Luminescência Ressonância transferência de energia para estudar mudanças conformacionais na membrana proteínas expressas em células de mamíferos

Summary

Descrevemos aqui um método melhorado de transferência de luminescência Ressonância Energia (lRet) onde é considerado um local de clivagem da protease entre os locais fluoróforo doador e receptor. Esta modificação permite a obtenção de sinais lRet específicas decorrentes de proteínas de membrana de interesse, permitindo o estudo de proteínas de membrana, sem purificação de proteínas.

Abstract

Transferência de Energia de Ressonância de luminescência, ou lRet, é uma técnica poderosa usada para medir as distâncias entre dois locais em proteínas dentro da gama de distâncias de 10-100 Â. Ao medir as distâncias em várias condições de ligadura, alterações de conformação da proteína pode ser facilmente avaliada. Com lRet, um dos lantanídeos, térbio na maioria das vezes quelatados, é usado como o fluoróforo doador, proporcionando vantagens como uma vida mais apenas doadores de emissões, a flexibilidade de usar vários fluoróforos aceitador, ea oportunidade de detectar emissões aceitante sensibilizado como uma maneira fácil para medir a transferência de energia, sem o risco de também a detecção de sinal único doador. Aqui, nós descrevemos um método para usar em proteínas de membrana lRet expressas e ensaiadas na superfície de células de mamífero intactas. Nós introduzimos um site protease de clivagem entre o par fluoróforo lRet. Depois de obter o sinal de lRet inicial, a clivagem no local que remove o sinal lRet específica da proteína deinteresse que nos permite quantitativamente subtrair o sinal de fundo que permanece após a clivagem. Este método permite medições mais fisiologicamente relevante para ser feito sem a necessidade de purificação da proteína.

Introduction

Transferência de luminescência Ressonância Energia (lRet) é um derivado do conhecido Transferência de fluorescência Resonance Energia (FRET) técnica ^1. Semelhante a FRET, lRet pode ser usado para medir as distâncias e as alterações da distância entre dador e aceitador fluoróforos ligados a sítios específicos da proteína de interesse dentro do intervalo de 10-100 Â ^1-3. Os princípios da lRet também são semelhantes aos FRET em que a transferência de energia de ressonância ocorre entre dois fluoróforos proximais quando o espectro de emissão do fluoróforo dador sobrepõe-se com o espectro de absorção do fluoróforo aceitador. A eficiência de transferência este está relacionado com a distância entre os dois fluoróforos pela seguinte equação:

Eq. 1

onde R é a distância entre os dois fluoróforos, E é a eficiência de energy transferência, e R _0, discutida abaixo, é o raio de Förster para o par de fluoróforo, ou seja, a distância à qual a eficiência de transferência é metade do máximo. A partir desta equação, vê-se que a eficiência está relacionada com a grandeza da distância de elevado à sexta potência inversa ^1. É este sexto dependência da potência inversa que permite a FRET e medições lRet ser extremamente sensíveis, mesmo a pequenas alterações da distância quando perto do R ₀ do par de FRET. A capacidade para marcar especificamente locais desejados sobre as proteínas ou outras macromoléculas permite que se tire vantagem da presente sensibilidade para monitorizar as alterações conformacionais.

Quando comparado com FRET, que utiliza moléculas de corante orgânicos convencionais, lRet oferece vantagens adicionais. Em lRet, em vez de usar um corante orgânico como o fluoróforo dador, um catião série dos lantanídeos, tipicamente Tb ^{3 +} ou Eu3 ^+, é usado ^1,4-6. Fluoróforos que u caemnder esta categoria, por exemplo, térbio quelato, também são muito versáteis porque podem ser utilizados com uma grande variedade de aceitadores de fluoróforos. Esta flexibilidade é possível porque o espectro de emissão de lantanídeos quelados conter vários picos de emissão cortantes, permitindo por uma única espécie de fluoróforo dador a ser utilizado com uma de uma grande variedade de aceitadores de fluoróforos. Assim, a emissão aceitante sensibilizados pode ser detectado sem qualquer medo de contaminar bleed-through a partir de doador de emissão ^5. O experimentador selecciona o receptor específico com base na distância esperada entre os dois fluoróforos (Figura 1 e Tabela 1). Nestes fluoróforos lantanídeos quelados, o ião de metal é quelado por uma molécula que contém um grupo de antena que sensibiliza o lantanídeo normalmente mal-absorção de excitação, bem como um grupo funcional bioreactive para amarrar o ião de um grupo funcional específico da macromolécula ^{1, 5,6.} Once animado, lantanídeos relaxar ao estado fundamental através da liberação de fótons com uma taxa de decaimento no intervalo de milissegundos. Porque a decadência não é nem um relaxamento singlet-a-camisola nem um relaxamento trio-to-atómico, a emissão de fótons não podem ser propriamente chamado de fluorescência ou fosforescência, mas é mais apropriadamente denominado luminescência ^1. O tempo de decaimento de luminescência dos lantanídeos ajuda muito nas medições ao longo da vida. Lifetime medições podem então ser utilizados para determinar a eficiência por meio da seguinte relação:

Eq. 2

onde E é a eficiência de transferência, τ _D é o tempo de vida do doador (lantanídeos quelados) quando não participam na transferência de energia, e τ _DA é o tempo de vida do doador ao participar na transferência de energia com o aceitador. Com lRet, τ _DA pode alassim ser medido como o tempo de vida da emissão aceitante sensibilizado porque a vida de térbio é muito maior do que um fluoróforo receptor orgânica. O receptor emite com o mesmo tempo de vida como incitar excitação (lantanídeos doador), e qualquer contribuição para a vida da própria vida de fluorescência intrínseca do receptor é relativamente insignificante. Ao medir a emissão sensibilizados ao invés de emissão de dador, que também eliminam a necessidade de assegurar a rotulagem em exactamente uma razão de 1: 1 de doador de aceitador. A proteína pode ser, em vez identificada simultaneamente com ambos aceitador e dador fluoróforos. A população heterogênea marcado resultará, mas proteínas marcadas duplo doadores não emite no comprimento de onda aceitante e proteínas marcadas duplo aceitador não vai ser animado. Além disso, a distância entre os fluoróforos deve ser a mesma, independentemente do local de cisteína um dado fluoróforo anexa, especialmente quando se utiliza os lantanídeos isotrópicas como um doador, de modo que o need para especificar um determinado local para receber tanto o dador ou aceitador é desnecessária. Intensidade pode ser afectada com uma população heterogénea, mas deve ainda ser mais do que suficiente para ser detectado.

Ao planear experiências, a escolha dos fluoróforos deverá ser ditada pelo valor do par R _0, bem como o intervalo esperado distância a ser medida. O valor de R ₀ é definido pela seguinte equação:

Eq. 3

onde, R ₀ é o raio de Förster em Angstroms, κ ² é o factor de orientação entre os dois corantes (geralmente assumido ser 2/3), φ _D é o rendimento quântico do dador, J é a sobreposição espectral entre o dador integrante do espectro de emissão e espectro de absorção do aceitador em M ^{– 1}cm ^-1 nm ^4, e n é o índice de refracção do meio ^1.

O nosso laboratório adicionou-se uma modificação da técnica de lRet convencional por introdução de um local de reconhecimento para proteases entre os locais dador e aceitador de etiqueta na proteína a ser sondada. Esta modificação permite a investigação em sistemas não-purificadas, tais como células de mamíferos inteiros ^7. Esta técnica é particularmente útil quando se usa cisteína como locais de etiquetagem, uma vez que no processo de marcação com corantes de maleimida-conjugados que se ligam aos grupos sulfidrilo de cisteína, outras proteínas nas células que possuem cisteínas também são etiquetados. No entanto, através da inclusão de locais de clivagem de protease na protea de interesse e medir tempos de vida, antes e após a clivagem, o experimentador pode quantitativamente subtrair o sinal de fundo, depois de clivagem de protease a partir do sinal bruto. Esta subtracção isola o sinal específico proveniente da proteína de interesse (Figure 2). Usando a modificação acima descrita, lRet pode ser usado para medir as variações de distância entre o dador e o quelato térbio sonda aceitador numa proteína, e assim acompanhar as alterações de conformação no estado fisiológico perto da proteína sem a necessidade de purificação.

Figura 1.O espectros de absorção e emissão de térbio quelatado em preto, bem como um aceitador representativo, Alexa 488, em vermelho. Note os diversos picos de emissão e a gama de emissão afiado, estreita para cada pico de quelato térbio. Este padrão permite térbio para ser usado com uma variedade de fluoróforos aceitadores e facilita a medição da emissão de sensibilizado dentro daquelas gamas onde térbio mostra nenhuma emissão. Pico de emissão de 486 nm em Térbio sobrepõe bastante bem com o um pico bsorption de Alexa 488, permitindo a transferência de energia de ressonância de ocorrer entre os dois fluoróforos. Um comprimento de onda de 515 nm é uma excelente escolha para detectar emissão sensibilizado para este par, pois é no vale entre os picos de emissão de térbio, e muito perto Alexa 488 do pico de emissão de 520 nm. Note-se que estar próximo do pico aceitador, embora desejável, não é necessário-565 nm, ainda é capaz de detectar a Alexa 488, sem emissão também a detecção de emissão de térbio.

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Aceitador Fluoróforo	R 0 (Å)	Comprimento de onda de emissão (nm)
Atto 465	36
Fluorescein	45	515
Alexa 488	46	515
Alexa 680	52	700
Alexa 594	53	630
Alexa 555	65	565
Cy3	65	575

Tabela 1 uma lista de fluoróforos aceitadores geralmente usados ​​para lRet usando quelato térbio como dador ^11. Os R ₀ valores foram medidos quando o doador e receptor foram anexados ao agonista domínio de ligação solúvel dos receptores AMPA. É ideal para medir o valor de R ₀ de novo para cada novo sistema a ser estudado.

Figura 2 Uma visão geral do método apresentado lRet. (A) do receptor de AMPA é uma proteína de membrana que sofre alterações conformacionais em cima de ligação ao ligando. O ligando-bi em forma de conchanding domínio está circulado em vermelho aqui. (B) O domínio de ligação ao ligando de AMPA não ligadas a proteína existe numa conformação aberta (esquerda). Quando ligada ao ligando de glutamato, a proteína é fechada em torno do seu ligando (direita). Ao colocar fluoróforos em locais de prova sobre a LBD, a natureza desta alteração conformacional pode ser vista como sendo a distância entre os fluoróforos, alterações que afectam, em seguida, a fluorescência vida. (C) Quando marcação das células inteiras, tanto a rotulagem de proteína de interesse, bem como as proteínas da membrana de fundo pode ocorrer (esquerda). Depois de clivagem de protease, o sinal lRet a partir da proteína de interesse irá desaparecer devido à libertação de um fragmento solúvel, deixando intacto o sinal de fundo (à direita). Este sinal de fundo pode ser subtraído a partir do sinal bruto.

Protocol

1 Criar a construção contendo a proteína de interesse Clonar o gene que expressa a proteína de interesse num vector adequado. Utilização de vectores como os da série pcDNA ou pRK5 como eles estão bem adaptados para a expressão em sistemas de mamífero, como as células CHO e HEK293. 2 Selecione os locais da proteína a ser identificada com o fluoróforos Escolha locais de etiquetagem que é capaz de reflectir as alterações conformacionais poss…

Representative Results

Uma medição lRet sucesso com um doador de lantanídeos devem ter um só doador vida no intervalo de tempo em milisegundos. O tempo de vida de emissão lRet sensibilizado para a proteína marcada com o dador e o aceitador será notavelmente mais curta, com um tempo de vida na gama de microsegundos após subtracção do fundo da Figura 3. Protease clivagem resulta num aumento do tempo de vida que deve tornar-se estável ao longo do tempo ( ou seja, já não mudar), demonstrando que a clivagem d…

Discussion

LRet é uma técnica poderosa que permite aos cientistas para medir as distâncias entre os domínios dentro de uma única proteína, bem como entre as subunidades de uma proteína multimérica. Como tal, lRet é bem adequado para examinar as alterações da conformação e da dinâmica de proteínas ou outras macromoléculas. O protocolo acima deve permitir que o laboratório devidamente equipado para testar facilmente suas hipóteses; no entanto, existem muitas fontes comuns de erro que podem flagelar o novo investiga…

Materials

Name of Reagent/ Equipment	Company	Catalog Number	Comments/Description
LanthaScreen Thiol Reactive Tb Chelate	Life Technologies	PV3579
Acceptor fluorophore-Fluorescein-5-Maleimide	Life Technologies	F-150	Choice of acceptor depends on the specific experiment
Acceptor fluorophore-Alexa Fluor 488 C5 Maleimide	Life Technologies	A-10254	Choice of acceptor depends on the specific experiment
Acceptor fluorophore-Alexa Fluor 555 C2 Maleimide	Life Technologies	A-20346	Choice of acceptor depends on the specific experiment
Acceptor fluorophore-Alexa Fluor 594 C5 Maleimide	Life Technologies	A-10256	Choice of acceptor depends on the specific experiment
Acceptor fluorophore-Alexa Fluor 680 C2 Maleimide	Life Technologies	A-20344	Choice of acceptor depends on the specific experiment
QuantaMaster 3-SS	Photon Technology International		Spectrofluorometer should have pulsed excitation with the ability to measure lifetimes in the ms range
FluoreScan 2.0	Photon Technology International		Data Acquisition Software used in manuscript. Software provided with fluorescence instrument.
Origin 8.6	OriginLab		Origin is the data analysis software used in protocol. Can use other similar data analysis software
Quartz Cuvette	Starna Cells, Inc	3-Q-10
Stir Bar	Bel-Art Products	F37119-0007	Used in cuvette to keep cells in suspension. Can use any stir bar that fits the cuvette