Summary
BDNF, 신경 영양 인자의 축삭 수송은 여러 신경 인구의 생존과 기능을 위해 중요하다. 일부 퇴행성 질환은 축삭 구조와 기능의 장애로 표시됩니다. 우리는 차 신경 세포를 사용하여 미세 유체 챔버에서 QD-BDNF의 라이브 인신 매매를 검사하는 데 사용되는 기술을 보여 주었다.
Abstract
BDNF는 신경 세포의 생존, 분화 및 기능의 몇 가지 측면에서 중요한 역할을한다. 축색 돌기의 구조 및 기능 적자는 점점 알츠하이머 병 (AD)와 헌팅턴 병 (HD)을 포함한 신경 퇴행성 질환의 초기 기능으로 볼 수 있습니다. 아직까지 불분명 축삭 손상이 유발되는 메커니즘 (들)입니다. 우리는 생물학적 활성을 생산하는 신규 한 방법의 개발을보고, BDNF의 축삭 수송을 추적하는 데 사용될 수 BDNF (mBtBDNF)는 monobiotinylated. 양자점 표지 BDNF (QD-BDNF)가 mBtBDNF에 양자점 655 공역에 의해 제작되었다. 미세 유동 장치는 신경 세포체에서 축삭을 분리하는데 사용되었다. 축삭 구획 QD-BDNF의 추가 축삭에서 BDNF 수송의 라이브 영상을 허용했다. 우리는 QD-BDNF는 약 1.06 μm의 / sec의 이동 속도에서 거의 일시 정지와 역행 본질적으로 독점적으로 이동 있음을 보여 주었다. 이 시스템은 저를 조사하는 데 사용할 수 있습니다AD 또는 HD에서 중단 축삭의 기능뿐만 아니라 다른 퇴행성 질환의 chanisms.
Introduction
신경 세포는 고도의 그 긴 종종 고도로 정교한 프로세스 확립 및 신경 회로의 구조와 기능을 유지하기위한 기본이되는 셀을 편광된다. 축삭과 시냅스에서화물을 운반하는 중요한 역할을한다. 소마 세포에서 합성 된 단백질은 신경 세포 소기관 및 기능을 지원하는 시냅스 전 말단에 도달하는 축삭을 통해 전송 될 필요가있다. 대응하여, 신호는 말단 축색 돌기가 형질 도입 될 필요가 수신 및 소마로 반송. 이러한 프로세스는 신경 세포의 생존, 분화 및 유지 관리에 필수적이다. 일부 신경 축삭에서 그 전송을 통해 거리보다 1000 배 세포체의 직경을 수행해야에서 가능성 용이 심지어 작은 결손이 현저하고 신경 회로 기능에 영향을 미칠 수 있다는 것을 구상한다.
뇌 유래 신경 영양 인자 (BDNF), 성장 인자의 뉴로 트로 가족의 일원은, 엄마의 존재해마, 대뇌 피질과 기저 전뇌를 포함하여 뉴욕의 뇌 영역. BDNF는인지 회로에 참여하는 신경 세포의 생존, 분화 및 기능을 지원하여인지와 기억 형성에 중요한 역할을한다. BDNF는 그것이 미토 겐 활성화 단백질 키나아제 / 세포 외 신호 - 조절 된 단백질 키나제 (MAPK / ERK), 포스파티딜 이노시톨 3 - 키나제 포함 TrkB-매개 신호 전달 경로를 활성화 축삭 말단, 수용체, 티로신 키나아제 TrkB에 바인딩 (PI3K) 및 포스 포 리파제 C-감마 (PLCγ). 이러한 신호 전달 경로에 참여하는 단백질은 다음 역행 신경 소마로 이송하는 엔도 좀 1-6 신호 BDNF / TrkB를 형성하는 세포 내 이입 기공 구조에 포장됩니다.
마이크로 유체 문화 실 정상 조건에서뿐만 아니라 부상과 질병 7,8의 설정에서 축삭 생물학 연구를위한 매우 유용한 플랫폼이다. 분리 축삭으로세포 기관에서, 장치는 축삭 8-10에 구체적으로 교통을 연구하는 일을 허용했다. 본 연구에 사용 된 450 μm의 마이크로 그루브 장벽 PDMS 기반의 미세 유체 플랫폼은 상용 (재료 표 참조)을 구입 하였다. BDNF 전송을 조사하기 위해, 우리는 monobiotinylated BDNF (mBtBDNF)를 생산하는 새로운 기술을 개발했다. 우리는 (또한 AviTag라고도 함) 비오틴 수용체 펩타이드, AP를 이용했다. 그것은 특히 대장균 효소 리가 비오틴, 피라 의해 바이오틴에 결찰 될 수 리신 잔기를 포함하는 15 개의 아미노산 서열이다. 우리는 PCR (도 1a)에 의해 마우스 cDNA를 미리 proBDNF의 C-말단에 융합 AviTag. 구조체는 포유류 발현 벡터, 한 pcDNA3.1-myc의 자기 벡터에 클로닝 하였다. 또한 한 pcDNA3.1-myc의 자기 벡터에 피라 세균의 DNA를 클로닝. 두 플라스미드 모두 단백질을 일시적으로 발현하는 HEK293FT 세포로 공동 - 형질 감염시켰다. 피라는 비오의 결찰 촉매특히 라이신이 일에서 BDNF의 C-말단에 AviTag 내에 상주에서 : 1의 비율로 BDNF의 단량체를 monobiotinylated 생성한다. 비오틴은 ~ 18 kDa의 분자량의 BDNF와 성숙 회수 및 Ni-수지 (도 1C)를 사용하여 미디어에서 정제 하였다. (그림 1D)를 발현 수준에 의해 수정되지 않은 BDNF 감지 할 수없는 심판으로 BDNF의 바이오 티 닐화는 완전했다. 스트렙 타비 딘 결합 된 양자점, QD 655는 QD-BDNF를 만들기 위해 mBtBDNF 라벨을 사용 하였다. mBtBDNF이 인산화 TrkB (그림 1E)를 활성화하고 재조합 인간 BDNF (rhBDNF)의 정도에 신경 돌기의 파생물 (그림 1 층)을 자극 할 수 있다는 AviTag의 존재는 BDNF의 활동을 방해하지 않았다. QD-BDNF는 QD-BDNF는 생리 활성 (그림 1G) 인 것을 나타내는, 해마 축삭에서 TrkB와 colocalized 것으로 나타 면역 염색. BDNF 전송을 연구하기 위해, QD-BDNF는 원위부 축삭 구획에 추가쥐 E18 해마 신경 세포 (그림 2A)를 포함하는 마이크로 유체 문화. 축삭 내 QD-BDNF 역행 전송은 적색 형광 태그 (지원 영상 S1, S2)의 실시간 라이브 영상에 의해 체포됐다. 생성 kymograph를 분석함으로써, QD-BDNF는 약 1.06 μM / 초 (도 3a)의 이동 속도로 역행 수송 될 것으로 관찰되었다. GFP 또는 mCherry - 태그 BDNF는 BDNF의 축삭 이동을 추적하는 데 사용되었다. 주요 단점은 단일 분자 연구에 충분히 밝은하지 수 있다는 점을들 수있다. 또한, 선행 성 모두와 역행 BDNF 움직임의 존재 어려운 역행 수송 BDNF는 뉴로 트로 / 수용체 복합체에 참여할지 여부를 평가하기 위해 만든다.
이 비디오에서는, 우리는 차 신경 세포를 사용하여 미세 유체 챔버에서 QD-BDNF의 라이브 인신 매매를 검사하는 데 사용되는 기술을 보여줍니다. ultrabrightness 및 양자점 살려 우수한 광 안정성에스 것이 가능 BDNF 수송의 장기 추적을 수행 할 수 있습니다. 이 기술은 AD, HD, 및 다른 신경 퇴행성 질환에서 축삭의 기능 연구를 향상시키기 위해 이용 될 수있다.
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Protocol
수술과 동물의 절차는 관리에 대한 NIH 지침 및 실험 동물의 사용에 따라 엄격하게 수행된다. 동물의 사용과 관련된 모든 실험은 UCSD 기관 동물 관리 및 사용위원회에 의해 승인됩니다.
1 플라스미드 복제, 모노 - 비오틴 BDNF의 발현과 정제 (mBtBDNF)
참고 : HEK293FT 셀 (10)의 한 pcDNA3.1 벡터와 같이 발현에 사전 proBDNFavi과 피라의 cDNA를 구축합니다. mBtBDNF 성숙 및 생물학적 활성 monobiotinylated 신경 성장 인자 (mBtNGF) (10)의 제조 이전에 발행 방법에있어서의 Ni-NTA 비드를 사용하여 정제 하였다.
미세 유체 챔버의 2 준비
신경 미세 배양 장치는 유체 적 신경 세포체에서 축삭을 분리하는 것을 가능하게한다. 바로 각 해부하기 전에 갓 코팅 된 커버와 챔버를 조립합니다. 사용되는 미세 유체 챔버이 프로토콜에서 상업적으로 (재료 및 장비의 표 참조) 구입. 핸드 워시와 5-6x까지 다시 상업적으로 구입 한 실.
- 손세탁 1 % Alconox에서 미세 유체 챔버. 30 분마다 밀리-Q 물로 3 회 씻어. 70 % 에탄올에 다시 손 세척 챔버.
- 층류 후드에서 파라 필름에 건조 챔버를 배치. 방출 및 UV 하에서 20 분 동안 챔버의 양측 소독. 쇼핑몰 실온에서 파라 필름으로 밀봉 멸균 15cm 접시에 멸균 챔버.
- 유리 용기에 24 X 40mm 1 위 유리 커버 슬립을 놓습니다. 밤새 회에 35 % 염산 산에서 커버 슬립을 적 십니다. 다음 날, 30 분 물 각각에 대한 커버 슬립을 세 번 헹군다.
- 100 % 에탄올로 각각의 커버 슬립을 침지하고 분젠 버너 위에 불타는하여 커버 슬립을 하나씩 소독. 멸균 페트리 접시에 건조 된 커버를 저장하고 코팅까지 실온에서 보관하십시오.
- OU를 놓는다15cm 배양 접시에 커버 슬립을 t. 코트 0.01 % 폴리-L-라이신 (PLL)의 0.7 ml의 각각과 커버 슬립을 실온에서 배양 후드.
- 1 시간 후, 커버 슬립에게 멸균 수로 3 회 씻어. 6cm의 배양 접시에 진공과 장소 각 coverslip에 건조 된 커버.
- 미세 유체 챔버를 조립하기 위해, 마이크로 그루브를 만지지 않도록주의 PLL 코팅 된 커버 슬립 위에 하단에 마이크로 그루브면이 챔버를 배치합니다. 부드럽게 챔버는 단단히 밀봉 된 보장하기 위해 피펫 팁과 챔버를 눌렀습니다.
챔버에 3의 연결을 문화의 해부 및 플레이트
- 1 % 펜 / 패 혈성 및 10 mM의 HEPES 2 ㎖의 해부 버퍼 (HBSS, 아니 칼슘, 아니 마그네슘을 포함하는 15 ML 원뿔 튜브에 해부 두 E17-E18 쥐의 해마 (뇌의)를 배치합니다. 조직을 5 ㎖로 3 배 씻어 해부 최대한 해부 버퍼를 제거합니다. 때마다 버퍼와 신선한 디의 900 μl를 추가ssection 버퍼입니다.
- , 조직을 소화 1X 작업 농도를 확인하기 위해 해부 버퍼에 10 배 트립신 (2.5 %)의 100 μl를 추가합니다. 37 ° C의 물을 욕조에 원뿔 튜브를 놓습니다. 소화 10 분 후, 1 ㎎ / ㎖의 주위에 최종 농도 10 ㎎ / ㎖의 DNase I의 100 μl를 추가합니다.
- 화재 연마 파스퇴르 유리 피펫을 사용하여 부드럽게 아래로 5-10x 피펫 팅에 의해 조직을 씹다. 오른쪽 분쇄 한 후, (10 % FBS, 2 mM의 GlutaMax, 2 % B27와 Neurobasal) 평판 배지 2 ㎖의 트립신으로 급랭.
- 바닥에 정착하기 위해 조직의 파편을 할 수 있도록 5 분 동안 후드 샘플을 둡니다. 조심스럽게 펠릿 세포 5 분 동안 200 XG에 깨끗한 무균 15 ML 원뿔 튜브와 원심 분리기로 상층 액 2 ㎖를 제거합니다. 50 ㎕의 도금 미디어에서 펠렛을 재현 탁
- 혈구와 세포를 계산합니다. 로드 미세 유체 챔버의 한 구획에 15 ~ 20 ㎕의 세포 현탁액 (~ 40,000 세포). 챔버를 배치배양기에서 10 분 세포가 커버 슬립에 첨부 할 수 있도록합니다. 10 분 후, 챔버의 두 구획을 채우기 위해 더 도금 미디어를 추가 할 수 있습니다.
- 해부의 두 번째 날, 완전히 세포체와 축삭 구획 모두 (2 mM의 GlutaMax, 2 % B27와 Neurobasal) 유지 보수 매체와 도금 미디어를 교체합니다. 해마 신경 세포의 축삭은 3 일에 마이크로 그루브를 건너 일 5-7 사이의 축삭 구획에 도달하기 시작합니다. 이 기간 동안, 보수 신선한 매체 매 24 ~ 48 시간 배양하여 매체의 절반을 대체.
QD-BDNF의 4 축삭 전송
- , QD-BDNF 축삭 수송의 영상을 살고있는 마이크로 유체 챔버의 세포체와 축삭 구획 모두에서 BDNF 고갈에 앞서 철저히하여 2 시간 동안 BDNF-무료, 무 혈청 Neurobasal 매체 매 30 분 간격으로 두 구획을 씻어.
- BDNF 고갈 동안, QD-BDNF 접합체를 준비합니다. 모노 - 바이오틴 BD의 50 nm의 혼합NF의 neurobasal 매체에서 50 nM의 스트렙 타비 딘 - 컨쥬 게이트 QD655와 다이머 및 60 분 동안 얼음 위에서 배양한다.
- 축삭 함에서 용지를 제거하고 37 ° C에서 4 시간 동안 0.25 nm의 최종 농도로 300 ㎕의 QD-BDNF를 추가합니다. 세포체 납부에 QD-BDNF의 확산을 최소화하기 위해, 항상 축삭 구획보다 세포체 함의 매체의 높은 수준을 유지하는 것이 매우 중요하다. 라이브 영상 전에 배양 한 후 언 바운드 QD-BDNF를 씻으십시오.
- 100X 오일 대물 렌즈가 장착 된 거꾸로 현미경을 사용하여 QD-BDNF 수송의 라이브 영상을 수행하십시오. 범위 및 일정한 온도 (37 ° C) 및 CO 2 (5 %)에 부착 된 환경 챔버를 따뜻하게. QD655 신호를 시각화하기 위해 텍사스 레드 여기 / 방출 큐브 집합을 사용합니다.
- 획득 및 CCD 카메라를 사용하여 2 분의 1에 대한 전체 프레임 / 초의 속도로 중간 축삭 내의 저속 이미지를 캡처. 더 축삭과 함께 사용 마이크로 그루브 그쪽으로t는 QD 따라서 침투에 대한 제어와 같은 신호가 없다.
- 어떤 화상 해석 소프트웨어 또는 NIH ImageJ에 BDNF를 사용 수송 분석.
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Representative Results
생산 및 생물 학적 활성 모노 - 바이오틴 BDNF의 정화
AviTag 순서 (GGGLNDIFEAQKIEWHE)와 융합 BDNF의 발현 벡터는 이전에 발행 된 프로토콜 (10)에 따라 작성되었습니다. 전체 길이 융합 단백질의 분자량은 ~ 32 kDa의이 (것으로 예측 하였다 http://ca.expasy.org/tools/pi_tool.html ) 18 kDa의 (도 1a)의 예측 된 분자량을 가진 성숙한 Monobiotinylated BDNF이 생성 된 에어컨 미디어에서 HEK293FT 세포에서 정제 (10)를 설명 된대로.
다른 분획물을 수거하고, 15 % SDS-PAGE에서 분리 하였다. 토끼 항 아비 태그 항체가 18 kDa의 제 1 분획 (도 1b)에서 발견되었다 ~의 분자량 밴드를 사용. 준비의 순도를 테스트하기 위해 샘플을 SDS-PAGE에서 분리하고,의에 의해 염색ilver - 염색. 도 1C에 도시 된 바와 같이 18 kDa의 밴드가 제 용출에서 우세한 종이었다. 스트렙 타비 딘 - 아가 로스 비드는 풀다운 분석 mBtBDNF 제제의 바이오 티 닐화의 정도를 평가하기 위해 수행되었다. 스트렙 타비 딘 - 아가 로스 비드와 풀다운 후, 상청액에 남아있는 단백질 7 % 트리클로로 아세트산 (TCA)로 침전시켰다. 이들 샘플은 SDS-PAGE로 분석하고, 말은 바이오틴 단백질을 검출하는 전체 단백질 또는 스트렙 타비 딘-HRP를 검출하거나 방지 아비 항체 (위쪽)으로 프로빙 하였다. 우리의 결과는 밴드가 뜨는 (그림 1D)에서 검출되지 않았다 동안 모든 신호는 구슬과 관련이 있음을 표시. 따라서 우리는 mBtBDNF가 효율> 99.9 %에서 비오틴 것을 결론 지었다.
바인딩 및 TrkB 수용체 활성화에 mBtBDNF의 생물학적 활성을 테스트하기 위해, 우리는 3T3 세포 rhBDNF (20 NG / ㎖) 중 하나와 TrkB을 표현하는 라인이나 끝까지 마음을 치료ified하게 mBtBDNF 10 분간 (20 ng / mL)로 측정 하였다. 아무런 치료를받지 세포는 대조군으로 수집 하였다. 해물은 4-12% SDS-PAGE에서 분리하고, 토끼 항 pTrkB 항체는 인산화 TrkB를 조사하기 위해 사용되었다. rhBDNF 유사한도 1E에 도시 된 바와 같이, mBtBDNF는 유사한 수준 TrkB의 인산화를 유도 할 수 있었다. 우리는 또한 rhBDNF (20 NG / ㎖) 또는 48 시간 동안 정제 mBtBDNF (20 NG / ㎖) 중 하나와 쥐의 해마 신경 세포를 치료. 정제 mBtBDNF는 rhBDNF (그림 1 층)의 범위 해마 신경 돌기의 파생물을 자극 할 수 있었다. TrkB 수용체와 QD-BDNF의 공동 현지화를 검사하려면 QD-BDNF가 37에서 4 시간 동안 해마의 축삭을 밀고 추가되었습니다 ° C. 뉴런은 고정 및 TrkB에 대한 면역 염색 하였다. 그림 1G에 도시 된 바와 같이, QD-BDNF의 TrkB와 공동으로 현지화. 따라서 우리는 mBtBDNF는 생물학적 기능에 완전히 활성화되어 있음을 결론 지었다.
QD-BDNF 난의 축삭 수송의 라이브 영상N 해마 신경 세포
차 배아 래트 해마 뉴런 (E17-18)는 해부와 미세 유체 챔버의 세포체 구획으로 도금 하였다. 일 4 또는 5에서 축삭 축삭 실에 마이크로 그루브에 걸쳐 연장했다. 일 7에서 대부분의 축삭 축삭 구획으로 성장했다. 1 시간 동안 얼음에 : 1 비율 (BDNF 다이머 QD :) QD-BDNF는 일에 mBtBDNF와 스트렙 타비 딘의 QD655 배양에 의해 만들어졌다. QD-BDNF (0.25 nm의)는 다음 축삭 구획에 추가하고 37 ° C 이전 이미징 (그림 2A)에서 4 시간 동안 배양 하였다.
배양 후, QD-BDNF는 축삭 구획에서 축색 돌기에 특이 적으로 결합하는 것으로 확인되었다. 세포체 구획, QD 신호 근위 축삭 및 QD-BDNF가 축삭에서 내재화 및 역행 세포체로 이송 하였다 나타내는 균체의 대부분에 축적되었다. 축삭 내의 QD-BDNF 신호의 저속 이미지 시리즈는 마이크로 그루브에서 수행 하였다. QD의더 QD 신호 세포체 구획 (도 2B)에 축삭 구획에서 QD 신호를 거의 또는 전혀 확산을 나타내는 축삭의 부재에 마이크로 그루브 볼 수 없다하면서 ignals 축삭과 마이크로 그루브의 대부분에서 관찰되었다.
도 2c에서 해마 신경 세포의 축색 돌기의 80 μm의 긴 부분은 형광 100 초 동안 기록되었다. 6 QD-BDNF 신호의 총 명확하게 동영상을 촬영하는 동안 관찰되었다. 기록 세 QD 신호 세포체 (좌측)을 향해 일방향으로 옮겼다. 흰색 화살표로 표시된 QD 이벤트 (t : 31 초 t에 : 101 초) ~ 70 초에 전체 필드를 건너 세포체에 원활하게 움직였다. (: t 1 초 : t 61 초) 녹색 화살표로 표시된 또 다른 QD 이벤트는 첫째 역행 움직였다. t에서 : 21 초, QD-BDNF은 20 초에 10 anterogradely 이동 한 다음 세포체쪽으로 다시 방향을 바꿨다. 노란색 화살표로 표시된 QD 이벤트 (t : 1 초 t에 : 71 초)도 retrograd 이동 엘리는하지만, 이동중에 20 초 ~ 일시 정지. 이 100 초 동안 이동하지 않은 QD-BDNFs은 고정 된 것으로 간주되었다. 움직이는 물체 만이 나중에 움직이는 속도, 평균 속도를 계산하기 위해 분석하고, 시간은 일시 정지되었다.
QD-BDNF 전송 Kymograph에서 데이터 분석
Kymographs는 MetaMorph로부터 소프트웨어를 사용하여 기록 된 각각의 동영상에서 만들어졌습니다. QD-BDNF 전송 (그림 3A)의 대표 kymographs에 나타낸 바와 같이, QD-BDNF 운동은 축삭의 80 μm의 긴 세그먼트에서 120 초 동안 기록되었다. 대표 kymograph 일에서 QD-BDNF는 아주 짧은 일시 정지 (비디오 S1 지원)와 함께, ~ 60 초에서 필드 (80 μM)을 넘어 왼쪽 (세포체)으로 빠르고 원활하게 움직였다. 대표 kymograph 2, QD-BDNF가 여행하는 동안 ~ 50 μm의 역행 초 이상 일시 정지 적어도 세 부분으로 (화살표로 표시) (120)에 (비디오 S2 지원).
컨텐츠는 ">도 3b는 속도, 평균 이동 속도의 산점도이며 각 단일 QD-BDNF의 시간을 일시 정지. QD-BDNF의 이동 속도의 평균에 0.47-1.97 μM / 초에 이르기까지 상대적으로 빨리 1.06 ± 0.05 μM / 초. QD-BDNF의 평균 속도는 거리 / 시간이 사용될 주행에 다음과 같이 계산 하였다. 그리고 BDNF는 운송 중에 일시 정지하기 때문에, 평균 속도는 0.48 ± 0.03 μM / 초, 평균 이동 속도보다 훨씬 낮았다 (레인 징 0.17-1.59 μM / 초)에서. 일시 정지 시간은 BDNF 운동의 특성으로 분석 하였다. 일시의 평균 지속 기간은 6-33 초에서부터 15.88 ± 1.30 초 () (표 1)이었다.
활성 생물의 1 정화, monobiotinylated BDNF (mBtBDNF)를 그림. (A) 개략도 mBtBDNF의 생산을 도시한다. 사전 proBDNFavi 및 피라 모두 설명 10 pcDNA3.1myc - 자신의 벡터에 클로닝 하였다. 니켈 수지로부터 용출의 (B) 다른 분획을 수집하고 15 % SDS-PAGE 겔상에서 분리 하였다. 토끼 항 아비 태그 항체 블롯에 사용 하였다. ~ 18 kDa의 겉보기 분자량 밴드 mBtBDNF 성숙한 단백질에 대한 예상 분자량과 일치 용출에 인식되었다. (C) 실버 염색 젤은 18 kDa의 mBtBDNF이 용출 분획에서 우점종이었다 보여줍니다. (D) 정화 mBtBDNF은 스트렙 타비 딘 - 아가로 오스 비즈 배양 하였다. 비드를 세척하고 상등액을 SDS-PAGE 분석에 앞서 TCA로 침전시켜, SDS 동안 로딩 완충액 비등 하였다. 얼룩은 어느 안티 아비 항체 또는 HRP-스트렙 타비 딘으로 탐색 할되었다. 정제 또는 mBtBDNF rhBDNF의 (E) 20 NG / ㎖가 3T3 세포주 해당 E에 첨가 하였다10 분 동안 TrkB를 xpresses. 해물은 수확 4~12% SDS-PAGE에서 분리 하였다. 제어 세포 용 해물은 또한 분석 하였다. 오점은 토끼 항 pTrkB 항체로 프로빙 하였다. 전체 TrkB은 마우스 항-TrkB 항체를 사용하여 밝혀졌다. 정제 mBtBDNF 또는 rhBDNF의 (F) 20 NG / ml의 48 시간 동안 해마 신경 세포를 밀고 추가되었습니다. DIC 이미지는 신경 돌기 생성을 분석하기 위해 수행되었다. (G) QD-BDNF는 4 시간 (스케일 바 5 μm의)에 대한 쥐의 해마 신경 세포의 축삭을 배양 하였다. 뉴런은 고정 및 TrkB에 대한 면역 염색 하였다.
. 그림 2 축삭의 QD-BDNF의 역행 수송의 단일 분자 영상 (A) 상위 뷰 : 세포체의 구획에 도금 차 신경 세포와 미세 유체 챔버의 개략도. 축삭은 microg에 걸쳐 성장축삭 구획에 rooves. QD655 표시 BDNF는 축삭 구획에 추가되었습니다. 측면보기 : 축삭 구획 미디어 수준은 QD 신호의 확산을 최소화하기 위해 세포체 실보다 낮게 유지 하였다. (B) 적색 형광 이미지와 세포체 실, 마이크로 그루브와 축삭 구획의 DIC 이미지. QD-BDNF는 축삭 특별히 바인딩 내면화 및 역행 축삭을 따라 세포 기관에 수송. 아니오 QD 신호 축삭의 결석 미세 관찰되지 않았다. (C) 축삭을 따라 QD-BDNF 교통의 시간 경과 영상 시리즈입니다. 모두 이동 및 고정 QD-BDNF 신호는 영화의 대부분에 참석했다. 시간 t에서 1 초, 적어도 4 양자점 볼 수있다. 10 초 후,이 양자점 (녹색과 노란색 화살표로 표시)는 (이미지 왼쪽) 세포체쪽으로 이동하고 있습니다. 이 두 양자점 이동하고 처음 몇 이미지에서 일시 중지하고 결국 (70 초 ~에) 왼쪽에있는 이미지 밖으로 이동합니다. 또 다른 QD 필드로 이동t에서 : 31 초 (흰색 화살표로 표시)과 왼쪽에 훨씬 일시 정지하지 않고 신속하게 움직였다.
그림 3 QD-BDNF 전송 kymograph 및 데이터 분석. (A) 주 해마 신경 세포 QD-BDNF 전송 대표 kymographs. kymo 일에서 밝은 QD는 약간 짧은 일시 정지 상대적으로 빠른 속도로 들판을 가로 질러 이동했다. kymo 2에서는 양자점의 이동 속도가 느렸다 및 이동이보다 더 빈번하고 일시에 중단되었다. 이동 속도 QD-BDNF의 (B) 분산 형 플롯, 그리고 (사용 거리 / 시간 여행으로 계산) 평균 속도는 시간이 일시 중지되었습니다. QD-BDNF의 평균 이동 속도는 0.47-1.97 μm의 / 초에 이르기까지 1.06 ± 0.05 μm의 / 초 (있었다. QD-BDNF의 평균 속도가 0에 이르기까지 ± 0.03 μm의 / 초 (0.48이었다. 17-1.59 μm의 / 초). 일시 정지의 평균 기간 (6-33 초에 이르기까지) 15.88 ± 1.30 초였다.
비디오 S1을 지원 . 대표 QD-BDNF 전송 영상을 몇 차례 QD-BDNF는 매우 짧은 약간의 일시 중지와 왼쪽 (세포체)쪽으로 빠르게 이동합니다.
비디오 S2 지원 . 대표 QD-BDNF 전송 비디오 2 여러 QD-BDNF가 빈번하고 긴 일시 중지와 왼쪽 (세포체)으로 상대적으로 느린 이동합니다.
| 최소 | 최대 | 평균 | 88 픽셀,. "> 표준 오류||
| 이동 속도 (마이크론 / 초) | 0.47 | 1.97 | 1.06 | 0.05 |
| 평균 속도 (미크론 / 초) | 0.17 | 1.59 | 0.48 | 0.03 |
| 일시 중지 시간 (초) | 6 | 33 | 15.88 | 1.30 |
QD-BDNF 수송의 표 1 데이터 분석.
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Discussion
본 연구에서 우리는 생물학적 활성을 생산하는 신규 한 방법의 개발을보고, BDNF의 축삭 수송을 추적하는 데 사용될 수 BDNF (mBtBDNF)를 monobiotinylated. 양자점 스트렙에 단백질 컨쥬 게이트, 및 마이크로 유체 챔버를 사용함으로써, 상기 방법은 하나는 실시간 및 시공간 해상도와 단일 분자 감도 차와 뉴런의 BDNF의 축삭 전송을 검출 할 수있다. 여기에서 사용 된 도구는 건강과 질병에서 신경 세포에서 BDNF / TrkB 신호 엔도 좀의 축삭 수송을 중재 분자 기계를 연구하는 수단을 제공합니다.
BDNF-GFP 또는 -mCherry는 체외에서 다양한 배양 신경 축삭에서 BDNF의 움직임을 추적하는 데 사용되어왔다. 이 시약은 TrkB의 분비 활성화를 검사하는, 가능성, 선행 성 전송을 검사하고 하나의 옵션을 제공합니다. 그러나 WHI의 역행 전송 연구를위한 가장 두드러진 주요 단점이 있습니다채널은 GFP 또는 mCherry가 단일 분자 연구를위한 충분한 밝은 아니라는 것이다. 이전 연구는 NGF의 생리적 농도에 따라, 하나의 NGF 이량 체 (11)를 내면화하고 역행 팔을 수송 것으로 나타났다. 중요한 것은, QD BDNF의 사용은 또한 하나 BDNF는 TrkB 수용체에 결합하는 세포 내 위치를 정의 할 수있다. GFP 또는 mCherry - 태그 단백질을 사용하여, somal 표현은 선행 성을 겪고 단백질의 축삭 내 존재 잘 역행 전송으로 발생합니다. 역행 수송 BDNF가 역행 수송을 위해 수용체 전에 발생 여부 또는 곳에 따라서, 그것은 평가하기 어려울 수있다. 실제로, 투기로, BDNF-GFP 또는 BDNF-mCherry의 축삭 내에서 역행 교통 신경 지배의 대상으로 BDNF의 다음과 같은 바인딩과 다를 수 있습니다 동일한 신경 세포에서 생산.
화학적 가교는 생물학적으로 활성 인 신경 성장 인자 생산을 위해 사용되었지만(NGF)는, 본원에 도입 방법은 우수하다. 첫째, 정확하게 바이오 티 닐화의 범위를 제어하는 것은 어렵다; 예를 들어, 각 NGF는 5-9 비오틴 부분 8,9,12으로 표시했다. 둘째로, 가교 된 단백질을 비활성화 할 수있다. NGF의 경우, 가교는 카르복실기 (13)에 부착을 필요로. BDNF의 경우, 활성은 종종 화학적 가교 결합에 비오틴 다음 손실된다. 마지막으로, 가교의 정도는 불완전 할 수 있습니다. 최근 보고서는 보여 주었다 ~ 0.8 비오틴 / BDNF 분자가 화학적 가교 결합에 의해 제작되었다; 같은 ~ BDNF의 20 %는 9로 표시되지 않았습니다. 비 표지 BDNF의 존재는 결과 해석을 복잡하게 할 수있다.
우리의 기술은 BDNF 분자가 모든 따라서 비오틴 BDNF의 균일 한 준비를 구성, 같은 사이트에 하나의 비오틴으로 표시되는 고유 한 이점을 제공한다. 양자점과 같은 nanofluorescent 입자에 컨쥬 게이트으로 mBtBDNF이 될 수 있습니다축삭뿐만 아니라 세포 기관에서 수상 돌기의 : BDNF가 내면화되는 경로와 과정, 신경 세포 내에서 인신 매매를 추적하는 데 사용됩니다. 이 방법은 BDNF 대체 가능한 태그를 사용한다. 다른 종류의 나노 입자의 개발은 추가적인 장점을 약속한다.
축삭 인신 매매와 BDNF의 신호에 결함이 신경 퇴행성 질환에 연루되어있다. 강력한 증거는 헌팅턴의 질병 (14, 15)의 피질 - 선조체 위축에 BDNF의 결함 교통을 연결하고있다. 돌연변이 Huntingtin 단백질 Huntingtin 관련 단백질 1 (HAP1) 및 교감 신경의 네인 모터 사이의 상호 작용을 방해, BDNF 전송을 억제하고, 신경 영양 지원 및 신경 독성 16-18의 손실이 발생합니다. BDNF의 추적 축삭 운동의 우리의 기술은 신경 퇴행성 질환에서 축삭 기능을 연구하는데 유용한 도구 역할을 할 수 있습니다.
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Disclosures
관심 없음 충돌 선언하지 않습니다.
Acknowledgments
우리는 기술 지원을 왕위 (바오로) 후진타오, 레이첼 Sinit에게 감사의 말씀을 전합니다. 이 연구는 NIH 보조금 (PN2의 EY016525)에 의해 및 다운 증후군 연구 및 치료 재단과 래리 L. Hillblom 재단에서 자금을 지원합니다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Platinum pfx DNA polymerase | Invitrogen | 11708021 | |
| EcoRI | Fermentas | FD0274 | |
| BamHI | Fermentas | FD0054 | |
| HEK293FT cells | Invitrogen | R70007 | |
| DMEM-high glucose media | Mediatech | 10-013-CV | |
| D-biotin | Sigma | B4639 | |
| TurboFect | Fermentas | R0531 | |
| PMSF | Sigma | P7626 | |
| Aprotinin | Sigma | A6279 | |
| Ni-NTA resins | Qiagen | 30250 | |
| Protease inhibitors cocktail | Sigma | S8820 | |
| Silver staining kit | G-Biosciences | 786-30 | |
| Human recombinant BDNF | Genentech | ||
| Microfluidic chambers | Xona | SND450 | |
| 24 x 40 mm No. 1 glass coverslips | VWR | 48393-060 | |
| Poly-L-Lysine | Cultrex | 3438-100-01 | |
| HBSS | Gibco | 14185-052 | |
| DNase I | Roche | 10104159001 | |
| Trypsin | Gibco | 15090-046 | |
| Neurobasal | Gibco | 21103-049 | |
| FBS | Invitrogen | 16000-044 | |
| GlutaMax | Invitrogen | 35050-061 | |
| B27 | Gibco | 17504-044 | |
| QD655-streptavidin conjugates | Invitrogen | Q10121MP | |
| anti-Avi tag antibody | GenScript | A00674 | |
| streptavidin-agarose beads | Life Technology | SA100-04 | |
| Trichloroacetic acid | Sigma | T6399 | |
| HRP-streptavidin | Thermo Scientific | N100 | |
| anti-pTrkB antibody | a generous gift from Dr M. Chao of NYU | ||
| anti-TrkB antibody | BD Science | 610101 |
References
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