Summary

В режиме реального времени изображений аксонов транспорта квантовой точке меченных BDNF в первичных нейронах

Published: September 15, 2014
doi:

Summary

Аксонов транспорт BDNF, нейротрофического фактора, имеет решающее значение для выживания и функции нескольких нейронных популяций. Некоторые дегенеративные заболевания отмечены нарушения аксонов структуры и функции. Мы продемонстрировали методы, используемые для изучения живой торговлей QD-BDNF в микрофлюидных камер с использованием первичных нейронов.

Abstract

BDNF играет важную роль в нескольких аспектах выживание нейронов, дифференцировку и функции. Структурные и функциональные дефициты в аксонов все чаще рассматриваются в качестве раннего признака нейродегенеративных заболеваний, включая болезнь Альцгеймера (БА) и болезнь Хантингтона (HD). Пока неясно, является механизм (ы), по которому аксональное повреждение индуцируется. Мы сообщили о разработке нового методического производить биологически активные, monobiotinylated BDNF (mBtBDNF), которые могут быть использованы для отслеживания аксонов транспорт BDNF. Квантовая точка меченных BDNF (QD-BDNF) было произведено сопряжением квантовую точку 655 до mBtBDNF. Микрожидкостных устройство используется для изоляции аксонов от нейрона клеточных тел. Добавление QD-BDNF в аксонов отсеке допускаются Живая съемка BDNF транспорта в аксонов. Мы показали, что КТ-BDNF переехал существу исключительно ретроградно, с очень немногими пауз, по движущейся скорости около 1,06 мкм / сек. Эта система может быть использована для исследования мнеchanisms из разрушенного аксонов функции в AD или HD, а также других дегенеративных заболеваний.

Introduction

Нейроны очень поляризован ячейки, долго и часто весьма подробно процессы являются основой для установления и поддержания структуры и функции нейронных цепей. Аксон играет жизненно важную роль в перевозке грузов в и из синапсов. Белки и органеллы, синтезированные в клетке сомы необходимо транспортировать через аксонов, чтобы достичь пресинаптического терминала для поддержки функции нейронов. Соответственно, сигналы, полученные в дистальных аксоны должны быть трансдуцировали и передал сомы. Эти процессы имеют важное значение для жизнеспособности нейронов, дифференциации и технического обслуживания. В том, что аксонального транспорта в некоторых нейронов должна быть проведена через расстояния более 1000 раз больше диаметра тела клетки, возможность легко Предполагается, что даже незначительный дефицит может заметно повлиять нейронов и схемы функцию.

Головного мозга нейротрофический фактор (BDNF), член нейротрофина семейства факторов роста, присутствует в мАNY области мозга, в том числе гиппокампа, коры головного мозга, и базальных отделах переднего мозга. BDNF играет решающую роль в формировании познания и памяти, поддерживая выживание, дифференциацию и функцию нейронов, которые участвуют в познавательных схем. BDNF связывается со своим рецептором, в тирозин-киназы TrkB, в аксона, где он активирует TrkB-опосредованного пути передачи сигналов, включая митоген активированной протеинкиназы / внеклеточной регулируемой протеинкиназы (МАРК / ERK), фосфатидилинозитол-3-киназы (PI3K) и фосфолипаза С-гамма (PLCγ). Белки, которые участвуют в этих сигнальных путей упакованы на эндоцитотических везикулярного структур для формирования BDNF / TrkB эндосомы 1-6, которые затем ретроградно транспортируется к нейронов сомы сигнализации.

Микрожидкостных культура камера представляет собой очень удобную платформу для изучения аксонов биологию в нормальных условиях, а также при установлении травм и болезней, 7,8. По изолирующих аксоновот клеточных тел, устройство позволило изучить транспорт специально в аксонов 8-10. В основе PDMS микрожидкостных платформы с 450 мкм Microgroove барьеров, используемых в данном исследовании были коммерчески купил (см таблицу материалы). Чтобы изучить BDNF транспорт, мы разработали новую технологию для производства monobiotinylated BDNF (mBtBDNF). Мы воспользовались биотин акцепторной пептида, AP (также известный как AviTag). Это последовательность кислоты в 15 аминокислотных который содержит остаток лизина, которые могут быть специально лигировали с биотином по кишечной палочки фермент, биотин-лигазы, Бира. Мы слиты с AviTag к С-концу мыши предварительно proBDNF кДНК с помощью ПЦР (фиг.1А). Конструкцию клонировали в экспрессирующий вектор млекопитающих, pcDNA3.1 MYC-вектора его. Мы также клонировали бактериальную ДНК Бира в pcDNA3.1 Мус-его вектора. Два плазмиды временно совместно трансфицировали в клетки HEK293FT выразить как белки. Бира катализирует перевязка БиоВ частности, в лизина находятся в пределах AviTag на С-конце ФРГМ в соотношении 1: 1, с получением monobiotinylated BDNF мономера. Биотинилированное, зрелые BDNF с молекулярной массой ~ 18 кДа был восстановлен и очищен от СМИ с использованием Ni-смолу (Рисунок 1в). Биотинилирование BDNF была завершена, о чем судили по невозможности обнаружить без изменений BDNF с помощью иммуноблоттинга (Фигура 1D). Стрептавидином сопряженных квантовых точек, QD 655, были использованы для обозначения mBtBDNF сделать КТ-BDNF. Наличие AviTag не вмешиваться в деятельность BDNF как mBtBDNF смог активировать фосфорилированную TrkB (Рисунок 1E) и стимулировать рост аксонов (Рисунок 1F) в той мере, рекомбинантного человеческого BDNF (rhBDNF). Иммуноокрашивание показали, что КТ-BDNF локализуется с TrkB в гиппокампа аксонов, указывая, что QD-BDNF является биологически активным (Рисунок 1G). Для изучения BDNF транспорта, КТ-ФРГМ был добавлен в дистальном отделе аксоновмикрофлюидных культуры, содержащие крысы E18 нейронов гиппокампа (рисунок 2А). QD-BDNF ретроградного транспорта в аксонов был захвачен в реальном времени живого изображения красной флуоресцентной метки (Поддержка видео S1, S2). Анализируя кимографе сгенерированный, QD-BDNF наблюдалось транспортировать ретроградно по движущейся скорости около 1,06 мкм / сек (Рисунок 3А). GFP или mCherry-меченый BDNF были использованы для отслеживания аксонов движение BDNF. Основные недостатки в том, что они не являются достаточно ярким для единичных исследований молекул. Кроме того, присутствие обоих антероградной и ретроградных движений BDNF делает его трудно оценить, был ли ретроградно транспортируется BDNF в комплексе нейротрофин / рецептор.

В этом видео мы продемонстрируем методы, используемые для изучения живой торговлей QD-BDNF в микрофлюидных камер с использованием первичных нейронов. Ultrabrightness и отлично фотостабильность квантовых точек макES можно выполнять долгосрочное отслеживание BDNF транспорта. Эти методы могут быть использованы для повышения исследования аксонов функции в AD, HD, и других нейродегенеративных расстройств.

Protocol

Хирургические и животных процедуры проводятся строго в соответствии с Руководством NIH по уходу и использованию лабораторных животных. Все эксперименты, связанные с использованием животных утверждаются UCSD Уходу за животными и использованию комитета. 1 плазмиды Клониров…

Representative Results

Получение и очистка биологически активных моно-биотинилированного BDNF Вектор экспрессии BDNF слиты с последовательностью AviTag (GGGLNDIFEAQKIEWHE) был создан в соответствии с ранее опубликованным протоколом 10. Молекулярная масса белка полной длины гибридного было предсказа?…

Discussion

В этом исследовании, мы сообщают о разработке нового методического производить биологически активные, monobiotinylated BDNF (mBtBDNF), который может использоваться, чтобы отследить аксонов транспорт BDNF. По конъюгации белка в квантовой точки стрептавидином, и с использованием микрожидкостных камер…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Мы хотели бы поблагодарить Юэ (Полин) Ху, Рэйчел Sinit для их технической помощи. Работа выполнена при поддержке гранта NIH (PN2 EY016525) и при финансовой синдромом Дауна исследований и лечения фонда и Ларри Л. Hillblom фонда.

Materials

Name Company Catalog Number
Platinum pfx DNA polymerase  Invitrogen 11708021
EcoRI  Fermentas FD0274
BamHI  Fermentas FD0054
HEK293FT cells Invitrogen R70007
DMEM-high glucose media Mediatech 10-013-CV
d-biotin  Sigma B4639
TurboFect  Fermentas R0531
PMSF   Sigma P7626
aprotinin Sigma A6279
Ni-NTA resins Qiagen 30250
protease inhibitors cocktail Sigma  S8820
silver staining kit  G-Biosciences 786-30
human recombinant BDNF Genentech
Microfluidic chambers Xona SND450
24×40 mm No. 1 glass coverslips  VWR 48393-060
poly-L-Lysine  Cultrex 3438-100-01
HBSS Gibco 14185-052
DNase I Roche 10104159001
Trypsin Gibco 15090-046
Neurobasal  Gibco 21103-049
FBS  Invitrogen 16000-044
GlutaMax  Invitrogen 35050-061
B27   Gibco 17504-044
QD655-streptavidin conjugates Invitrogen  Q10121MP
anti-Avi tag antibody GenScript A00674
streptavidin-agarose beads  Life Technology  SA100-04
trichloroacetic acid Sigma T6399
HRP-streptavidin  Thermo Scientific N100
anti-pTrkB antibody a generous gift from Dr M. Chao of NYU
anti-TrkB antibody BD Science 610101

References

  1. Wu, C., et al. A functional dynein-microtubule network is required for NGF signaling through the Rap1/MAPK pathway. Traffic. 8, 1503-1520 (2007).
  2. Wortzel, I., Seger, R. The ERK Cascade: Distinct Functions within Various Subcellular Organelles. Genes & cancer. 2, 195-209 (2011).
  3. Huang, E. J., Reichardt, L. F. Trk receptors: roles in neuronal signal transduction. Annual review of biochemistry. 72, 609-642 (2003).
  4. Nonomura, T., et al. Signaling pathways and survival effects of BDNF and NT-3 on cultured cerebellar granule cells. Brain research. Developmental brain research. 97, 42-50 (1996).
  5. Weissmiller, A. M., Wu, C. Current advances in using neurotrophic factors to treat neurodegenerative disorders. Translational neurodegeneration. 1, 14 (2012).
  6. Zhang, K., et al. Defective axonal transport of Rab7 GTPase results in dysregulated trophic signaling. The Journal of neuroscience : the official journal of the Society for Neuroscience. 33, 7451-7462 (2013).
  7. Taylor, A. M., et al. A microfluidic culture platform for CNS axonal injury, regeneration and transport. Nature methods. 2, 599-605 (2005).
  8. Cui, B., et al. One at a time, live tracking of NGF axonal transport using quantum dots. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 104, 13666-13671 (2007).
  9. Xie, W., Zhang, K., Cui, B. Functional characterization and axonal transport of quantum dot labeled BDNF. Integrative biology : quantitative biosciences from nano to macro. 4, 953-960 (2012).
  10. Sung, K., Maloney, M. T., Yang, J., Wu, C. A novel method for producing mono-biotinylated, biologically active neurotrophic factors: an essential reagent for single molecule study of axonal transport. Journal of neuroscience methods. 200, 121-128 (2011).
  11. Tani, T., et al. Trafficking of a ligand-receptor complex on the growth cones as an essential step for the uptake of nerve growth factor at the distal end of the axon: a single-molecule analysis. The Journal of neuroscience : the official journal of the Society for Neuroscience. 25, 2181-2191 (2005).
  12. Bronfman, F. C., Tcherpakov, M., Jovin, T. M., Fainzilber, M. Ligand-induced internalization of the p75 neurotrophin receptor: a slow route to the signaling endosome. The Journal of neuroscience : the official journal of the Society for Neuroscience. 23, 3209-3220 (2003).
  13. Kruttgen, A., Heymach, J. V., Kahle, P. J., Shooter, E. M. The role of the nerve growth factor carboxyl terminus in receptor binding and conformational stability. The Journal of biological chemistry. 272, 29222-29228 (1997).
  14. Zuccato, C., Cattaneo, E. Brain-derived neurotrophic factor in neurodegenerative diseases. Nature reviews. Neurology. 5, 311-322 (2009).
  15. Gharami, K., Xie, Y., An, J. J., Tonegawa, S., Xu, B. Brain-derived neurotrophic factor over-expression in the forebrain ameliorates Huntington’s disease phenotypes in mice. Journal of neurochemistry. 105, 369-379 (2008).
  16. Gauthier, L. R., et al. Huntingtin controls neurotrophic support and survival of neurons by enhancing BDNF vesicular transport along microtubules. Cell. 118, 127-138 (2004).
  17. Her, L. S., Goldstein, L. S. Enhanced sensitivity of striatal neurons to axonal transport defects induced by mutant huntingtin. The Journal of neuroscience : the official journal of the Society for Neuroscience. 28, 13662-13672 (2008).
  18. Rong, J., et al. Regulation of intracellular trafficking of huntingtin-associated protein-1 is critical for TrkA protein levels and neurite outgrowth. The Journal of neuroscience : the official journal of the Society for Neuroscience. 26, 6019-6030 (2006).

Play Video

Cite This Article
Zhao, X., Zhou, Y., Weissmiller, A. M., Pearn, M. L., Mobley, W. C., Wu, C. Real-time Imaging of Axonal Transport of Quantum Dot-labeled BDNF in Primary Neurons. J. Vis. Exp. (91), e51899, doi:10.3791/51899 (2014).

View Video