Real-time Imaging av aksonal Transport av Quantum Dot-merket BDNF i Primær Neuroner

Summary

Aksonal transport av BDNF, en neurotrofisk faktor, er kritisk for overlevelsen og funksjon av flere neuronale populasjoner. Noen degenerative lidelser er preget av forstyrrelser i aksonal struktur og funksjon. Vi demonstrerte teknikker som brukes til å undersøke levende smugling av QD-BDNF i microfluidic kamre med primær nevroner.

Abstract

BDNF spiller en viktig rolle i flere fasetter av neuronal overlevelse, differensiering og funksjon. Strukturelle og funksjonelle underskudd i axoner er i økende grad sett på som et tidlig trekk ved nevrodegenerative sykdommer, inkludert Alzheimers sykdom (AD) og Huntingtons sykdom (HD). Foreløpig uklart er mekanismen (e) der nerveskaden er indusert. Vi har rapportert utvikling av en ny teknikk for å produsere biologisk aktiv, monobiotinylated BDNF (mBtBDNF) som kan brukes til å spore aksonal transport av BDNF. Quantum dot-merket BDNF (QD-BDNF) ble produsert av konjugering quantum dot 655 til mBtBDNF. En mikrofluidenhet ble brukt til å isolere axoner fra neuron cellelegemer. Tilsetting av QD-BDNF til aksonal rommet tillot direkte avbildning av BDNF transport i axoner. Vi viste at QD-BDNF beveges i det vesentlige utelukkende retrogradely, med svært få pauser, med en hastighet på omkring 1,06 mikrometer / sek bevegelse. Dette systemet kan brukes til å undersøke megchanisms av aksonal forstyrret funksjon i AD eller HD, og ​​andre degenerative lidelser.

Introduction

Nerveceller er sterkt polarisert celler der lenge og ofte svært utdypet prosesser er grunnleggende for å etablere og opprettholde struktur og funksjon av nevrale kretser. Axon spiller en viktig rolle i gjennomføringen last til og fra synapser. Proteiner og organeller syntetiseres i cellen soma trenger å bli transportert gjennom axoner å nå den presynaptiske terminalen for å støtte neuronal funksjon. På tilsvarende måte mottas signaler ved distale aksoner må være omformet, og transporteres til soma. Disse prosessene er avgjørende for nevronale overlevelse, differensiering og vedlikehold. I den aksonal transport i enkelte neuroner må gjennomføres gjennom avstander mer enn 1000 ganger diameteren av cellekroppen, er muligheten for lett for seg at selv små underskudd kunne utpreget innvirkning neuronal og kretsfunksjon.

Hjerne-avledet neurotrop faktor (BDNF), et medlem av Neurotrophin familien av vekstfaktorer er til stede i maNY hjerneregioner, inkludert hippocampus, cerebral cortex, og basal forebrain. BDNF spiller en avgjørende rolle i kognisjon og hukommelse formasjon ved å støtte overlevelse, differensiering og funksjon av nerveceller som deltar i kognitive kretser. BDNF binder seg til sin reseptor, tyrosinkinase TrkB ved axon terminal hvor den aktiverer TrkB-mediert signalveier inkludert mitogen aktivert proteinkinase / ekstracellulære signalregulerte proteinkinase (MAPK / ERK), fosfatidylinositol-3-kinase (PI3K) og fosfolipase C-gamma (PLCγ). De proteiner som deltar i disse signalveier er pakket inn endocytiske vesikulær struktur for å danne den BDNF / TrkB signale endosome ^1-6 som deretter retrogradely transporteres til neuronal soma.

Microfluidic kultur kammeret er et svært nyttig plattform for å studere axonal biologi under normale forhold, så vel som i innstillingen av skader og sykdom ^7,8. Ved å isolere axonerfra cellelegemene, har anordningen tillot man studere transport spesifikt i axoner ^8-10. De PDMS baserte microfluidic plattformer med 450 mikrometer microgroove barrierer brukt i denne studien ble kommersielt kjøpt (se Materialer tabell). For å undersøke BDNF transport, har vi utviklet en ny teknologi for å produsere monobiotinylated BDNF (mBtBDNF). Vi tok fordel av biotin akseptor peptid, AP (også kjent som AviTag). Det er en 15 aminosyre-sekvens som inneholder en lysin-rest som kan være spesielt bundet til et biotin av Escherichia coli-enzym biotin ligase, BIRA. Vi smeltet AviTag til C-terminalen av pre-mus proBDNF cDNA ved PCR (figur 1A). Konstruksjonen ble klonet inn i pattedyr-ekspresjonsvektor, pcDNA3.1 myc-His vektor. Vi har også klonet bakteriell Bira DNA inn i pcDNA3.1 myc-sin vektor. De to plasmider ble forbigående ko-transfektert inn i HEK293FT celler til å uttrykke begge proteiner. Bira katalysert ligation av bioti spesifikt til lysin ligge innenfor AviTag ved C-terminus av BDNF på en 1: 1-forhold for å produsere BDNF monobiotinylated monomer. Biotinylert, modne BDNF med en molekylvekt på ~ 18 kDa ble utvunnet og renset fra mediet ved hjelp av Ni-harpiks (figur 1C). Den biotinylering av BDNF var fullstendig, bedømt ved den manglende evne til å detektere umodifisert ved immuno BDNF (figur 1D). Streptavidin konjugerte kvanteprikker, QD 655, ble brukt til å merke mBtBDNF å gjøre QD-BDNF. Tilstedeværelsen av AviTag ikke forstyrrer aktiviteten til BDNF som mBtBDNF var i stand til å aktivere fosforylert TrkB (figur 1E) og stimulere utvekst neurite (figur 1F) i den utstrekning av rekombinant humant BDNF (rhBDNF). Farging vist at QD-BDNF colocalized med TrkB i hippocampus axoner, noe som indikerer at QD-BDNF er bioaktive (figur 1G). Å studere BDNF transport, ble QD-BDNF lagt til distal axon rommetmicrofluidic kulturer inneholder rotte E18 hippocampus nevroner (Figur 2A). QD-BDNF retrograd transport innen axoner ble tatt til fange av real-time levende avbildning av den røde fluorescerende tag (som støtter videoer S1, S2). Ved å analysere kymograph generert, ble QD-BDNF observert å bli transportert retrogradely med en hastighet på omkring 1,06 mikrometer / sek (figur 3A) i bevegelse. GFP eller mCherry-merket BDNF har blitt brukt til å spore aksonal bevegelse av BDNF. De største ulempene er at de er ikke skarpe nok for enkelt molekyl studier. Også tilstedeværelse av både antero og retrograd BDNF bevegelser som gjør det vanskelig å vurdere hvorvidt eller ikke retrogradely transporteres BDNF var i en Neurotrophin / reseptor-komplekset.

I denne videoen viser vi teknikker som brukes til å undersøke levende smugling av QD-BDNF i microfluidic kamre med primær nevroner. Den ultrabrightness og utmerket fotostabilitet av kvanteprikker makes det mulig å utføre langtids sporing av BDNF transport. Disse teknikker kan utnyttes for å forbedre undersøkelser av aksonal funksjon i AD, HD, og ​​andre nevrodegenerative lidelser.

Protocol

Kirurgiske og dyre prosedyrer utføres strengt i henhold til NIH Guide for omsorg og bruk av forsøksdyr. Alle forsøk med bruk av dyr er godkjent av UCSD Institutional Animal Care og bruk komité. 1. Plasmid Cloning, Expression og rensing av Mono-biotinylert BDNF (mBtBDNF) MERK: Konstruer pre-proBDNFavi og Bira cDNA inn pcDNA3.1 vektor og coexpress i HEK293FT celler ti. Rens mBtBDNF ved hjelp av Ni-NTA-perler i henhold til tidligere publiserte fremgangs…

Representative Results

Produksjon og rensing av biologisk aktive Mono-biotinylated BDNF Uttrykket vektor av BDNF smeltet sammen med en AviTag sekvens (GGGLNDIFEAQKIEWHE) ble opprettet i henhold til en tidligere utgitt protokoll 10. Molekylmassen for den fulle lengde fusjonsproteinet ble anslått til å være ~ 32 kDa ( http://ca.expasy.org/tools/pi_tool.html ) Monobiotinylated moden BDNF med en anslått molekylvekt på 18 kDa …

Discussion

I denne studien rapporterer vi utviklingen av en ny teknikk for å produsere biologisk aktive, monobiotinylated BDNF (mBtBDNF) som kan brukes til å spore aksonal transport av BDNF. Ved å konjugere protein til quantum dot streptavidin, og anvendelse av en mikrofluidkammeret, muliggjør fremgangsmåten at en for å detektere aksonal transport av BDNF i primære neuroner med enkelt molekyl følsomhet, i sanntid, og med romlige og tidsmessige oppløsninger. Verktøyene som brukes her gi et middel som å studere molekylær…

Materials

Name	Company	Catalog Number
Platinum pfx DNA polymerase	Invitrogen	11708021
EcoRI	Fermentas	FD0274
BamHI	Fermentas	FD0054
HEK293FT cells	Invitrogen	R70007
DMEM-high glucose media	Mediatech	10-013-CV
d-biotin	Sigma	B4639
TurboFect	Fermentas	R0531
PMSF	Sigma	P7626
aprotinin	Sigma	A6279
Ni-NTA resins	Qiagen	30250
protease inhibitors cocktail	Sigma	S8820
silver staining kit	G-Biosciences	786-30
human recombinant BDNF	Genentech
Microfluidic chambers	Xona	SND450
24×40 mm No. 1 glass coverslips	VWR	48393-060
poly-L-Lysine	Cultrex	3438-100-01
HBSS	Gibco	14185-052
DNase I	Roche	10104159001
Trypsin	Gibco	15090-046
Neurobasal	Gibco	21103-049
FBS	Invitrogen	16000-044
GlutaMax	Invitrogen	35050-061
B27	Gibco	17504-044
QD655-streptavidin conjugates	Invitrogen	Q10121MP
anti-Avi tag antibody	GenScript	A00674
streptavidin-agarose beads	Life Technology	SA100-04
trichloroacetic acid	Sigma	T6399
HRP-streptavidin	Thermo Scientific	N100
anti-pTrkB antibody	a generous gift from Dr M. Chao of NYU
anti-TrkB antibody	BD Science	610101