Summary

Echtzeit-Bildgebung des axonalen Transport von Quantum Dot-markierten BDNF in primären Neuronen

Published: September 15, 2014
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Summary

Axonalen Transport von BDNF, einem neurotrophen Faktor, ist entscheidend für das Überleben und die Funktion von verschiedenen Neuronenpopulationen. Einige degenerativen Erkrankungen werden durch Störungen des axonalen Struktur und Funktion markiert. Wir haben gezeigt, die Techniken verwendet, um Live-Handel mit QD-BDNF in mikrofluidischen Kammern mit primären Neuronen zu untersuchen.

Abstract

BDNF spielt eine wichtige Rolle in verschiedenen Facetten neuronale Überleben, Differenzierung und Funktion. Strukturelle und funktionelle Defizite der Axone werden zunehmend als eine frühe Funktion von neurodegenerativen Erkrankungen, wie Alzheimer-Krankheit (AD) und Huntington-Krankheit (HD) angesehen. Noch unklar ist der Mechanismus (en), durch die axonale Verletzung induziert wird. Wir berichteten über die Entwicklung einer neuen Technik zur Herstellung von biologisch aktiven, monobiotinylierte BDNF (mBtBDNF), die verwendet werden können, um den axonalen Transport von BDNF verfolgen. Quantenpunkt-markierten BDNF (QD-BDNF) wurde durch Konjugation Quantenpunkt 655 bis mBtBDNF produziert. Eine mikrofluidische Vorrichtung wurde verwendet, um die Axone von Neuronen Zellkörper zu isolieren. Zugabe von QD-BDNF auf die axonalen Fach erlaubt die Live-Darstellung von BDNF Transport in Axonen. Wir zeigten, dass QD-BDNF retrograd bewegt wesentlichen ausschließlich mit wenigen Pausen, bei einer Bewegungsgeschwindigkeit von 1,06 um / s herzustellen. Dieses System kann verwendet werden, um mich zu untersuchennismen der axonalen Funktion gestört in AD oder HD, wie auch andere degenerative Erkrankungen.

Introduction

Neuronen sind stark polarisiert Zellen, deren lange und oft sehr ausgearbeiteten Prozesse sind von grundlegender Bedeutung für den Aufbau und die Aufrechterhaltung der Struktur und Funktion neuronaler Schaltkreise. Das Axon spielt eine wichtige Rolle bei der Durchführung Ladungen zu und von Synapsen. Proteine ​​und Organellen in der Zelle synthetisiert Soma müssen durch Axone transportiert werden, um die präsynaptischen Terminal zu erreichen, um neuronale Funktion unterstützen. Entsprechend empfangenen Signale an distalen Axone müssen transduziert werden und zu der Soma. Diese Verfahren sind für das neuronale Überleben, Differenzierung und Wartung. Dadurch axonalen Transport in manchen Neuronen müssen über Entfernungen mehr als 1000-mal der Durchmesser des Zellkörpers durchgeführt werden, ist die Möglichkeit, ohne weiteres vorstellbar, dass auch kleine Mängel konnten deutlich beeinflussen und neuronalen Schaltungsfunktion.

Brain-derived neurotrophic factor (BDNF), ein Mitglied der Neurotrophin-Familie von Wachstumsfaktoren in mA vorliegtny Hirnregionen, einschließlich Hippocampus, Großhirnrinde und des basalen Vorderhirns. BDNF spielt eine entscheidende Rolle bei der Wahrnehmung und Gedächtnis-Bildung durch Unterstützung des Überlebens, der Differenzierung und der Funktion von Nervenzellen, die in der kognitiven Schaltungen teilzunehmen. BDNF an seinen Rezeptor bindet, der Tyrosinkinase TrkB am Axonendigung wo es aktiviert TrkB-vermittelte Signalwege, einschließlich der Mitogen-aktivierte Proteinkinase / extrazelluläre Signal-regulierte Proteinkinase (MAPK / ERK), Phosphatidylinositol-3-Kinase (PI3K) und Phospholipase C-gamma (PLC & ggr). Die Proteine, die in diesen Signalwegen beteiligt sind, auf endozytischen vesikulären Strukturen verpackt, um das BDNF / TrkB Signal Endosomen 1-6, die dann retrograd in die neuronalen Soma transportiert zu bilden.

Mikrofluidische Kulturkammer ist eine sehr nützliche Plattform für die Untersuchung der Biologie axonalen unter normalen Bedingungen als auch bei der Einstellung von Verletzungen und Krankheits 7,8. Durch die Isolierung Axoneaus den Zellkörpern, hat das Gerät darf man speziell in Transport Axone 8-10 studieren. Die PDMS basiert mikrofluidische Plattformen mit 450 um Mikronut Barrieren in dieser Studie verwendet wurden kommerziell erworben (siehe Materialien Tabelle). BDNF Transport zu untersuchen, entwickelten wir eine neuartige Technologie, um monobiotinylierte BDNF (mBtBDNF) zu erzeugen. Wir nutzten die Biotin-Akzeptor-Peptid, AP (auch als AviTag bekannt). Es ist ein 15-Aminosäuresequenz, die einen Lysinrest, der spezifisch an Biotin durch den Escherichia coli-Enzym-Biotin-Ligase BirA ligiert werden kann, enthält. Fusionierten wir die AviTag an den C-Terminus der Maus pre-proBDNF cDNA durch PCR (Abbildung 1a). Das Konstrukt wurde in den Säuger-Expressionsvektor pcDNA3.1 myc-His-Vektor kloniert. Wir geklont auch die bakterielle DNA in die BirA pcDNA3.1 myc-Vektor sein. Die beiden Plasmide wurden transient in HEK293FT Zellen co-transfiziert, um beide Proteine ​​exprimieren. BirA katalysiert die Ligation von Biotin spezifisch an das Lysin liegen im AviTag am C-Terminus von BDNF in einem Verhältnis 1: 1 bis monobiotinylierte BDNF-Monomers. Biotinylierte, reifen BDNF mit einer Molekularmasse von ~ 18 kDa wurde gewonnen und aus den Medien unter Verwendung von Ni-Harz (1C) gereinigt. Die Biotinylierung von BDNF war vollständig, wie durch die Unfähigkeit beurteilt unmodifizierten BDNF durch Immunoblotting (Figur 1D) zu erfassen. Streptavidin konjugierten Quantenpunkte, QD 655, wurden verwendet, um zu kennzeichnen, um mBtBDNF QD-BDNF zu machen. Die Anwesenheit des AviTag nicht mit der Aktivität von BDNF stören die mBtBDNF konnte phosphorylierten TrkB (1E) zu aktivieren und stimulieren das Neuritenwachstum (1F), um das Ausmaß des rekombinanten menschlichen BDNF (rhBDNF). Immunfärbung gezeigt, dass QD-BDNF kolokalisiert mit TrkB in Hippocampus-Axone, die anzeigt, dass QD-BDNF bioaktiv (1G). Um die BDNF Transport zu untersuchen, wurde QD-BDNF zu distalen Axon Fach hinzugefügtMikrofluidik-Kulturen mit Rattenhippocampusneuronen E18 (2A). QD-BDNF retrograden Transport in Axonen wurde von Echtzeit-Live-Bildgebung des roten Fluoreszenzmarkierung (Trag Videos S1, S2) erfasst. Durch die Analyse der erzeugten kymograph, QD-BDNF beobachtet wurde retrograd mit einer Bewegungsgeschwindigkeit von 1,06 um / s (3A) transportiert werden. GFP oder mCherry-markierten BDNF wurden zur axonalen Bewegung von BDNF zu verfolgen. Die Hauptnachteile sind, dass sie nicht hell genug für Einzelmolekülstudien. Auch die Gegenwart von sowohl anterograden und retrograden BDNF Bewegungen macht es schwierig, zu beurteilen, ob die retrograd transportiert BDNF war in einem Neurotrophin / Rezeptor-Komplex.

In diesem Video zeigen wir die Techniken verwendet, um Live-Handel mit QD-BDNF in mikrofluidischen Kammern mit primären Neuronen zu untersuchen. Die ultrabrightness und ausgezeichnete Photoquantenpunkte makes es möglich, langfristige Verfolgung von BDNF Transport durchzuführen. Diese Techniken können genutzt werden, um Studien der axonalen Funktion in AD, HD, und andere neurodegenerative Erkrankungen zu verbessern.

Protocol

Chirurgische und Tierverfahren werden streng nach dem NIH-Führer für die Pflege und Verwendung von Labortieren durchgeführt. Alle Experimente, die die Verwendung der Tiere werden von UCSD Institutional Animal Care und Use Committee genehmigt. 1. Plasmid Klonierung, Expression und Reinigung von Mono-biotinyliert BDNF (mBtBDNF) HINWEIS: Konstruieren Sie vor-und proBDNFavi BirA cDNA in pcDNA3.1-Vektor und coexprimieren in HEK293FT Zellen 10. Reinigen mBt…

Representative Results

Herstellung und Reinigung von biologisch aktiven Mono-biotinylierten BDNF Der Expressionsvektor der BDNF mit einer AviTag Sequenz (GGGLNDIFEAQKIEWHE) fusioniert wurde nach einem früher veröffentlichten Protokoll 10 erstellt. Die Molekularmasse des vollständigen Fusionsprotein wurde vorhergesagt ~ 32 kDa ( http://ca.expasy.org/tools/pi_tool.html ) monobiotinyliertes reifen BDNF mit einer vorhergesagten Molekü…

Discussion

In dieser Studie wurde die Entwicklung einer neuen Technik berichten wir produzieren biologisch aktiven, monobiotinylierte BDNF (mBtBDNF), die verwendet werden können, um den axonalen Transport von BDNF verfolgen. Durch Konjugieren des Proteins Quantenpunkt Streptavidin, und unter Verwendung eines Mikrofluidkammer ermöglicht das Verfahren eine bis axonalen Transport von BDNF in primären Neuronen mit Einzelmolekülempfindlichkeit, in Echtzeit und mit räumlichen und zeitlichen Auflösung zu erfassen. Die hier verwende…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Wir möchten Yue (Pauline) Hu, Rachel Sinit für ihre technische Unterstützung danken. Die Studie wird von NIH (PN2 EY016525) und durch die Finanzierung von Down-Syndrom-Forschung und Behandlung-Stiftung und der Larry L. Hillblom Stiftung.

Materials

Name Company Catalog Number
Platinum pfx DNA polymerase  Invitrogen 11708021
EcoRI  Fermentas FD0274
BamHI  Fermentas FD0054
HEK293FT cells Invitrogen R70007
DMEM-high glucose media Mediatech 10-013-CV
d-biotin  Sigma B4639
TurboFect  Fermentas R0531
PMSF   Sigma P7626
aprotinin Sigma A6279
Ni-NTA resins Qiagen 30250
protease inhibitors cocktail Sigma  S8820
silver staining kit  G-Biosciences 786-30
human recombinant BDNF Genentech
Microfluidic chambers Xona SND450
24×40 mm No. 1 glass coverslips  VWR 48393-060
poly-L-Lysine  Cultrex 3438-100-01
HBSS Gibco 14185-052
DNase I Roche 10104159001
Trypsin Gibco 15090-046
Neurobasal  Gibco 21103-049
FBS  Invitrogen 16000-044
GlutaMax  Invitrogen 35050-061
B27   Gibco 17504-044
QD655-streptavidin conjugates Invitrogen  Q10121MP
anti-Avi tag antibody GenScript A00674
streptavidin-agarose beads  Life Technology  SA100-04
trichloroacetic acid Sigma T6399
HRP-streptavidin  Thermo Scientific N100
anti-pTrkB antibody a generous gift from Dr M. Chao of NYU
anti-TrkB antibody BD Science 610101

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Zhao, X., Zhou, Y., Weissmiller, A. M., Pearn, M. L., Mobley, W. C., Wu, C. Real-time Imaging of Axonal Transport of Quantum Dot-labeled BDNF in Primary Neurons. J. Vis. Exp. (91), e51899, doi:10.3791/51899 (2014).

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