产生morphant胚胎的方法是必不可少的学习发展机制和基因调控网络。海星Patiria君子兰是这些研究的一个新兴的模型系统。在这里,我们提出了一个协议获得配子,胚胎生产的文化,并从该植物受精卵显微注射迅速。
棘皮动物,长期以来就是繁殖和发展研究的最喜爱的模型系统,以及最近的基因调控和发育过程的演化的研究。海星,Patiria君子兰 ,是获得流行为这些类型的研究而以前进行几乎完全的海胆, 海胆紫石和Lytechinus斑的模型系统。这些模型系统的优点是易于制备改性胚胎中的特定基因或下调,标记细胞的一个群体,或引入报告基因。单一显微注射方法能够创建各种这样的修改胚胎的。在这里,我们提出了一个方法,从体育取得配子君子兰 ,产生受精卵,并经由显微注射引入扰动的试剂。健康morphant胚随后隔离GE的定量和定性研究NE功能。基因组和转录组数据,这个有机体的可用性增加了执行和便于执行它们的研究类型。
海星,Patiria君子兰 ,(俗称蝙蝠星)正在成为一个有趣的和通用的模型系统,适用于各种细胞1-3,4,5发育,进化6-8和生态研究9-11。成人体育君子兰分布以及从锡特卡,阿拉斯加到巴哈加利福尼亚州12太平洋沿岸和海洋水族馆很容易维护。卵母细胞获得全年每一位女性能够摆脱鸡蛋数以万计。卵母细胞容易成熟,受精外部13。由此产生的胚胎是透明的,允许,便于观察;他们同步发展,并且只需要海水的发展。全基因组组装和多个转录,也可用于P。君子兰 ( Echinobase.org )。这些优点使其非常适合各种研究与教学之用。
近年来,P.君子兰已成为发育的基因调控网络模型系统分析14-16。这些研究的目的是确定调节基因的整个称赞,并确定它们之间的相互作用的网络。这项工作的,需要通过引入反义寡核苷酸或体外合成的mRNA扰动的基因表达。此外, 顺式调控分析用于表征调节DNA 15的功能。这些分析需要引入扰动试剂和/或DNA报道构建成胚胎。此外,以表征这些扰动的下游作用,必须测定许多胚胎的变化的潜在靶基因的表达。对于数百受精卵的显微注射技术是核心对这项工作。
棘皮类动物,其中包括体育君子兰 </em>的,需要很多个月才能达到性成熟。因为这一点,所以一般不实用,开发和维护用于实验的转基因株系这些动物。因此,转基因的成年人育种不能有效地创建改性胚胎。相反,扰动必须发生从头通过显微注射。注射提供了一个机会来修改胚胎试剂不属于细胞渗透性。以下协议描述的方法引入DNA,基因,细胞示踪和吗啉反义寡核苷酸为数百个受精卵在一个2-3小时坐通过显微注射。这将产生足够的材料,适用于各种下游实验包括,但不限于,定量PCR, 原位杂交,RNA测序和Western印迹。
但是也有一些困难,这种技术的初学者,但对于成功创建morphant胚胎必不可少的两个关键步骤。首先是选择健康的卵母细胞,将成熟和受精正常。正常发展的一种文化的百分比取决于季节,动物的健康,以及卵母细胞已收获从单一个体的次数。卵母细胞往往是从四月到十月质量更好。仔细看看卵母细胞着手确保广大看起来像图2A,而不是图2B以前是很重要的。但也允许有少…
The authors have nothing to disclose.
这项工作是由美国国家科学基金会的IOS 0844948和1024811的IOS支持
Name of Material/ Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
1-Methyladenine | Acros Organics (Fisher Scientific) | AC20131-1000 | |
190 micron nitex nylon filter | Small Parts (originally Sefar) | CMN-0185-C/5PK-05 | |
100 micron nitex nylon filter | Small Parts (originally Sefar) | CMN-0105-C/5PK-05 | |
Polystyrene Petri Dishes, 60mm x 15mm | Fisher Scientific | FB0875713A | |
Capillary tubing | FHC, Inc | 30-30-0 | For pulling microinjection needles |
Model P-97 Needle Puller | Sutter Instruments | P-97 | |
Dextran, Rhodamine Green | Life Technologies | D7163 | If injecting a GFP expression reporter, it is helpful to substitute Texas Red dextran as an injection tracer |
Instant Ocean Sea Salt | Doctors Foster and Smith | CD-116528 | Also available in many pet stores |
Microloader Tips | Eppendorf | 5242 956.003 |