Summary
Аксонов транспорт BDNF, нейротрофического фактора, имеет решающее значение для выживания и функции нескольких нейронных популяций. Некоторые дегенеративные заболевания отмечены нарушения аксонов структуры и функции. Мы продемонстрировали методы, используемые для изучения живой торговлей QD-BDNF в микрофлюидных камер с использованием первичных нейронов.
Abstract
BDNF играет важную роль в нескольких аспектах выживание нейронов, дифференцировку и функции. Структурные и функциональные дефициты в аксонов все чаще рассматриваются в качестве раннего признака нейродегенеративных заболеваний, включая болезнь Альцгеймера (БА) и болезнь Хантингтона (HD). Пока неясно, является механизм (ы), по которому аксональное повреждение индуцируется. Мы сообщили о разработке нового методического производить биологически активные, monobiotinylated BDNF (mBtBDNF), которые могут быть использованы для отслеживания аксонов транспорт BDNF. Квантовая точка меченных BDNF (QD-BDNF) было произведено сопряжением квантовую точку 655 до mBtBDNF. Микрожидкостных устройство используется для изоляции аксонов от нейрона клеточных тел. Добавление QD-BDNF в аксонов отсеке допускаются Живая съемка BDNF транспорта в аксонов. Мы показали, что КТ-BDNF переехал существу исключительно ретроградно, с очень немногими пауз, по движущейся скорости около 1,06 мкм / сек. Эта система может быть использована для исследования мнеchanisms из разрушенного аксонов функции в AD или HD, а также других дегенеративных заболеваний.
Introduction
Нейроны очень поляризован ячейки, долго и часто весьма подробно процессы являются основой для установления и поддержания структуры и функции нейронных цепей. Аксон играет жизненно важную роль в перевозке грузов в и из синапсов. Белки и органеллы, синтезированные в клетке сомы необходимо транспортировать через аксонов, чтобы достичь пресинаптического терминала для поддержки функции нейронов. Соответственно, сигналы, полученные в дистальных аксоны должны быть трансдуцировали и передал сомы. Эти процессы имеют важное значение для жизнеспособности нейронов, дифференциации и технического обслуживания. В том, что аксонального транспорта в некоторых нейронов должна быть проведена через расстояния более 1000 раз больше диаметра тела клетки, возможность легко Предполагается, что даже незначительный дефицит может заметно повлиять нейронов и схемы функцию.
Головного мозга нейротрофический фактор (BDNF), член нейротрофина семейства факторов роста, присутствует в мАNY области мозга, в том числе гиппокампа, коры головного мозга, и базальных отделах переднего мозга. BDNF играет решающую роль в формировании познания и памяти, поддерживая выживание, дифференциацию и функцию нейронов, которые участвуют в познавательных схем. BDNF связывается со своим рецептором, в тирозин-киназы TrkB, в аксона, где он активирует TrkB-опосредованного пути передачи сигналов, включая митоген активированной протеинкиназы / внеклеточной регулируемой протеинкиназы (МАРК / ERK), фосфатидилинозитол-3-киназы (PI3K) и фосфолипаза С-гамма (PLCγ). Белки, которые участвуют в этих сигнальных путей упакованы на эндоцитотических везикулярного структур для формирования BDNF / TrkB эндосомы 1-6, которые затем ретроградно транспортируется к нейронов сомы сигнализации.
Микрожидкостных культура камера представляет собой очень удобную платформу для изучения аксонов биологию в нормальных условиях, а также при установлении травм и болезней, 7,8. По изолирующих аксоновот клеточных тел, устройство позволило изучить транспорт специально в аксонов 8-10. В основе PDMS микрожидкостных платформы с 450 мкм Microgroove барьеров, используемых в данном исследовании были коммерчески купил (см таблицу материалы). Чтобы изучить BDNF транспорт, мы разработали новую технологию для производства monobiotinylated BDNF (mBtBDNF). Мы воспользовались биотин акцепторной пептида, AP (также известный как AviTag). Это последовательность кислоты в 15 аминокислотных который содержит остаток лизина, которые могут быть специально лигировали с биотином по кишечной палочки фермент, биотин-лигазы, Бира. Мы слиты с AviTag к С-концу мыши предварительно proBDNF кДНК с помощью ПЦР (фиг.1А). Конструкцию клонировали в экспрессирующий вектор млекопитающих, pcDNA3.1 MYC-вектора его. Мы также клонировали бактериальную ДНК Бира в pcDNA3.1 Мус-его вектора. Два плазмиды временно совместно трансфицировали в клетки HEK293FT выразить как белки. Бира катализирует перевязка БиоВ частности, в лизина находятся в пределах AviTag на С-конце ФРГМ в соотношении 1: 1, с получением monobiotinylated BDNF мономера. Биотинилированное, зрелые BDNF с молекулярной массой ~ 18 кДа был восстановлен и очищен от СМИ с использованием Ni-смолу (Рисунок 1в). Биотинилирование BDNF была завершена, о чем судили по невозможности обнаружить без изменений BDNF с помощью иммуноблоттинга (Фигура 1D). Стрептавидином сопряженных квантовых точек, QD 655, были использованы для обозначения mBtBDNF сделать КТ-BDNF. Наличие AviTag не вмешиваться в деятельность BDNF как mBtBDNF смог активировать фосфорилированную TrkB (Рисунок 1E) и стимулировать рост аксонов (Рисунок 1F) в той мере, рекомбинантного человеческого BDNF (rhBDNF). Иммуноокрашивание показали, что КТ-BDNF локализуется с TrkB в гиппокампа аксонов, указывая, что QD-BDNF является биологически активным (Рисунок 1G). Для изучения BDNF транспорта, КТ-ФРГМ был добавлен в дистальном отделе аксоновмикрофлюидных культуры, содержащие крысы E18 нейронов гиппокампа (рисунок 2А). QD-BDNF ретроградного транспорта в аксонов был захвачен в реальном времени живого изображения красной флуоресцентной метки (Поддержка видео S1, S2). Анализируя кимографе сгенерированный, QD-BDNF наблюдалось транспортировать ретроградно по движущейся скорости около 1,06 мкм / сек (Рисунок 3А). GFP или mCherry-меченый BDNF были использованы для отслеживания аксонов движение BDNF. Основные недостатки в том, что они не являются достаточно ярким для единичных исследований молекул. Кроме того, присутствие обоих антероградной и ретроградных движений BDNF делает его трудно оценить, был ли ретроградно транспортируется BDNF в комплексе нейротрофин / рецептор.
В этом видео мы продемонстрируем методы, используемые для изучения живой торговлей QD-BDNF в микрофлюидных камер с использованием первичных нейронов. Ultrabrightness и отлично фотостабильность квантовых точек макES можно выполнять долгосрочное отслеживание BDNF транспорта. Эти методы могут быть использованы для повышения исследования аксонов функции в AD, HD, и других нейродегенеративных расстройств.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Хирургические и животных процедуры проводятся строго в соответствии с Руководством NIH по уходу и использованию лабораторных животных. Все эксперименты, связанные с использованием животных утверждаются UCSD Уходу за животными и использованию комитета.
1 плазмиды Клонирование, экспрессия и очистка Mono-биотинилированного BDNF (mBtBDNF)
ПРИМЕЧАНИЕ: Построить предварительный proBDNFavi и Бира кДНК в pcDNA3.1 вектора и coexpress в HEK293FT ячеек 10. Очищают mBtBDNF использованием бисера Ni-NTA соответствии с ранее опубликованной способа получения зрелой и биологически активный фактор роста monobiotinylated нерва (mBtNGF) 10.
2 Получение микрофлюидных палат
Микрожидкостных нейрон культивирование устройство позволяет гидравлически изолировать аксоны от нейронов клеточных тел. Соберите камеры с покровные недавно покрытых прямо перед каждой вскрытия. Микрожидкостных камеры, используемыев этом протоколе коммерчески купил (см материалы и таблицы оборудования к). Ручная стирка и повторно использованы коммерчески приобретенные камеры до 5-6x.
- Ручная стирка микрофлюидных камеры в 1% Alconox. Промыть три раза Milli-Q воды в течение 30 мин каждый. Руки мыть Камеры снова в 70% этанола.
- Выложите камеры для просушки на парафильмом в ламинарном боксе. Radiate и стерилизовать обе стороны камер в течение 20 мин при УФ. Магазин стерилизуют камеры в стерильной 15-см чашку герметичной парафильмом при комнатной температуре.
- Поместите 24 х 40 мм № 1 покровные стекла в стеклянной таре. Замочите покровные в 35% соляной кислоты в течение ночи на ротатора. На следующий день, промыть покровные три раза в течение 30 мин каждый с водой.
- Стерилизовать покровные один за другим погружением каждый покровное в 100% этанола и пылающий над горелкой Бунзена. Хранить сухие покровные в стерильную чашку Петри и держать его при комнатной температуре до тех пор, покрытие.
- Положите НУт покровные в 15 см блюдо культуры. Шерсть каждого покровное с 0,7 мл 0,01% поли-L-лизин (PLL) и инкубируют в шкафу при комнатной температуре.
- После 1 ч, промыть покровные три раза стерильной водой. Сухие покровные с вакуумом и место каждого покровного в 6 см блюдо культуры.
- Чтобы собрать микрофлюидных камеру, разместить камеру с Microgroove стороне в нижней на покрытые покровным PLL с осторожностью, чтобы не коснуться микродорожек. Осторожно нажатой в камеру с наконечником пипетки, чтобы обеспечить камера плотно закрытыми.
3 Рассечение нейронов культуры и плиты на палат
- Поместите два E17-E18 крысы гиппокампа (один мозга) расчлененные в 15 мл коническую пробирку, содержащую 2 мл рассечение буфера (HBSS, ни кальций, ни магний, с 1% пера / стрептококк и 10 мМ HEPES. Промыть ткани 3x с 5 мл рассечение буфера каждый раз. Удалить буфер рассечение, насколько это возможно, и добавить 900 мкл свежей диssection буфера.
- Чтобы переварить ткани, добавить 100 мкл 10x трипсина (2,5%) в буфер рассечение сделать 1x рабочую концентрацию. Поместите коническую трубку в водяной бане при 37 °. Через 10 мин пищеварения, добавьте 100 мкл 10 мг / мл ДНКазы I до конечной концентрации около 1 мг / мл.
- Использование огневой полировкой Пастер стеклянную пипетку, мягко растирают ткани с помощью пипетки вверх и вниз в 5-10 раз. Сразу после растирания, утолить трипсина с 2 мл обшивки среды (Neurobasal с 10% FBS, 2 мМ Glutamax, 2% B27).
- Оставьте образец в капот в течение 5 мин, чтобы позволить любой мусор тканей поселиться на дно. Тщательно удалить 2 мл надосадочной жидкости в чистую стерильную 15 мл коническую пробирку и центрифугируют при 200 х г в течение 5 мин для осаждения клеток. Ресуспендируют гранул в 50 мкл покрытие СМИ
- Граф клеток с гемоцитометре. Нагрузка 15-20 мкл клеточной суспензии (~ 40000 клеток) в один отсек микрожидкостной камеры. Поместите камерув инкубаторе в течение 10 мин, чтобы позволить клеткам прикрепляться к покровное. Через 10 мин, добавить больше обшивки СМИ пополнить обе отсеков камеры.
- На второй день вскрытия, полностью заменить обшивки сред обслуживания средств массовой информации (Neurobasal 2 мМ Glutamax, 2% B27) как в теле клетки и аксона отсеке. Аксоны от нейронов гиппокампа начинают пересекать микродорожек в день 3 и достичь аксонов отсек между днем 5-7. В течение этого периода времени, вместо половины из культуральной среды с пресной обслуживания средств массовой информации каждые 24 ~ 48 час.
4 аксонов Перевозка QD-BDNF
- До жить визуализации КТ-BDNF аксонов транспорта, истощают BDNF как от тела клетки и аксонов отсеках микрожидкостной камере тщательно промыть оба отсека с BDNF-бесплатно, сыворотки свободных СМИ Neurobasal каждые 30 мин в течение 2 часов.
- Во время истощения BDNF, получения конъюгатов QD-BDNF. Смешайте 50 нМ моно-биотинилированное BDNF димера с 50 нм QD655-стрептавидин конъюгатов в Neurobasal массовой информации и инкубируют на льду в течение 60 мин.
- Удалить носитель в отсеке аксонов и добавить 300 мкл QD-BDNF с конечной концентрацией 0,25 нМ в течение 4 ч при 37 ° С. Чтобы свести к минимуму диффундирующего из КТ-BDNF в тело клетки отсека, это очень важно, чтобы всегда поддерживать высокий уровень массовой информации в теле клетки отсеке, чем в аксона отсеке. Смыть несвязанного QD-BDNF после инкубации до живого изображения.
- Провести Живая съемка QD-BDNF транспорта с помощью инвертированного микроскопа, оснащенного нефти объектива 100X. Разминка сферу и окружающую камеру, прикрепленную к ней до постоянной температуры (37 ° C) и СО 2 (5%). Используйте набор Texas кубов красного возбуждения / эмиссии визуализировать сигнал QD655.
- Приобретать и захватить покадровой изображения в пределах средних аксонов со скоростью 1 кадр / сек в общей сложности 2 мин с использованием ПЗС-камеры. Используйте микродорожек с не аксонов тхат не имеют QD и, следовательно, отсутствие сигнала в качестве контроля для инфильтрации.
- Анализ BDNF транспорт с помощью любого программного обеспечения для анализа изображений или NIH ImageJ.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Получение и очистка биологически активных моно-биотинилированного BDNF
Вектор экспрессии BDNF слиты с последовательностью AviTag (GGGLNDIFEAQKIEWHE) был создан в соответствии с ранее опубликованным протоколом 10. Молекулярная масса белка полной длины гибридного было предсказано, что ~ 32 кДа ( http://ca.expasy.org/tools/pi_tool.html ) Monobiotinylated зрелого BDNF с предсказанной молекулярной массой 18 кДа (фиг.1А) был получен В HEK293FT клеток и очищенный из кондиционированных сред, как описано 10.
Различные фракции собирают и разделяют на 15% SDS-PAGE. Использование кролика против Avi тегов антитело, полосы с молекулярной массой ~ 18 кДа была обнаружена в первой фракции (Фиг.1В). Чтобы проверить чистоту препарата, образцы были разделены на SDS-PAGE и окрашивали сIlver-окрашивание. Как показано на рисунке 1В, 18 кДа был преобладающим видом в первой элюции. Стрептавидин-агарозы раскрывающееся анализы проводили для оценки степени биотинилирования подготовке mBtBDNF. После прот жки с стрептавидин-агарозы, белки, которые оставались в супернатанте осаждают 7% трихлоруксусной кислоты (TCA). Эти образцы были проанализированы с помощью электрофореза в ДСН-ПААГ и блоты зондируют либо анти-антител Avi (сверху) для обнаружения общего белка или HRP-стрептавидин, чтобы обнаружить биотинилированных белков. Наши результаты показали, что все сигналы были связаны с бусами в то время как ни одна группа не была обнаружена в надосадочной жидкости (рисунок 1d). Таким образом, мы заключаем, что mBtBDNF биотинилировали на эффективности> 99,9%.
Чтобы проверить биологическую активность mBtBDNF в связывании и активации TrkB рецептор, мы обрабатывали в клеточной линии 3T3, который выражает TrkB либо rhBDNF (20 нг / мл) или PURманьяков mBtBDNF (20 нг / мл) в течение 10 мин. Клетки, которые не получали лечения были также собраны в качестве контроля. Лизаты были разделены на 4-12% SDS-PAGE и кролика против pTrkB антитела были использованы для исследования фосфорилированный TrkB. Как показано на рисунке 1E, подобно rhBDNF, mBtBDNF был способен индуцировать фосфорилирование TrkB на том же уровне. Мы также рассматриваться нейроны гиппокампа крысы или с rhBDNF (20 нг / мл) или очищенного mBtBDNF (20 нг / мл) в течение 48 часов. Очищенный mBtBDNF был способен стимулировать рост аксонов в гиппокампе в пределах rhBDNF (Рисунок 1F). Чтобы исследовать совместной локализации QD-BDNF с TrkB рецептора, КТ-ФРГМ был добавлен в гиппокампа крысы аксон в течение 4 ч при 37 ° С. Нейроны затем фиксировали и иммуноокрашиванию для TrkB. Как показано на фиг 1G, КТ-ФРГМ со-локализованы с TrkB. Таким образом, мы заключаем, что mBtBDNF полностью активен в своей биологической функции.
Живая съемка аксонов транспорта QD-BDNF Ян нейронов гиппокампа
Первичные эмбриональные нейроны гиппокампа крысы (E17-18) иссекают и помещают в клетки тела отсеке микрожидком камеры. В день 4 или 5, аксоны распространено на микродорожек в аксона отсеке. В 7-й день, большинство аксонов вырос в аксона отсеке. КТ-ФРГМ была сделана путем инкубации стрептавидин QD655 с mBtBDNF в соотношении 1: 1 (QD: ФРГМ димеры) на льду в течение 1 часа. КТ-ФРГМ (0,25 нМ) был затем добавлен в отсеке аксонов и инкубировали в течение 4 ч при 37 ° С до визуализации (Фиг.2А).
После инкубации КТ-ФРГМ было обнаружено, специфически связываться с аксонов в отсеке аксонов. В теле клетки отсека, сигналы QD были накоплены в большинстве проксимальных аксонов и тел клеток, указывающих КТ-ФРГМ была усвоены при аксонов и ретроградно транспортируется в клеточных тел. Покадровый изображений серия сигналов QD-BDNF в аксонов проводились в микродорожек. QD сignals наблюдались в большинстве микродорожек с аксонов в то время как не QD сигнал не может рассматриваться в микродорожек в отсутствующим аксонов, указывая мало или вообще не диффузию сигнала QD от аксона отсека в тело клетки отсека (Рисунок 2B).
На фиг.2С, длиной сегмента 80 мкм аксонов нейронов гиппокампа были записаны на флуоресцентно 100 сек. Всего 6 сигналов QD-BDNF были отчетливо видны во время записи видео. Три QD сигналы, записанные переехал в одном направлении в сторону тела клетки (слева). Мероприятие QD помечены белой стрелкой (т: 31 сек до т: 101 сек) плавно перешла в тело клетки пересечения все поле в ~ 70 сек. Еще одно событие QD помечены зеленой стрелкой (т: 1 сек до т: 61 сек) переехал ретроградно в первую очередь. В т: 21 сек, QD-BDNF переехал anterogradely для 10 до 20 сек, а затем снова изменил направление в сторону тела клетки. Мероприятие QD помечены желтая стрелка (т: 1 сек до т: 71 сек) также переехал Ретроград Ely, но остановился на ~ 20 сек во время движения. QD-BDNFs, которые не были движущиеся в этот 100 сек считались стационарные. Только позже, движущиеся объекты были проанализированы, чтобы вычислить скорость перемещения, среднюю скорость, и время паузы.
Анализ данных в QD-BDNF транспорта кимографе
Kymographs были созданы из каждого фильма, записанного с помощью программного обеспечения Metamorph. Как показано на представительных kymographs в КТ-BDNF транспорта (фигура 3А), КТ-движения BDNF были записаны во время 120 сек в 80 мкм длинного отрезка аксонов. В представительной кимографе 1, QD-BDNF двигались быстро и плавно к левой (тела клетки), пересек поле (80 мкм) в ~ 60 сек, с очень короткими паузами (с поддержкой видео S1). В то время как в представительной кимографе 2, КТ-BDNF путешествовал ~ 50 мкм в 120 сек ретроградно, по крайней мере, трех сегментов длинных пауз (показано стрелками) (с поддержкой видео S2).
Содержание "> 3В является точечный график перемещения скорость, среднюю скорость, и остановился время каждого отдельного QD-BDNF. скорость движения QD-BDNF был относительно быстро, в пределах от 0.47-1.97 мкм / сек с среднем 1,06 ± 0,05 мкм / сек. Средняя скорость QD-BDNF рассчитывали как Путешествия используется расстояние / время. И потому BDNF паузу во время его транспортировки, средняя скорость была намного ниже, чем скорость перемещения с среднем 0,48 ± 0,03 мкм / сек (в пределах от 0.17-1.59 мкм / сек). Пауза времени также анализировали как характеристики движения BDNF. средняя продолжительность паузы был 15,88 ± 1,30 сек (от 6-33 сек) (Таблица 1).
Рисунок 1. Очистка биологическая активная, monobiotinylated BDNF (mBtBDNF). () Схематическое изображение показывает производство mBtBDNF. Как предварительно proBDNFavi и Бира были клонированы в pcDNA3.1myc-его вектора, описанного 10. (B) различных фракций элюируют из смолы Ni-собирают и разделяют на 15% SDS-PAGE гель. Кролика против Avi тег антитела были использованы в блота. Группа с молекулярной массой ~ 18 кДа была признана в элюата, в соответствии с предполагаемой молекулярной массы для белка зрелым mBtBDNF. Окрашивание (C) серебро гель показывает 18 кДа mBtBDNF был преобладающим видом в элюирования фракции. (D) Очищенная mBtBDNF инкубировали со стрептавидин-агарозы. Шарики промывают и варят в SDS буфере для загрузки в то время как супернатант осаждали ТХУ до анализа SDS-PAGE. Блот зондируют либо анти-антителом или Avi с HRP-стрептавидина. Был добавлен (Е) 20 нг / мл очищенного mBtBDNF или rhBDNF к клеточной линии 3T3, что электроннаяxpresses TrkB в течение 10 мин. Лизаты собирали и разделяли на 4-12% SDS-PAGE. Контроль лизат клеток и анализировали. Блот зондируют кролика анти-pTrkB антитела. Всего TrkB было выявлено с помощью мыши анти-TrkB антитела. (F), 20 нг / мл очищенного mBtBDNF или rhBDNF был добавлен в нейроны гиппокампа крысы в течение 48 часов. DIC снимки были сделаны для анализа рост аксонов. (G) QD-BDNF инкубировали с гиппокампа крысы нейронных аксонов в течение 4 часов (масштаб бар 5 мкм). Нейроны затем фиксировали и иммуноокрашиванию для TrkB.
. Рис.2 изображений одной молекулы ретроградной транспортировки QD-BDNF в аксонов () Вид сверху: схематическое изображение микрофлюидного камеры с первичных нейронах посеянных в теле клетки отсеке. Аксоны вырос по мкгrooves минуте аксона отсеке. QD655 помечены BDNF был добавлен в аксона отсека. Вид сбоку: Уровень СМИ в аксона отсеке держали ниже тела клетки отсека, чтобы минимизировать распространение сигнала QD. (B) Красные изображения флуоресценции и DIC образы тела клетки отсеке, микродорожек и аксонов отсеке. QD-BDNF связан специально для аксонов, усвоены, и ретроградно транспортируется в клеточных тел вдоль аксонов. Нет сигнала QD не наблюдалось в микродорожек отсутствующих аксонов. (C) Покадровый видеоизображение серия QD-BDNF транспорта вдоль аксона. Оба подвижных и неподвижных сигналов QD-BDNF присутствовали в большинстве фильмов. В момент Т: 1 сек, по крайней мере, 4 КТ можно увидеть. После 10 сек, два КТ (показаны зеленым и желтыми стрелками) движутся в направлении тела клетки (слева от изображения). Эти два КТ двигаться и паузы в первые пару изображений и со временем переходить из изображений влево (на ~ 70 сек). Еще QD переехал в полев т: 31 сек (указано белой стрелкой) и быстро перемещается без особых пауз слева.
Рисунок 3 QD-BDNF транспорт кимограф и анализ данных. (A) Характерные kymographs из QD-BDNF транспорта в первичных нейронов гиппокампа. В kymo 1, яркий QD перемещался по полю при относительно высокой скоростью лишь несколько коротких пауз. В kymo 2, скорость движения КТ был медленнее, и движение было прервано с необходимостью более длительных пауз. (B) Scatter участок QD-BDNF движется скорость, средняя скорость (рассчитывается как путешествия расстояние / время), и опять замолчал время. Средняя скорость движения по КТ-BDNF был 1,06 ± 0,05 мкм / сек (от 0.47-1.97 мкм / сек. Средняя скорость QD-BDNF был 0,48 ± 0,03 мкм / сек (в диапазоне от 0. 17-1.59 мкм / сек). Средняя продолжительность пауз было 15,88 ± 1,30 сек (от 6-33 сек).
Поддержка видео S1 . Представитель QD-BDNF транспорт видео 1 Несколько QD-BDNF быстро двигаться к левой стороне (тела клетки) с очень немногими короткими паузами.
Поддержка видео S2 . Представитель QD-BDNF транспорт видео 2 Несколько QD-BDNF двигаться относительно медленно к левой стороне (тела клетки) с частыми и долгими паузами.
| Минимальная | Максимальная | Среднее | 88px; ".> Std ошибке||
| Перемещение скорость (мкм / сек) | 0.47 | 1.97 | 1.06 | 0.05 |
| Средняя скорость (мкм / сек) | 0.17 | 1.59 | 0.48 | 0.03 |
| Приостановлена время (сек) | 6 | 33 | 15.88 | 1.30 |
Таблица 1 Анализ данных КТ-BDNF транспорта.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
В этом исследовании, мы сообщают о разработке нового методического производить биологически активные, monobiotinylated BDNF (mBtBDNF), который может использоваться, чтобы отследить аксонов транспорт BDNF. По конъюгации белка в квантовой точки стрептавидином, и с использованием микрожидкостных камеру, метод позволяет обнаружить аксонов транспорт BDNF в первичных нейронов с чувствительностью одной молекулы, в режиме реального времени и с пространственным и временным разрешением. Инструменты, используемые в данном документе являются средством с помощью которого можно изучать молекулярные машины, которые обеспечивают аксонов транспорт BDNF / TrkB сигнализации эндосомах в нейронах в норме и патологии.
BDNF-GFP, или -mCherry были использованы для отслеживания аксонов движение BDNF в различных нейрональных культур в пробирке. Эти реагенты предложить один вариант для рассмотрения антероградной транспорт и, возможно, для изучения аутокринную активацию TrkB. Тем не менее, существуют серьезные недостатки для изучения ретроградного транспорта, наиболее характерные из бееч, что GFP или mCherry не достаточно ярким для единичных исследований молекул. Предшествующие исследования показали, что в физиологических концентрациях NGF, NGF, один димер усвоены 11 и транспортируется ретроградно 8. Важно отметить, что использование КТ BDNF также позволяет определить внутриклеточной локализации, в которой BDNF связывает его TrkB рецепторы. При использовании GFP или mCherry-меченных белков, экспрессия сомной приведет к наличию в аксона белков, проходящих антероградной и также ретроградного транспорта. Как таковой, он может быть трудно оценить, следует ли или там, где встречаются ретроградно транспортируется BDNF его рецептор до ретроградного транспорта. В самом деле, как предположения, ретроградного транспорта в аксонах BDNF-GFP или BDNF-mCherry получают таким же нейрона может отличаться от следующей связывания BDNF в мишени иннервации.
Хотя химический сшивающий был использован для изготовления биологически активный фактор роста нервов(ФРН), причем способ введены в настоящем документе, выше. Прежде всего, трудно точно контролировать степень биотинилирования; Например, каждый NGF метили биотином 5-9 фрагментами 8,9,12. Во-вторых, сшивание может инактивировать белок. В случае NGF, сшивающий необходимость прикрепление к карбоксильных групп 13. В случае BDNF, активность часто теряется следующей химической сшивки с биотином. Наконец, степень сшивания может быть неполным. Недавний отчет показал, что ~ 0,8 биотин / BDNF молекула было произведено химической сшивки; как, например ~ 20% BDNF не была маркирована 9. Наличие немеченым BDNF может осложнить интерпретацию результатов.
Наша методика предлагает уникальные преимущества, что молекулы BDNF все меченные биотином одном в том же месте, что представляет собой однородную Получение биотинилированных BDNF. По конъюгации с nanofluorescent частиц, таких как квантовые точки, mBtBDNF может бытьиспользуется для отслеживания пути и процессы, которые BDNF интернализуется, торговли людьми в нейронах: в дендритов, в аксонов, а также в клеточных тел. Этот метод делает возможным использование альтернативных тегов для BDNF. Развитие других видов наночастиц обещает дополнительные преимущества.
Дефекты в аксонов торговли и передачи сигналов BDNF были вовлечены в нейродегенеративных заболеваний. Убедительные доказательства связал неисправный транспорт BDNF к атрофии коры головного мозга-полосатой при болезни Хантингтона 14,15. Мутантный белок Huntingtin препятствует взаимодействию между Huntingtin-связанного белка-1 (HAP1) и динеина двигателя в симпатических нейронов, ингибирует BDNF транспорт, и приводит к потере нейротрофического поддержки и нейронов токсичности 16-18. Наши методики отслеживания аксонов движения BDNF может служить ценным инструментом для изучения аксонов функцию в нейродегенеративных расстройств.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Нет конфликта интересов объявлены.
Acknowledgments
Мы хотели бы поблагодарить Юэ (Полин) Ху, Рэйчел Sinit для их технической помощи. Работа выполнена при поддержке гранта NIH (PN2 EY016525) и при финансовой синдромом Дауна исследований и лечения фонда и Ларри Л. Hillblom фонда.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Platinum pfx DNA polymerase | Invitrogen | 11708021 | |
| EcoRI | Fermentas | FD0274 | |
| BamHI | Fermentas | FD0054 | |
| HEK293FT cells | Invitrogen | R70007 | |
| DMEM-high glucose media | Mediatech | 10-013-CV | |
| D-biotin | Sigma | B4639 | |
| TurboFect | Fermentas | R0531 | |
| PMSF | Sigma | P7626 | |
| Aprotinin | Sigma | A6279 | |
| Ni-NTA resins | Qiagen | 30250 | |
| Protease inhibitors cocktail | Sigma | S8820 | |
| Silver staining kit | G-Biosciences | 786-30 | |
| Human recombinant BDNF | Genentech | ||
| Microfluidic chambers | Xona | SND450 | |
| 24 x 40 mm No. 1 glass coverslips | VWR | 48393-060 | |
| Poly-L-Lysine | Cultrex | 3438-100-01 | |
| HBSS | Gibco | 14185-052 | |
| DNase I | Roche | 10104159001 | |
| Trypsin | Gibco | 15090-046 | |
| Neurobasal | Gibco | 21103-049 | |
| FBS | Invitrogen | 16000-044 | |
| GlutaMax | Invitrogen | 35050-061 | |
| B27 | Gibco | 17504-044 | |
| QD655-streptavidin conjugates | Invitrogen | Q10121MP | |
| anti-Avi tag antibody | GenScript | A00674 | |
| streptavidin-agarose beads | Life Technology | SA100-04 | |
| Trichloroacetic acid | Sigma | T6399 | |
| HRP-streptavidin | Thermo Scientific | N100 | |
| anti-pTrkB antibody | a generous gift from Dr M. Chao of NYU | ||
| anti-TrkB antibody | BD Science | 610101 |
References
- Wu, C., et al. A functional dynein-microtubule network is required for NGF signaling through the Rap1/MAPK pathway. Traffic. 8, 1503-1520 (2007).
- Wortzel, I., Seger, R. The ERK Cascade: Distinct Functions within Various Subcellular Organelles. Genes & cancer. 2, 195-209 (2011).
- Huang, E. J., Reichardt, L. F. Trk receptors: roles in neuronal signal transduction. Annual review of biochemistry. 72, 609-642 (2003).
- Nonomura, T., et al. Signaling pathways and survival effects of BDNF and NT-3 on cultured cerebellar granule cells. Brain research. Developmental brain research. 97, 42-50 (1996).
- Weissmiller, A. M., Wu, C. Current advances in using neurotrophic factors to treat neurodegenerative disorders. Translational neurodegeneration. 1, 14 (2012).
- Zhang, K., et al. Defective axonal transport of Rab7 GTPase results in dysregulated trophic signaling. The Journal of neuroscience : the official journal of the Society for Neuroscience. 33, 7451-7462 (2013).
- Taylor, A. M., et al. A microfluidic culture platform for CNS axonal injury, regeneration and transport. Nature methods. 2, 599-605 (2005).
- Cui, B., et al. One at a time, live tracking of NGF axonal transport using quantum dots. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 104, 13666-13671 (2007).
- Xie, W., Zhang, K., Cui, B. Functional characterization and axonal transport of quantum dot labeled BDNF. Integrative biology : quantitative biosciences from nano to macro. 4, 953-960 (2012).
- Sung, K., Maloney, M. T., Yang, J., Wu, C. A novel method for producing mono-biotinylated, biologically active neurotrophic factors: an essential reagent for single molecule study of axonal transport. Journal of neuroscience methods. 200, 121-128 (2011).
- Tani, T., et al. Trafficking of a ligand-receptor complex on the growth cones as an essential step for the uptake of nerve growth factor at the distal end of the axon: a single-molecule analysis. The Journal of neuroscience : the official journal of the Society for Neuroscience. 25, 2181-2191 (2005).
- Bronfman, F. C., Tcherpakov, M., Jovin, T. M., Fainzilber, M. Ligand-induced internalization of the p75 neurotrophin receptor: a slow route to the signaling endosome. The Journal of neuroscience : the official journal of the Society for Neuroscience. 23, 3209-3220 (2003).
- Kruttgen, A., Heymach, J. V., Kahle, P. J., Shooter, E. M. The role of the nerve growth factor carboxyl terminus in receptor binding and conformational stability. The Journal of biological chemistry. 272, 29222-29228 (1997).
- Zuccato, C., Cattaneo, E. Brain-derived neurotrophic factor in neurodegenerative diseases. Nature reviews. Neurology. 5, 311-322 (2009).
- Gharami, K., Xie, Y., An, J. J., Tonegawa, S., Xu, B. Brain-derived neurotrophic factor over-expression in the forebrain ameliorates Huntington's disease phenotypes in mice. Journal of neurochemistry. 105, 369-379 (2008).
- Gauthier, L. R., et al. Huntingtin controls neurotrophic support and survival of neurons by enhancing BDNF vesicular transport along microtubules. Cell. 118, 127-138 (2004).
- Her, L. S., Goldstein, L. S. Enhanced sensitivity of striatal neurons to axonal transport defects induced by mutant huntingtin. The Journal of neuroscience : the official journal of the Society for Neuroscience. 28, 13662-13672 (2008).
- Rong, J., et al. Regulation of intracellular trafficking of huntingtin-associated protein-1 is critical for TrkA protein levels and neurite outgrowth. The Journal of neuroscience : the official journal of the Society for Neuroscience. 26, 6019-6030 (2006).
