником исследовательского премии Ученый развития из Национального институт по проблемам старения (K01AG04435). Мы хотели бы поблагодарить рецензентов за полезные замечания.
Materials
| AEP Hydra Strain | NA | NA | Email: Celina Juliano at celina.juliano@yale.edu or Hiroshi Shimizu bubuchin2006@yahoo.co.jp |
| High Speed Maxi Kit | Qiagen | 12662 | |
| 100 x 15 mm Petri Dishes | BD Falcon | 351029 | |
| 75 x 50 mm Glass Microscope Slide | Sigma | CLS294775X50 | |
| Microinjection Fish Mold | IBI Scientific | FM-600 | |
| Borosilicate Glass with Filament | Sutter Instrument | BF100-50-10 | O.D.: 1.0 mm, I.D.: 0.50 mm, 10 cm length |
| Flaming/Brown Micropipette Puller | Sutter Instrument | P-97 | |
| Phenol Red | Sigma | P3532 | |
| Jewelers Forceps, Durmont #5 | Sigma | F6521 | |
| Scalpel Blade #15 | Fisher | 50-822-421 | |
| Mineral oil | Sigma | M8410-500ML | |
| Microinjector | Narishige | IM-9B | |
| Magnetic Stand | Narishige | GJ-1 | |
| Iron Plate | Narishige | IP | |
| Joystick Micromanipulator | Narishige | MN-151 |
References
- Wittlieb, J., Khalturin, K., Lohmann, J. U., Anton-Erxleben, F., Bosch, T. C. Transgenic Hydra allow in vivo tracking of individual stem cells during morphogenesis. Proc Natl Acad Sci U S A. 103, 6208-6211 (2006).
- Glauber, K. M., Dana, C. E., Steele, R. E. Hydra. Curr Biol. 20, 964-965 (2010).
- Holstein, T. W., Hobmayer, E., David, C. N. Pattern of epithelial cell cycling in hydra. Dev Biol. 148, 602-611 (1991).
- Dubel, S., Hoffmeister, S. A., Schaller, H. C. Differentiation pathways of ectodermal epithelial cells in hydra. Differentiation. 35, 181-189 (1987).
- Khalturin, K., et al. Transgenic stem cells in Hydra reveal an early evolutionary origin for key elements controlling self-renewal and differentiation. Dev Biol. 309, 32-44 (2007).
- Bosch, T., David, C. Stem Cells of Hydra magnipapillata can differentiate into somatic cells and germ line cells. Dev Biol. 121, 182-191 (1987).
- David, C. N., Murphy, S. Characterization of interstitial stem cells in hydra by cloning. Dev Biol. 58, 372-383 (1977).
- Chapman, J. A., et al. The dynamic genome of Hydra. Nature. 464, 592-596 (2010).
- Boehm, A. M., Bosch, T. C. Migration of multipotent interstitial stem cells in Hydra. Zoology (Jena). 115, 275-282 (2012).
- Glauber, K. M., et al. A small molecule screen identifies a novel compound that induces a homeotic transformation in Hydra. Development. 140, 4788-4796 (2013).
- Siebert, S., Anton-Erxleben, F., Bosch, T. C. Cell type complexity in the basal metazoan Hydra is maintained by both stem cell based mechanisms and transdifferentiation. Dev Biol. 313, 13-24 (2008).
- Anton-Erxleben, F., Thomas, A., Wittlieb, J., Fraune, S., Bosch, T. C. Plasticity of epithelial cell shape in response to upstream signals: a whole-organism study using transgenic Hydra. Zoology (Jena). 112, 185-194 (2009).
- Hemmrich, G., et al. Molecular signatures of the three stem cell lineages in Hydra and the emergence of stem cell function at the base of multicellularity. Mol Biol Evol. , (2012).
- Juliano, C. E., et al. PIWI proteins and PIWI-interacting RNAs function in Hydra somatic stem cells. Proc Natl Acad Sci U S A. 111, 337-342 (2014).
- Nishimiya-Fujisawa, C., Kobayashi, S. Germline stem cells and sex determination in Hydra. Int J Dev Biol. 56, 499-508 (2012).
- Milde, S., et al. Characterization of taxonomically restricted genes in a phylum-restricted cell type. Genome Biol. 10, 8 (2009).
- Nakamura, Y., Tsiairis, C. D., Ozbek, S., Holstein, T. W. Autoregulatory and repressive inputs localize Hydra Wnt3 to the head organizer. Proc Natl Acad Sci U S A. 108, 9137-9142 (2011).
- Gee, L., et al. beta-catenin plays a central role in setting up the head organizer in hydra. Dev Biol. 340, 116-124 (2010).
- Fraune, S., et al. In an early branching metazoan, bacterial colonization of the embryo is controlled by maternal antimicrobial peptides. Proc Natl Acad Sci U S A. 107, 18067-18072 (2010).
- Bridge, D., et al. FoxO and stress responses in the cnidarian Hydra vulgaris. PLoS One. 5, e11686 (2010).
- Boehm, A. M., et al. FoxO is a critical regulator of stem cell maintenance in immortal Hydra. Proc Natl Acad Sci U S A. 109, 19697-19702 (2012).
- Franzenburg, S., et al. MyD88-deficient Hydra reveal an ancient function of TLR signaling in sensing bacterial colonizers. Proc Natl Acad Sci U S A. 109, 19374-19379 (2012).
- Dana, C. E., Glauber, K. M., Chan, T. A., Bridge, D. M., Steele, R. E. Incorporation of a horizontally transferred gene into an operon during cnidarian evolution. PLoS One. 7, e31643 (2012).
- Lenhoff, H. M., Lenhoff, H. M. . Hydra: Research Methods. , 29-34 (1983).
- Miller, M. A., Technau, U., Smith, K. M., Steele, R. E. Oocyte development in Hydra involves selection from competent precursor cells. Dev Biol. 224, 326-338 (2000).
- Lenhoff, H. M., Lenhoff, H. M. . Hydra: Research Methods. , 53-62 (1983).
