Een methode voor micro-injectie van<em> Patiria Minata</em> Zygotes
Summary
Methoden die morphant embryo's zijn essentieel voor ontwikkelingsstoornissen mechanismen en gen-regulatorische netwerken te bestuderen. De zee ster Patiria miniata is een opkomende modelsysteem voor deze studies. Hier presenteren we een protocol voor het verkrijgen van gameten, producerende culturen van embryo's, en snelle micro-injectie van zygoten van deze soort.
Abstract
Stekelhuidigen zijn al lang een favoriet model voor studies van voortplanting en ontwikkeling, en meer recent voor de studie van genregulatie en evolutie van ontwikkelingsprocessen. De zee ster, Patiria miniata, is het verkrijgen van de prevalentie als een modelsysteem voor dit soort studies die vroeger bijna uitsluitend werden uitgevoerd in de zee-egels, Strongylocentrotus purpuratus en Lytechinus variegatus. Een voordeel van deze modelsystemen is het gemak van productie gemodificeerde embryo waarin een bepaald gen omhoog of omlaag gereguleerd gegevens voor een groep cellen, of het introduceren van een reportergen. Een enkele microinjectie werkwijze in staat is om een grote verscheidenheid van dergelijke gemodificeerde embryo. Hier presenteren we een werkwijze voor het verkrijgen van gameten P. miniata, produceren zygotes, en de invoering van storende reagentia via micro-injectie. Gezonde morphant embryo's worden vervolgens geïsoleerd voor kwantitatieve en kwalitatieve studies van gene functie. De beschikbaarheid van genoom en transcriptome gegevens voor dit organisme heeft de soorten onderzoeken die zijn uitgevoerd en het gemak van de uitvoering ervan verhoogd.
Introduction
De zee ster, Patiria miniata, (algemeen bekend als de bat-sterren) is in opkomst als een interessant en veelzijdig model voor een verscheidenheid van cellulaire 1 tot 3, ontwikkelingsstoornissen 4,5, evolutionaire 6-8, en ecologisch onderzoek 9- 11. Volwassen P. miniata zijn verdeeld langs de Pacifische kust van Sitka, Alaska naar Baja, Californië 12 en worden gemakkelijk gehandhaafd in zeewateraquaria. Eicellen zijn verkrijgbaar het hele jaar door en elk vrouwtje kan werpen tienduizenden eieren. Eicellen zijn gemakkelijk gerijpt en extern 13 bevrucht. De resulterende embryo's zijn transparant waardoor u gemakkelijk observatie; zij ontwikkelen synchroon en vereisen slechts zeewater voor ontwikkeling. Gehele genoom assemblage en meerdere transcriptomes zijn ook beschikbaar voor P. miniata ( Echinobase.org ). Dergelijke voordelen maken ze ideaal voor een scala van onderzoeken onderwijsdoeleinden.
In de afgelopen jaren, P. miniata is uitgegroeid tot een model voor de ontwikkelingsbiologie genregulerend netwerkanalyses 14-16. Het doel van deze studies is de volledige compliment van regulerende genen en het netwerkadres bepalen van hun interacties. Veel van dit werk betekent storende genexpressie door invoering van antisense oligonucleotiden of in vitro gesynthetiseerd mRNA. Daarnaast zijn cis regulerende analyses gebruikt om de functie van regulatoire DNA 15 karakteriseren. Deze analyses vereisen invoering van verstoring reagentia en / of DNA reporter constructen in embryo. Teneinde voorts de stroomafwaartse effecten van deze verstoringen karakteriseren, moet men vele embryo testen op veranderingen in genexpressie van potentiële doelwitten. Technieken voor micro-injectie van zygoten honderden centraal voor dit werk.
Stekelhuidigen, waaronder P. miniata </em>, vereisen vele maanden tot seksuele rijpheid te bereiken. Hierdoor is het meestal niet praktisch te ontwikkelen en transgene lijnen van deze dieren voor experimenten te handhaven. Daarom fokken van transgene volwassenen kunnen niet efficiënt creëert gewijzigd embryo. In plaats daarvan moet verstoring plaatsvinden de novo door micro-injectie. Micro-injectie biedt de mogelijkheid om embryo's te wijzigen met reagentia die niet cell-permeabel. Het volgende protocol beschrijft een methode om DNA, mRNA, cel tracers en morfolino antisense oligonucleotiden introduceren in honderden bevruchte eieren in een 2-3 uur zitten door middel van micro-injectie. Dit levert voldoende materiaal voor verschillende stroomafwaartse experimenten waaronder, maar niet beperkt tot, qPCR, in situ hybridisatie, RNA-Seq en western blotting.
Protocol
Representative Results
Discussion
Er zijn twee belangrijke stappen die moeilijk zijn voor beginnende gebruikers van deze techniek zijn, maar zijn essentieel voor het succesvol creëren van morphant embryo. De eerste is het selecteren van gezonde eicellen die rijpen en goed bemesten. Het percentage normale ontwikkeling in een cultuur afhankelijk van het seizoen, de gezondheid van de dieren en het aantal keren dat de eicellen van een enkel individu geoogst. Eicellen meestal van betere kwaliteit van april tot en met oktober te zijn. Het is van belang te le…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Dit werk werd ondersteund door de National Science Foundation IOS 0844948 en IOS 1024811
Materials
| Name of Material/ Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
| 1-Methyladenine | Acros Organics (Fisher Scientific) | AC20131-1000 | |
| 190 micron nitex nylon filter | Small Parts (originally Sefar) | CMN-0185-C/5PK-05 | |
| 100 micron nitex nylon filter | Small Parts (originally Sefar) | CMN-0105-C/5PK-05 | |
| Polystyrene Petri Dishes, 60mm x 15mm | Fisher Scientific | FB0875713A | |
| Capillary tubing | FHC, Inc | 30-30-0 | For pulling microinjection needles |
| Model P-97 Needle Puller | Sutter Instruments | P-97 | |
| Dextran, Rhodamine Green | Life Technologies | D7163 | If injecting a GFP expression reporter, it is helpful to substitute Texas Red dextran as an injection tracer |
| Instant Ocean Sea Salt | Doctors Foster and Smith | CD-116528 | Also available in many pet stores |
| Microloader Tips | Eppendorf | 5242 956.003 |
References
- Terasaki, M. Quantification of fluorescence in thick specimens, with an application to cyclin B-GFP expression in starfish oocytes. Biol. Cell Auspices Eur. Cell Biol. Organ. 98, 245-252 (2006).
- Terasaki, M., Runft, L. Two-stage dependence for 1-methyladenine induced reinitiation of meiotic maturation in starfish oocytes. Exp. Cell Res. 316, 2654-2663 (2010).
- O’Neill, F. J., Gillett, J., Foltz, K. R. Distinct roles for multiple Src family kinases at fertilization. J. Cell Sci. 117, 6227-6238 (2004).
- McCauley, B. S., Akyar, E., Filliger, L., Hinman, V. F. Expression of wnt and frizzled genes during early sea star development. Gene Expr. Patterns GEP. 13, 437-444 (2013).
- Yankura, K. A., Koechlein, C. S., Cryan, A. F., Cheatle, A., Hinman, V. F. Gene regulatory network for neurogenesis in a sea star embryo connects broad neural specification and localized patterning. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 110, 8591-8596 (2013).
- McCauley, B. S., Wright, E. P., Exner, C., Kitazawa, C., Hinman, V. F. Development of an embryonic skeletogenic mesenchyme lineage in a sea cucumber reveals the trajectory of change for the evolution of novel structures in echinoderms. EvoDevo. 3, 17 (2012).
- Annunziata, R., Martinez, P., Arnone, M. I. Intact cluster and chordate-like expression of ParaHox genes in a sea star. BMC Biol. 11, 68 (2013).
- Morino, Y., et al. Heterochronic activation of VEGF signaling and the evolution of the skeleton in echinoderm pluteus larvae. Evol. Dev. 14, 428-436 (2012).
- Hart, M. W. Structure and evolution of the sea star egg receptor for sperm bindin. Mol. Ecol. 22, 2143-2156 (2013).
- McGovern, T. M., Keever, C. C., Saski, C. A., Hart, M. W., Marko, P. B. Divergence genetics analysis reveals historical population genetic processes leading to contrasting phylogeographic patterns in co-distributed species. Mol. Ecol. 19, 5043-5060 (2010).
- Keever, C. C., et al. Discordant distribution of populations and genetic variation in a sea star with high dispersal potential. Evol. Int. J. Org. Evol. 63, 3214-3227 (2009).
- Lambert, P. . Sea Stars of British Columbia, Southeast Alaska, and Puget Sound. , (2000).
- Dorée, M., Guerrier, P., Leonard, N. J. Hormonal control of meiosis: specificity of the 1-methyladenine receptors in starfish oocytes. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 73, 1669-1673 (1976).
- Hinman, V. F., Nguyen, A. T., Cameron, R. A., Davidson, E. H. Developmental gene regulatory network architecture across 500 million years of echinoderm evolution. Proc. Natl. Acad. Sci. 100, 13356-13361 (2003).
- Hinman, V. F., Nguyen, A., Davidson, E. H. Caught in the evolutionary act: precise cis-regulatory basis of difference in the organization of gene networks of sea stars and sea urchins. Dev. Biol. 312, 584-595 (2007).
- McCauley, B. S., Weideman, E. P., Hinman, V. F. A conserved gene regulatory network subcircuit drives different developmental fates in the vegetal pole of highly divergent echinoderm embryos. Dev. Biol. 340, 200-208 (2010).
- Wessel, G. M., Voronina, E., Brooks, J. M. Obtaining and handling echinoderm oocytes. Methods Cell Biol. 74, 87-114 (2004).
- Sweet, H., et al. Blastomere isolation and transplantation. Methods Cell Biol. 74, 243-271 (2004).
- Cheers, M. S., Ettensohn, C. A. Rapid microinjection of fertilized eggs. Methods Cell Biol. 74, 287-310 (2004).
- Core, A. B., Reyna, A. E., Conaway, E. A., Bradham, C. A. Pantropic retroviruses as a transduction tool for sea urchin embryos. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 109, 5334-5339 (2012).
