Summary
BDNF、神経栄養因子の軸索輸送は、いくつかのニューロン集団の生存と機能に重要である。いくつかの変性疾患は、軸索の構造と機能の破壊でマークされています。私たちは、一次ニューロンを用いたマイクロ流体チャンバ内のQD-BDNFのライブ人身売買を検査するために使用される技術を実証した。
Abstract
BDNFは、神経細胞の生存、分化、および機能のいくつかのファセットに重要な役割を果たしている。軸索における構造的および機能的障害は、ますますアルツハイマー病（AD）およびハンチントン病（HD）を含む神経変性疾患の早期の特徴とみなされる。未だ不明な軸索損傷が誘導される機構（単数または複数）である。私たちは、BDNFの軸索輸送を追跡するために使用することができ、BDNF（mBtBDNF）モノビオチン、生物学的に活性な生産する新規な技術の開発を報告した。量子ドットで標識されたBDNF（QD-BDNF）がmBtBDNFに量子ドット655を結合させることにより作製した。マイクロ流体デバイスは、ニューロン細胞体から軸索を単離するために使用した。軸索コンパートメントへのQD-BDNFを添加すると、軸索におけるBDNF輸送のライブイメージングを可能にした。私たちは、QD-BDNFは、約1.06ミクロン/秒の移動速度で、非常に少数のポーズで、逆行本質的に排他的に移動させることを実証した。このシステムは私を調査するために使用することができADまたはHDビデオで破砕軸索機能だけでなく、他の変性疾患のchanisms。
Introduction
ニューロンは、高度が長く、多くの場合、非常に精緻化プロセスの確立及び神経回路の構造および機能を維持するための基本である細胞を分極されている。軸索はシナプスとの間で貨物を運ぶ重要な役割を果たしている。細胞体で合成されたタンパク質および細胞小器官は、神経機能をサポートするために、シナプス前末端に到達するために軸索を通って輸送される必要がある。これに対応して、遠位軸索で受信された信号は、形質導入し、細胞体に搬送する必要がある。これらのプロセスは、ニューロンの生存、分化および維持に必須である。いくつかのニューロンにおけるその軸索輸送が距離を通って1000倍以上細胞体の直径を行わなければならないでは、可能性は容易に小さくても赤字は著しく、神経回路機能に影響を与える可能性があることが想定される。
脳由来神経栄養因子（BDNF）、増殖因子のニューロトロフィンファミリーのメンバーは、ミリアンペアで存在する海馬、大脳皮質、および前脳基底核を含むニューヨークの脳領域、。 BDNFは、認知回路に関与するニューロンの生存、分化、および機能をサポートすることによって、認知および記憶形成において重要な役割を果たしている。 BDNFは、それがマイトジェン活性化プロテインキナーゼ/細胞外シグナル調節プロテインキナーゼ（MAPK / ERK）、ホスファチジルイノシトール3 - キナーゼを含むのTrkB媒介性シグナル伝達経路を活性化する軸索末端に、その受容体、チロシンキナーゼのTrkBに結合する（PI3K）およびホスホリパーゼC-ガンマ（PLCγ）。これらのシグナル伝達経路に関与するタンパク質を、逆行性神経細胞の細胞体に輸送され、エンドソーム1-6シグナリング BDNF / TrkBのを形成するために、エンドサイトーシス小胞構造にパッケージ化されています。
マイクロ流体培養チャンバーは、通常の条件下でだけでなく、怪我や病気7,8の設定で軸索生物学を研究するための非常に便利なプラットフォームです。軸索を分離することにより細胞体から、デバイスは、1つの軸索8-10で特異的に輸送を研究することができました。本研究で用いた450μmでマイクログルーブの障壁とPDMSベースのマイクロ流体プラットフォームは、商業的に（材料の表を参照）から購入した。 BDNF輸送を調べるために、モノビオチン化BDNF（mBtBDNF）を生成するための新規な技術を開発しました。私たちは（またAviTagをとして知られている）のビオチンアクセプターペプチドは、APを利用しました。これは、特に、大腸菌酵素ビオチンリガーゼ、BirAをすることによって、ビオチンに連結することができるリジン残基を含む15アミノ酸配列である。私たちは、PCR（ 図1A）、マウスプレproBDNF cDNAのC末端にAviTagを融合。構築物は、哺乳動物発現ベクター、をpcDNA3.1 mycを、彼のベクターにクローニングした。またをpcDNA3.1のmyc彼のベクターに細菌のBirA DNAをクローン化した。二つのプラスミドを一過両方のタンパク質を発現させるためにHEK293FT細胞に同時トランスフェクトした。 BirAをはビオのライゲーションを触媒するモノビオチン化BDNFモノマーを製造するために：1の比率、特にリジンの1でBDNFのC末端にAviTagを内に存在する。 〜18 kDaの分子量を有するビオチン化、成熟BDNFをNi-樹脂（ 図1C）を用いて培地から回収して精製した。イムノブロッティング（ 図1D）で修正されていないBDNFを検出することができないことによって判断されるようにBDNFのビオチン化は、完了した。ストレプトアビジン共役量子ドット、量子ドット655は、QD-BDNFを作るためにmBtBDNFを標識するために使用された。 mBtBDNFは、リン酸化のTrkB（ 図1E）を活性化し、組換えヒトBDNF（rhBDNF）程度に神経突起伸長（ 図1F）を刺激することができたとしてAviTagをの存在は、BDNFの活性を妨害しませんでした。免疫染色は、QD-BDNFはQD-BDNFは、生物活性（ 図1G）であることを示す、海馬軸索でのTrkBと共局在することが示さ。 BDNF輸送を研究するために、QD-BDNFは、遠位軸索区画に添加したラットE18海馬ニューロン（ 図2A）を含むマイクロ流体文化。軸索内のQD-BDNF逆行性輸送を赤色蛍光タグ（ 支援動画S1、S2）のリアルタイムライブイメージングによって捕獲された。生成されたカイモグラフを分析することによって、QD-BDNFは、約1.06ミクロン/秒（ 図3A）の移動速度で逆行性に輸送されることが観察された。 GFPまたはmCherryをタグ付きBDNFは、BDNFの軸索移動を追跡するために使用されている。主な欠点は、それらが単一分子研究のための十分に明るいではないということです。また、順行性および逆行性BDNFの動きの両方の存在は、それが困難な逆行性輸送BDNFは、ニューロトロフィン/受容体複合体にあったかどうかを評価することができる。
このビデオでは、一次ニューロンを用いたマイクロ流体チャンバ内にQD-BDNFのライブ人身売買を検査するために使用される技術を実証する。 ultrabrightnessと量子ドットのMAKの優れた光安定性エスことが可能BDNF輸送の長期的な追跡を実行する。これらの技術は、AD、HD、および他の神経変性疾患において、軸索機能の研究を強化するために利用することができる。
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Protocol
外科および動物の手順は厳密に実験動物の管理と使用に関するNIHガイドに従って行われる。動物の使用を含む全ての実験は、UCSDの施設内動物管理使用委員会によって承認されています。
1プラスミドのクローニング、モノビオチン化BDNFの発現および精製（mBtBDNF）
注：HEK293FTセル10におけるpcDNA3.1ベクターと共発現に予めproBDNFaviとBirAをするcDNAを構築します。 mBtBDNFは、成熟生物学的に活性モノビオチン神経成長因子（mBtNGF）10を製造する以前に公開された方法に従ってのNi-NTAビーズを用いて精製する。
マイクロ流体チャンバーの調製
マイクロ流体ニューロン培養装置は、流体ニューロン細胞体から軸索を単離することができる。右の各解剖前にコーティングされたばかりカバースリップでチャンバーを組み立てます。使用マイクロ流体室このプロトコルで、商業的に（資機材の表を参照）を購入している。手洗いや5-6xまでの再利用、商業的に購入室。
- 手洗い1％Alconoxマイクロ流体室。 30分ごとにミリQ水で3回すすいでください。手を70％エタノールで再びチャンバを洗浄する。
- 層流フード中でパラフィルム上で乾燥さ室をレイアウト。 UV下で20分間チャンバーの両側を照射し、滅菌する。ストアは、室温でパラフィルムで密封し、滅菌15cmの皿にチャンバを滅菌した。
- ガラス容器に24×40ミリメートル1号カバーガラスを配置します。一晩回転装置に35％の塩酸でカバースリップを浸す。翌日、30分水でそれぞれにカバースリップを3回すすいでください。
- カバースリップを100％エタノールに各カバースリップを浸漬し、ブンゼンバーナーの上に炎によって一枚ずつ滅菌する。無菌ペトリ皿に乾燥カバースリップを保存し、コーティングまで室温で保管してください。
- OUを置き15cmの培養皿にカバースリップはt。コート0.01％ポリ-L-リジン（PLL）0.7mlを各カバースリップとは、室温でフード内でインキュベートする。
- 1時間後、カバースリップを滅菌水で3回リンス。ドライカバーガラス、真空とし、6cmの培養皿に各カバースリップを配置。
- マイクロ流体チャンバーを組み立てるために、マイクログルーブに触れないように注意して、PLLコーティングしたカバーガラス上に下部にマイクログルーブ側でチャンバーを配置。優しく室が密閉されたことを確認するためにピペットチップでチャンバーを押し下げる。
チェンバースでの神経文化、プレートの3解剖
- 1％のペニシリン/ストレプトマイシンおよび10mMのHEPESと2ミリリットル解剖バッファー（HBSS、無カルシウム、ないマグネシウムを含む15ミリリットルコニカルチューブ中で解剖2 E17-E18ラット海馬（1脳）を配置します。組織をすすぎ5mlで3倍解剖できる限り解剖バッファを削除してください。たびにバッファリングし、新鮮なディ900μlのを追加ssectionバッファ。
- 組織を消化するために、1×作業濃度を作るために解剖バッファーに10倍のトリプシン（2.5％）の100μlを添加する。 37℃の水浴中で円錐管を置き。消化の10分後、1 mg / mlの周りの最終濃度に10 mg / mlのDNase Iを100μlのを追加します。
- ファイアーポリッシュパスツールガラスピペットを使用して、静かにピペッティング5〜10倍によって組織を粉砕する。右粉砕後、（10％FBS、2mMのグルタマックス、2％のB27とのNeurobasal）培地めっき2mlのトリプシンをクエンチする。
- 組織のいずれ破片が底に落ち着くことができるように5分間フード内のサンプルのままにしておきます。慎重に細胞をペレットに5分間200×gで清潔な無菌の15ミリリットルコニカルチューブと遠心分離機に上清の2ミリリットルを削除します。 50μlのメッキメディアでペレットを再懸濁
- 血球計算板を用いて細胞を数える。負荷のマイクロ流体チャンバーの1区画への15〜20μlの細胞懸濁液（〜40,000細胞）。チャンバーを配置細胞がカバーグラスに付着することを可能にする10分間インキュベーター中。 10分後、チャンバーの両方の区画を埋めるために、よりメッキメディアを追加。
- 解剖の二日目に、完全に細胞体と軸索コンパートメントの両方で維持培地（2mMのグルタマックス、2％のB27と神経基本）でメッキのメディアを交換してください。海馬ニューロンからの軸索は、3日目に微小溝を渡り、一日5-7間の軸索コンパートメントに到達するために開始します。この期間中、新鮮な維持培地ごとに24〜48時間で培養培地の半分を交換してください。
QD-BDNFの4軸索輸送
- 徹底的に2時間BDNFフリー、無血清神経基本培地で両方の区画ごとに、30分をすすぐことにより、マイクロ流体チャンバーの細胞体と軸索のコンパートメントの両方からのBDNFを枯渇、QD-BDNF軸索輸送のイメージングを生きる前に。
- BDNFの枯渇時には、QD-BDNF結合体を準備します。モノビオチン化BDの50 nMのミックスNFの神経基礎培地中の50 nMのQD655-ストレプトアビジン抱合体と二量体と60分間氷上でインキュベートする。
- 軸索コンパートメントにメディアを取り出し、37℃で4時間、0.25 nMでの最終濃度で300μlのQD-BDNFを追加します。細胞体区画にQD-BDNFの拡散を最小限に抑えるためには、常に軸索区画におけるよりも細胞体コンパートメント内のメディアのより高いレベルを維持することは非常に重要である。ライブイメージングの前インキュベーション後に、結合していないQD-BDNFを洗い流す。
- 100X油対物レンズを備えた倒立顕微鏡を用いてQD-BDNF輸送のライブイメージングを実施する。範囲および一定温度（37℃）とCO 2（5％）、それに取り付けられた環境室を温める。 QD655信号を可視化するためにテキサスレッド励起/発光キューブのセットを使用してください。
- 取得しCCDカメラを用いて2分間、合計1フレーム/秒の速度で中間軸索内のタイムラプス画像を取り込む。股関節のない軸索とマイクログルーブを使用してくださいtは浸潤のコントロールとして何QDので、無信号がありません。
- 任意の画像解析ソフトウェアまたはNIHのImageJを使用して、BDNF輸送を分析します。
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Representative Results
生産と生物学的に活性なモノビオチン化BDNFの精製
AviTagをシーケンス（GGGLNDIFEAQKIEWHE）と融合したBDNFの発現ベクターは、以前に公開されたプロトコル10に従って作成されました。完全長融合タンパク質の分子量は〜32kDaのが（であると予測されたhttp://ca.expasy.org/tools/pi_tool.html ）18 kDaの（ 図1A）の予測分子量を有するモノビオチン化成熟BDNFを製造した馴化培地からHEK293FT細胞および精製された10に記載されるように。
異なる画分を回収し、15％SDS-PAGE上で分離した。ウサギ抗アビタグ抗体を用いて、〜18 kDaの分子量を有するバンドが第一の画分（ 図1B）で検出された。調製物の純度を試験するために、試料をSDS-PAGE上で分離し、sで染色したilver染色。 図1Cに示されるように、18 kDaのバンドは、最初の溶出で優勢種であった。ストレプトアビジン - アガロースビーズプルダウンアッセイをmBtBDNF製剤のビオチン化の程度を評価するために行った。ストレプトアビジン - アガロースビーズを用いてプルダウン後、上清に残ったタンパク質を、7％トリクロロ酢酸（TCA）で沈殿させた。これらの試料をSDS-PAGEによって分析し、ブロットを、ビオチン化タンパク質を検出するために、全タンパク質又はHRP-ストレプトアビジンを検出するために抗アビ抗体（上）のいずれかでプローブした。今回の結果はバンドは上清（ 図1D）で検出されなかったすべての信号がビーズに関連していたことが示され。私たちは、このようにmBtBDNF>が99.9％の効率でビオチン化したと結論付けている。
TrkB受容体に結合し、活性化するmBtBDNFの生物学的活性を試験するために、本発明者らはrhBDNF（20ng / mlの）またはPURのいずれかでのTrkBを発現する3T3細胞株を処理したified mBtBDNF 10分間（20ng / mlの）。治療を受けなかった細胞もまた、対照として採取した。溶解物を4〜12％SDS-PAGE上で分離し、ウサギ抗pTrkB抗体は、リン酸化するTrkBをプローブした。 rhBDNFに類似し、図1Eに示すように、mBtBDNFは、同様のレベルのTrkBのリン酸化を誘導することができた。また、48時間rhBDNF（20ng / mlの）または精製mBtBDNF（20ng / mlの）のいずれかでラット海馬ニューロンを処理した。精製mBtBDNFはrhBDNF（ 図1F）の程度に海馬神経突起伸長を刺激することができました。 TrkB受容体とQD-BDNFの共局在を調べるために、QD-BDNFは37で4時間海馬軸索ラットに追加されました °C。ニューロンは、固定およびTrkBのために免疫染色した。 図1Gに示されるように、QD-BDNFはTrkBのと共局在。私たちは、このようにmBtBDNFがその生物学的機能において完全に活性であると結論付けている。
QD-BDNF、iの軸索輸送のライブイメージングnは海馬ニューロン
初代胚ラット海馬ニューロン（E17-18）を切開し、マイクロ流体チャンバの細胞体コンパートメントに播種した。 4日目または5で、軸索は軸索コンパートメントにマイクログルーブ全体に拡張。 7日目には、ほとんどの軸索は軸索コンパートメントに成長した。 1時間氷上で：1の比率（BDNF二量QD：）QD-BDNFは、1からmBtBDNFとストレプトアビジンQD655をインキュベートすることによって行われた。 QD-BDNF（0.25 nM）を、次いで軸索コンパートメントに添加し、撮像前に37°Cで4時間（ 図2A）インキュベートした。
インキュベーション後、QD-BDNFは、軸索コンパートメント内の軸索に特異的に結合することが見出された。細胞体コンパートメント内に、QD信号は、QD-BDNFが軸索に内在化し、逆行性細胞体に輸送されたことを示す近位軸索および細胞体の大部分に蓄積した。軸索内のQD-BDNFシグナルのタイムラプス画像シリーズはマイクログルーブで実施した。 QD秒全くQD信号が軸索の不在におけるマイクログルーブで見ることができる一方ignalsは細胞体コンパートメント（ 図2B）の軸索区画からQD信号のほとんど又は全く拡散を示し、軸索微小溝のほとんどで観察された。
図2Cでは、海馬ニューロンの軸索の80ミクロン長のセグメントには、蛍光100秒間記録した。 6 QD-BDNFシグナルの合計は明らかに録画中に見られた。記録された三つのQDの信号は、セル本体（左側）に向かって一方向に移動する。白い矢印でラベルされたQDイベント（T：31秒からt：101秒）〜70秒でフィールド全体を横断する細胞体にスムーズに移動。緑色の矢印によって標識され、別のQDイベントは（T：tまで1秒：61秒）は、最初逆行移動しました。 tで：21秒、QD-BDNFは、10〜20秒間、順行に移動した後、細胞体に向かって再び方向を変えた。量子ドット黄色の矢印によって標識されたイベント（T：tまで1秒：71秒）もretrograd移動エリーが、移動中に〜20秒間一時停止しました。この100秒の間に移動していないし、QD-BDNFsは、静止と考えられた。唯一の移動物体は、後で移動速度、平均速度を計算するために分析され、時間が一時停止された。
QD-BDNF交通カイモグラフにおけるデータ解析
KymographsはをMetamorphソフトウェアを使用して記録された各動画から作成された。 QD-BDNF輸送の代表kymographs（ 図3A）に示すように、QD-BDNFの動きは、軸索の80ミクロン長のセグメントに120秒の中に記録された。代表カイモグラフ1では、QD-BDNFは左（細胞体）に向かって、高速かつスムーズに移動させる、非常に短いポーズ（ ビデオS1をサポート ）で、〜60秒のフィールド（80μm）を渡った。代表カイモグラフ2に、QD-BDNFが走行している間〜50μmの逆行秒、長い休止、少なくとも3つのセグメント（矢印）120に（ ビデオS2を支える ）。
コンテンツ"> 図3Bは速度、平均移動速度の散布図であり、各単QD-BDNFの時間を一時停止。QD-BDNFの移動速度が比較的高速であった、平均で0.47-1.97ミクロン/秒の範囲の1.06±0.05μmの/秒（及ぶ。QD-BDNFの平均速度は、使用距離/走行時間として算出した。そして、BDNFは、その搬送中に一時停止しているため、平均速度は0.48±0.03μmで/秒の平均値と移動速度よりもはるかに低かった0.17-1.59ミクロン/秒）から。一時停止時間は、BDNFの動きの特徴として分析した。ポーズの意味持続時間は6-33秒の範囲で15.88±1.30秒（）（ 表1）であった。
生物学的活性物質の図1精製は、BDNF（mBtBDNF）をモノビオチン化 。 （）概略図mBtBDNFの産生を示す。 10は、説明したように、プリproBDNFavi及びBirAの両方がpcDNA3.1myc-Hisベクターにクローニングした。のNi-樹脂からの溶出の（B）の異なる画分を回収し、15％SDS-PAGEゲル上で分離した。ウサギ抗アビタグ抗体をブロットに使用した。 〜18kDaの見かけの分子量を持つバンドが成熟mBtBDNFタンパク質について予測された分子量と一致して、溶出が認められた。 （C）銀染色ゲルは、18 kDaのmBtBDNF溶出画分中の主な種であった示しています。 （D）精製mBtBDNFストレプトアビジン-アガロースビーズと共にインキュベートした。ビーズを洗浄し、上清をSDS-PAGE分析の前にTCAで沈殿させつつ、SDSローディングバッファー中で煮沸した。ブロットをどちら抗アビ抗体またはHRP-ストレプトアビジンでプローブした。精製されたmBtBDNFまたはrhBDNFの（E）20 / mlのは、3T3細胞株その電子に追加されました10分間のTrkBをxpresses。溶解物を回収し、4〜12％SDS-PAGE上で分離した。対照細胞溶解液も分析した。ブロットをウサギ抗pTrkB抗体でプローブした。トータルTrkBのマウス抗TrkB抗体を用いて明らかにした。精製されたmBtBDNFまたはrhBDNFの（F）20ng / mlのは、48時間海馬神経細胞をラットに追加されました。 DIC画像は、神経突起伸長を分析するために採取した。 （G）QD-BDNFで4時間（スケールバーは5μm）のためのラット海馬ニューロンの軸索とインキュベートした。ニューロンは、固定およびTrkBのために免疫染色した。
図2軸索におけるQD-BDNFの逆行性輸送の1分子イメージング（A）は上面図：細胞体コンパートメントに蒔き、一次ニューロンとマイクロ流体チャンバの模式図。軸索はマイクログラムを越え成長した軸索コンパートメントにrooves。 QD655ラベルBDNFは軸索コンパートメントに添加した。サイドビュー：軸索コンパートメント中のメディアレベルは、QD信号の拡散を最小限にするために細胞体コンパートメントよりも低く維持した。 （B）赤色蛍光画像及び細胞体コンパートメント、マイクログルーブ及び軸索コンパートメントのDIC画像である。 QD-BDNFは、軸索に特異的に結合した内在化し、逆行性軸索に沿って細胞体に輸送。いいえQD信号が軸索の不在マイクログルーブは観察されなかった。 （C）軸索に沿ってQD-BDNF輸送のタイムラプスビデオ画像シリーズ。どちらも、移動と固定QD-BDNF信号は、映画のほとんどで存在していた。時刻tにおいて：1秒、少なくとも4つの量子ドットを見ることができる。 10秒後、（緑色と黄色の矢印で示される）は、2つのQDは、（画像の左側）の細胞体に向かって移動される。これら二つのQDは、移動し、最初のカップル像で一時停止し、最終的に（〜70秒で）左に画像の外に移動。もう一つのQDは、フィールド内に移動tで：31秒（白い矢印で示される）、左にずっと一時停止せずにすぐに動いた。
図3 QD-BDNF輸送カイモグラフおよびデータ分析。（A）初代海馬ニューロンにおけるQD-BDNF輸送の代表kymographs。 kymo 1では、明るいQDがわずか数ポーズで比較的速いスピードでフィールドを横切って移動。 kymo 2では、量子ドットの移動速度が遅かったし、運動はより頻繁に、より長い休止で中断されました。 QD-BDNFは（使用距離/走行時間として計算）速度、平均速度を移動する（B）の散布図と時刻を一時停止しました。 QD-BDNFの平均移動速度は0.47-1.97ミクロン/秒の範囲で1.06±0.05μmの/秒（だった。QD-BDNFの平均速度が0に至るまで±0.03μmの/秒（0.48であった。 17から1.59ミクロン/秒）。休止期間は平均（6-33秒の範囲）15.88±1.30秒であった。
ビデオS1をサポート 。代表QD-BDNF輸送の映像1。いくつかのQD-BDNFは、非常に少数の短い休止と左側（細胞体）に向かって高速で移動する。
ビデオS2をサポート 。代表QD-BDNF輸送のビデオ2。いくつかのQD-BDNFは、頻繁に、長い休止と左側（細胞体）に向けて比較的遅い移動します。
| 最低限 | 最大 | 意味する | 88px; "> 標準エラー||
| 移動速度（ミクロン/秒） | 0.47 | 1.97 | 1.06 | 0.05 |
| 平均速度（ミクロン/秒） | 0.17 | 1.59 | 0.48 | 0.03 |
| 一時停止時間（秒） | 6 | 33 | 15.88 | 1.30 |
QD-BDNF輸送の表1データ解析。
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Discussion
本研究では、生物学的に活性な生成するための新しい技術の開発を報告し、BDNFの軸索輸送を追跡するために使用することができ、BDNF（mBtBDNF）がモノビオチン化。量子ドットストレプトアビジンにタンパク質をコンジュゲート、およびマイクロ流体チャンバを使用することにより、この方法は、1つはリアルタイムでかつ空間的及び時間的解像度で、単一分子感度を有する一次ニューロンにおけるBDNFの軸索輸送を検出することを可能にする。ここに使用されるツールは、健康および疾患におけるニューロンにおけるBDNF / TrkBのシグナル伝達エンドソームの軸索輸送を仲介する分子機械を研究する手段を提供する。
BDNF-GFP、または-mCherryは、 インビトロでさまざまな神経細胞培養におけるBDNFの軸索移動を追跡するために使用されている。これらの試薬は、TrkBの自己分泌の活性化を調べるため、場合によっては、順行性輸送を調べ用のオプションを提供しています。しかし、WHIの逆行性輸送を研究するための、最も顕著な主要な欠点がありますchがGFP又はmCherryを、単一の分子研究のための十分に明るいではないということです。以前の研究は、NGFの生理的濃度の下で、単一のNGF二量体は11を内部化し、逆行8に輸送されることを示した。重要なことは、QD BDNFの使用はまた、一つは、BDNFがTrkBの受容体と結合する時に細胞内位置を定義することができます。 GFPまたはmCherryをタグ付きタンパク質を用いて、細胞体の発現は、順行性を受けて、よく逆行性輸送などのタンパク質の軸索内存在になります。このように、逆行性輸送BDNF前逆行性輸送にその受容体が発生したか否か、またはどこで評価することが困難な場合がある。実際、投機として、同じニューロンで生産BDNF-GFPまたはBDNF-mCherryをの軸索内の逆行性輸送は、神経支配のターゲット内のBDNFの結合以下のものと異なる場合があります。
化学的架橋は、生物学的に活性な神経成長因子を製造するために使用されてきたが（NGF）は、本明細書に導入された方法が優れている。まず、正確にビオチン化の程度を制御することは困難である。例えば、各NGFは5-9ビオチン部分8,9,12で標識した。第二に、架橋は、タンパク質を不活性化することができます。 NGFの場合、架橋は、カルボキシル基13への取り付けを必要とした。 BDNFの場合には、活性は、多くの場合、ビオチンに化学架橋下記失われます。最後に、架橋の程度が不完全な場合があります。最近の報告では、〜0.8ビオチン/ BDNF分子は、化学的架橋により生成されたことを示した。のような〜BDNFの20％が9とラベル付けされませんでした。未標識BDNFの存在は、結果の解釈を複雑にする可能性があります。
私たちの技術は、BDNF分子はすべてこのように、ビオチン化BDNFの均質な準備を構成する、同じサイトで単一のビオチンで標識されていることを独自の利点を提供しています。そのような量子ドットとしてnanofluorescent粒子に結合させることによって、mBtBDNFとすることができる軸索ならびに細胞体で、樹状突起：BDNFは内在化され経路やプロセス、神経細胞内の人身売買を追跡するために使用。この方法は、可能なBDNFのための代替のタグを利用する。ナノ粒子の他のタイプの開発はさらなる利点を約束する。
BDNFの軸索輸送およびシグナル伝達における欠陥は、神経変性疾患に関与している。強力な証拠がハンチントン病14,15における皮質-線条体萎縮にBDNFの欠陥の輸送をリンクしています。変異ハンチンチンタンパク質はチンチン関連タンパク質-1（HAP1）および交感神経ニューロンにおけるダイニンモーターの間の相互作用を妨害する、BDNFの輸送を阻害し、神経栄養サポートや神経毒性16-18の損失をもたらす。 BDNFの追跡を軸索運動の私たちの技術は、神経変性疾患における軸索の機能を研究するための貴重なツールとして使用できます。
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Disclosures
利害関係が宣言されていない。
Acknowledgments
私たちは、彼らの技術支援のための越（ポーリン）胡、レイチェルSINITに感謝したいと思います。研究は、NIHの助成金（PN2 EY016525）によって、及びダウン症の研究と治療財団とラリーL. Hillblom財団からの資金によってサポートされています。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Platinum pfx DNA polymerase | Invitrogen | 11708021 | |
| EcoRI | Fermentas | FD0274 | |
| BamHI | Fermentas | FD0054 | |
| HEK293FT cells | Invitrogen | R70007 | |
| DMEM-high glucose media | Mediatech | 10-013-CV | |
| D-biotin | Sigma | B4639 | |
| TurboFect | Fermentas | R0531 | |
| PMSF | Sigma | P7626 | |
| Aprotinin | Sigma | A6279 | |
| Ni-NTA resins | Qiagen | 30250 | |
| Protease inhibitors cocktail | Sigma | S8820 | |
| Silver staining kit | G-Biosciences | 786-30 | |
| Human recombinant BDNF | Genentech | ||
| Microfluidic chambers | Xona | SND450 | |
| 24 x 40 mm No. 1 glass coverslips | VWR | 48393-060 | |
| Poly-L-Lysine | Cultrex | 3438-100-01 | |
| HBSS | Gibco | 14185-052 | |
| DNase I | Roche | 10104159001 | |
| Trypsin | Gibco | 15090-046 | |
| Neurobasal | Gibco | 21103-049 | |
| FBS | Invitrogen | 16000-044 | |
| GlutaMax | Invitrogen | 35050-061 | |
| B27 | Gibco | 17504-044 | |
| QD655-streptavidin conjugates | Invitrogen | Q10121MP | |
| anti-Avi tag antibody | GenScript | A00674 | |
| streptavidin-agarose beads | Life Technology | SA100-04 | |
| Trichloroacetic acid | Sigma | T6399 | |
| HRP-streptavidin | Thermo Scientific | N100 | |
| anti-pTrkB antibody | a generous gift from Dr M. Chao of NYU | ||
| anti-TrkB antibody | BD Science | 610101 |
References
- Wu, C., et al. A functional dynein-microtubule network is required for NGF signaling through the Rap1/MAPK pathway. Traffic. 8, 1503-1520 (2007).
- Wortzel, I., Seger, R. The ERK Cascade: Distinct Functions within Various Subcellular Organelles. Genes & cancer. 2, 195-209 (2011).
- Huang, E. J., Reichardt, L. F. Trk receptors: roles in neuronal signal transduction. Annual review of biochemistry. 72, 609-642 (2003).
- Nonomura, T., et al. Signaling pathways and survival effects of BDNF and NT-3 on cultured cerebellar granule cells. Brain research. Developmental brain research. 97, 42-50 (1996).
- Weissmiller, A. M., Wu, C. Current advances in using neurotrophic factors to treat neurodegenerative disorders. Translational neurodegeneration. 1, 14 (2012).
- Zhang, K., et al. Defective axonal transport of Rab7 GTPase results in dysregulated trophic signaling. The Journal of neuroscience : the official journal of the Society for Neuroscience. 33, 7451-7462 (2013).
- Taylor, A. M., et al. A microfluidic culture platform for CNS axonal injury, regeneration and transport. Nature methods. 2, 599-605 (2005).
- Cui, B., et al. One at a time, live tracking of NGF axonal transport using quantum dots. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 104, 13666-13671 (2007).
- Xie, W., Zhang, K., Cui, B. Functional characterization and axonal transport of quantum dot labeled BDNF. Integrative biology : quantitative biosciences from nano to macro. 4, 953-960 (2012).
- Sung, K., Maloney, M. T., Yang, J., Wu, C. A novel method for producing mono-biotinylated, biologically active neurotrophic factors: an essential reagent for single molecule study of axonal transport. Journal of neuroscience methods. 200, 121-128 (2011).
- Tani, T., et al. Trafficking of a ligand-receptor complex on the growth cones as an essential step for the uptake of nerve growth factor at the distal end of the axon: a single-molecule analysis. The Journal of neuroscience : the official journal of the Society for Neuroscience. 25, 2181-2191 (2005).
- Bronfman, F. C., Tcherpakov, M., Jovin, T. M., Fainzilber, M. Ligand-induced internalization of the p75 neurotrophin receptor: a slow route to the signaling endosome. The Journal of neuroscience : the official journal of the Society for Neuroscience. 23, 3209-3220 (2003).
- Kruttgen, A., Heymach, J. V., Kahle, P. J., Shooter, E. M. The role of the nerve growth factor carboxyl terminus in receptor binding and conformational stability. The Journal of biological chemistry. 272, 29222-29228 (1997).
- Zuccato, C., Cattaneo, E. Brain-derived neurotrophic factor in neurodegenerative diseases. Nature reviews. Neurology. 5, 311-322 (2009).
- Gharami, K., Xie, Y., An, J. J., Tonegawa, S., Xu, B. Brain-derived neurotrophic factor over-expression in the forebrain ameliorates Huntington's disease phenotypes in mice. Journal of neurochemistry. 105, 369-379 (2008).
- Gauthier, L. R., et al. Huntingtin controls neurotrophic support and survival of neurons by enhancing BDNF vesicular transport along microtubules. Cell. 118, 127-138 (2004).
- Her, L. S., Goldstein, L. S. Enhanced sensitivity of striatal neurons to axonal transport defects induced by mutant huntingtin. The Journal of neuroscience : the official journal of the Society for Neuroscience. 28, 13662-13672 (2008).
- Rong, J., et al. Regulation of intracellular trafficking of huntingtin-associated protein-1 is critical for TrkA protein levels and neurite outgrowth. The Journal of neuroscience : the official journal of the Society for Neuroscience. 26, 6019-6030 (2006).
